全 文 ：光 、氮和半连续培养更新率对微绿球藻生长与采收量的影响
朱艺峰 ,林　霞 ,徐同成 ,虞小花 ,高成勉 ,张仕坚
(宁波大学 生命科学与生物工程学院 , 浙江 宁波 315211)
摘要:对水产养殖中的主要饵料微绿球藻(Nannochloropsis oculata (Droop)Hibberd)进行了 5×3×2 析因试验 , 培养液
NO -3 -N 水平分别设置为 0 、3 、6 、12、24 mg/ L ,光照强度分别为 22.9 μmol/(m2·s)、43.2 μmol/(m2·s)、80.4 μmol/(m2·
s),更新率分别为 10%和 25%,研究了光 、氮和半连续培养更新率对微绿球藻生长 、采收量的影响。协方差分析结果显
示 , NO-3 -N 水平 、光照强度 、更新率及其交互作用对细胞密度 、生长率和采收量的影响均存在显著差异(P <0.001),以
更新率影响最大 , 其次是光照强度 ,影响最弱为 NO-3 -N 水平。更新率 25%时 , 平均细胞密度(753.2×104/m L)显著低
于 10%更新率下的细胞密度(1 737.5×104/m L), 但平均生长率和采收量都显著高于更新率 10%时的生长率和采收量 ,
分别为 0.349/ d 和 4.69×108/ d。在光照强度 22.9μmol/(m2·s)下 , 细胞密度 、生长率和采收量都显著低于其他组 , 其最
大值均在 80.4μmol/(m2·s)光照强度组 , 该组细胞密度 、生长率和采收量分别为 1 721.1×104/ mL、0.283/ d 和 6.51/ ×
108/ d。在不同 NO-3 -N 水平处理下 ,不添加 NO-3 -N时的细胞密度 、生长率和采收量都最低 , 3 mg/ L 时次之 , 6 mg/ L
以上组(包括 6 mg/ L 组)最高。研究结果还表明 , 更新率增加时 ,不仅光衰减变小 ,生长率随之变大 , 而且培养液中 NO -3
-N 浓度也随之增加 ,从而促进了光 、氮间的平衡利用 , 使采收量相应增加;但更新率增加细胞密度下降。显然 , 更新率
是影响采收量的最主要因素 , 且存在一个最适更新率使采收量最大 , 这些结果对微藻半连续培养的合理更新与科学施肥
有一定的应用价值。
关键词:微绿球藻;半连续培养;更新率;光照强度;氮;生长;采收量
中图分类号:Q949.2　　文献标识码:A　　文章编号:1005-8737-(2004)02-0159-07
收稿日期:2003-10-23;　修订日期:2003-12-11.
基金项目:宁波市科技局资助项目(01N40100-58);浙江省教育厅资助项目(20010233).
作者简介:朱艺峰(1964-), 男 ,副教授 , 研究方向为营养与生态学.E-mail:yfzhu@163.com
　　微绿球藻(Nannochloropsis oculata (Droop)
Hibberd)富含 EPA ,是贝类育苗中主要饵料之一 ,也
是鱼类开口饵料 ———轮虫的优良营养强化饵料[ 1] 。
由于该藻生长速度较快 ,在实际生产中经常采用半
连续培养的方式 ,但目前生产中 ,无论每日更新率为
多少 、光照强度高低为何 ,大多数生产者仍采用与
f/2培养基相似的营养盐浓度进行培养 。由于大水
泥池培养时的生长率比三角烧瓶或光生物反应器中
培养时的生长率要低得多[ 2] ,同时培养时间也相对
较短 ,因此 ,仍采用相应 f/2培养基的N 浓度会导致
大量 N 不能被藻类及时利用 ,从而增加了 N 开支 ,
同时也把大量的 N 通过换水排到临近的海区 ,对海
洋造成污染 。本研究从水产养殖的应用角度着手 ,
探讨了光 、氮和半连续培养更新率对微绿球藻生长 、
采收量的影响 ,旨为藻类的动态施肥和生态施肥提
供基础资料。
1　材料与方法
1.1　材料
微绿球藻由全国科技兴海技术转移宁波中心提
供(编号 QW)。实验海水经脱脂棉过滤 ,煮沸消毒。
盐度 21.3 ,pH 7.8 , NO-3 -N 0.55 mg/L ,NO-2 -N
0.01 mg/L ,NH+4 -N 0.04 mg/L。
1.2　方法
1.2.1　实验设计　对 NO-3 -N 水平(N)、光照强
度(L)、更新率(R)3 个因素采用 5×3×2析因试
验[ 3] 。NO-3 -N水平(称量换算值)分别设置为 0 、
3 、6 、12 、24 mg/L ,表面光照强度分别为(22.9±2)
μmol/(m2·s)、(43.2±2)μmol/(m2·s)、(80.4±2)
μmol/(m2·s),更新率分别为 10%和 25%[ 4-5] 。
1.2.2　更新培养液配制　按实验处理分别配制不
同 NO-3 -N 浓度的更新营养盐 。培养液中其他成
第 1 1卷 第 2 期
2 0 0 4 年 3 月
中 国 水 产 科 学
Journal of Fishery Sciences of China
Vol.11 　No.2
March 　 2 0 0 4
份按 f/2 培养基(不加生物素和硅酸钠), 含量相
同[ 6] 。更新营养盐每天配制 1次 ,每次称量(天平感
量0.1 mg)所引起 NO-3 -N 浓度误差<0.05 mg/
L。
1.2.3　接种培养　微绿球藻经预培养(宁波大学
MAV 3
# ,原子比 N∶P =13.9∶2.3)至指数生长期
后 ,离心 、过滤 ,再稳定培养 2 d ,取上层藻液做更新
实验 。用 300 mL 三角烧瓶(培养体积 V =250 mL)
为培养容器 ,加入相应的培养液和藻液(稀释法),以
达到不同处理要求 ,每处理设 3个重复 。水温(25±
2)℃,日光灯光源 ,光暗周期 12 h∶12 h ,启动更新时
各处理组的平均细胞密度为(1 082.4±20.6)×104
/mL 。
1.2.4　细胞密度测定　每日定时更新并从更新液
中取样 ,用 721型分光光度计 ,以消毒海水为参比
液 ,测定波长 706 nm ,测定更新前藻吸光度值(光程
1 cm),每瓶测定 1次 , 3个重复取平均。更新后藻
细胞密度按更新前藻细胞密度(B)及更新率折算 。
藻细胞密度(C)与吸光度值(A)转换公式经实测细
胞密度并拟合获得(C =12 349.8A0.976 , n =29 ,
R 2=0.997 , P <0.001)。日采收量(Y)按 Y =V·
R·B 计算 。生长率[ 7] K =lnN t -1nN 0
t ln2
,式中:N t
为最终细胞密度 , N0 为初始细胞密度 , t 为培养时
间(本研究计算时 t =1 d)。记实验开始日为第 1
天 ,共进行 25 d。
1.2.5　统计分析　统计分析在 SAS 软件包(Ver.
6.12)下进行[ 8] 。由于不同处理组稀释法所得的初
始接种细胞密度间存在显著差异(Kruskal-Wallis
检验 , χ2=74.121 ,d f =29 , P<0.001),故采用 5×
3×2协方差分析以校正结果均值(PROC GLM),各
均值比较经最小误差平方法测试(LSMEANS),显
著性水平 a =0.05。采收量回归方程采用趋势面分
析(PROC GLM),再按回归系数显著性反复筛选回
归变量(筛选变量概率阀值 P =0.15);回归方程非
线性规划寻优计算采用 SAS/OR模块(PROC NLP ,
NRR牛顿法)[ 9] 。结果数值为平均值±标准误差。
2　结果与分析
2.1　不同处理下的细胞密度变化
经 25 d更新 ,微绿球藻随不同处理的细胞密度
变化见图 1。从直观上看 ,在更新率 10%下(图 1a ,
c , e)的平均细胞密度高于 25%下(图 1b , d , f)的细
胞密度 ,随着光照强度的增强 ,细胞密度也呈上升态
势 ,但不同 NO-3 -N水平的差异较明显 ,0 mg/L 水
平低于其他 NO-3 -N 水平下的细胞密度 。
表 1　不同处理下细胞密度 、生长率与采收量的均值比较
Table 1　Multiple mean comparisons of dif ferent treatments for cell densities , growth rates and recovery yields
X ±SD
项目
Item
更新率
Renew al rate
10% 25%
光照强度/(μmol·(m 2·s)-1)＊
Light intensity
L1 L2 L3
氮水平/(mg·L -1)
Nit rogen level
0 3 6 12 24
细胞密度/(104·mL-1)
Cell densi ty
1737.5
±14.7a
753.2
±14.7b
750.5
±20.2c
1264.5
±19.5b
1721.1
±27.1a
945.9
±21.8c
1219.9
±21.6b
1343.2
±23.3 a
1365.7
±21.7a
1352.1
±22.1a
生长率/(d-1)
Grow th rate
0.178
±0.006b
0.349
±0.006a
0.231
±0.008b
0.277
±0.008a
0.283
±0.011a
0.182
±0.009b
0.268
±0.009a
0.287
±0.010a
0.293
±0.009a
0.289
±0.009a
采收量/(108·d-1)
Recovery yield
4.32
±0.07b
4.69
±0.07a
2.57
±0.10c
4.44
±0.10b
6.51
±0.13a
3.24
±0.10c
4.51
±0.10b
4.90
±0.11 a
4.98
±0.10a
4.91
±0.10a
注:1)各行相同因素不同上标 a、b 、c代表差异显著(GLM , 协方差分析 , P<0.05).2)L1、L2 、L3 分别为光强 22.9μmol/(m2·s)、43.2μmol/
(m2·s)、80.4μmol/(m2·s)组.
Note:1)In each factor of the same row , means with dif ferent let ters in the superscript are significantly dif ferent(GLM , ANCOVA , P<0.05).2)
L1 、L2 、L3 are groups with ligh t intensit ies of 22.9μmol/(m2·s), 43.2μmol/(m2·s)and 80.4μmol/(m2·s), respectively.
　　协方差分析显示 , NO-3 -N 水平(N)、光照强
度(L)、更新率(R)、N ×L 、N ×R 、R ×L 、R ×N
×L 对细胞密度的影响均存在显著差异(G LM AN-
COVA分析 , P <0.001 , R2 =0.988 , n =90 , F =
167.6)。更新率 、光照强度及 NO-3 -N不同水平对
细胞密度结果的均值比较见表 1。明显地 ,更新率
10%时的日平均细胞密度(1 737.5×104/mL)比起
始接种细胞密度(1 082.4×104/mL)高 ,即细胞密
160 中 国 水 产 科 学 第 11 卷
度随着 10%的更新而增加(图 1a , c , e);但在 25%更
新率下 ,细胞密度除光照强度 80.4 μmol/(m2·s)外
随着更新而减少(图 1b , d , f),其总平均细胞密度为
753.2×104/mL ,且显著低于更新率为 10%时的日
平均细胞密度。不同光照强度对细胞密度的影响都
存在显著差异 ,其中光照强度高于 22.9 μmol/(m2·
s)组时的细胞密度都比起始接种细胞密度高 ,而在
22.9μmol/(m2·s)光照强度下低于起始接种细胞密
度 。不同 NO-3 -N 水平对细胞密度的影响显著不
同 ,以 0 mg/ L组最低 ,3 mg/ L 组次之 ,NO-3 -N 浓
度≥6 mg/ L 时对细胞密度的影响无显著差异。
图 1　不同处理下微绿球藻的细胞密度曲线
Fig.1　Cell density curves in different treatments for Nannochloropsis oculata
a.更新率 10%, 光强 22.9μmol/(m2·s);b.更新率 25%, 光强 22.9μmol/(m2·s);c.更新率 10%, 光强 43.2μmol/(m2·s);d.更新率 25%,
光强 43.2μmol/(m 2·s);e.更新率 10%, 光强 80.4μmol/(m2·s);f.更新率 25%, 光强 80.4μmol/(m2·s).
a.Renew al rate 10%, light intensi ty 22.9μmol/(m2·s);b.Renew al rate 25%, light intensity 22.9μmol/(m2·s);c.Renew al rate 10%, light in-
t ensity 43.2μmol/(m2·s);d.Renew al rate 25%, light intensi ty 43.2μmol/(m2·s);e.Renewal rate 10%, light intensity 80.4μmol/(m2·s);f.
Renew al rate 25%, light intensity 80.4μmol/(m2·s).
161第 2 期 朱艺峰等:光 、氮和半连续培养更新率对微绿球藻生长与采收量的影响
2.2　不同处理对生长率的影响
不同 NO-3 -N 水平 、光照强度和更新率对微绿
球藻生长率的影响如图 2。显然 ,更新率对生长率
的影响最明显 ,更新率 25%时的平均生长率显著高
于更新率 10%时的生长率 ,其平均值高出约 1 倍
(表 1)。对不同更新率分别进行协方差分析显示 ,
在 10%更新率时 ,不同 NO-3 -N 水平差异显著 ,以
0 mg/L 组最低 ,为(0.142±0.003)/d;3 mg/L 组次
之 ,为(0.178 ±0.003)/d;高于 3 mg/ L 水平时 ,
NO-3 -N 水平对生长率的影响不显著(0.189 ～
0.192)/d ,说明更新率低时 , 由于细胞密度相对较
大 ,对 NO-3 -N 的需求增加 。但在 25%更新率时 ,
3 mg/L 与 3 mg/ L 以上组间对生长率的影响在光
照强度较强的 80.4 μmol/(m2·s)水平存在显著差
异外 ,在较低的光照强度 22.9μmol/(m2·s)和 43.2
μmol/(m2·s)下无显著差异 (P >0.05),这意味着
光照强度增加时 ,对 NO-3 -N 的需求也趋于增加 。
结合总模型分析结果来看 , 0 mg/ L 水平和 22.9
μmol/(m2·s)水平的生长率显著低于其他NO-3 -N
和光照强度组的生长率 ,见表 1。
图 2　不同处理对微绿球藻生长率的影响
Fig.2　Effects of different treatments on growth rates of N.
oculata
2.3　不同处理对采收量的影响
NO-3 -N 、光照强度对采收量的影响与对细胞
密度影响相似 ,但更新率的影响相反(表 1)。3个因
素不同水平下对采收量的影响结果见图 3 ,可以看
出 ,在光照强度 22.9 μmol/(m2·s)水平下 ,不同更
新率 、不同 NO-3 -N 水平间的采收量相差幅度较
小 ,而且 25%更新率的采收量都小于 10%更新率下
的采收量;在 43.2 μmol/(m2·s)水平下 ,不同更新
率间的采收量无显著差异 ,不同 NO-3 -N 水平间的
采收量除 0 mg/L 水平外 ,相差幅度也不大 ,但 43.2
μmol/(m2·s)下采收量均大于 22.9 μmol/(m2·s)下
相应处理的采收量;而在光照强度 80.4 μmol/(m2·
s)水平下 ,除 0 mg/ L水平外 ,更新率 25%时的采收
量显著高于 10%下的采收量 。从这一结果可以看
出 ,采收量与细胞密度和更新率间存在一个动态平
衡关系(Y =V·R·B),这一平衡受到光照强度的调
节 ,由于光照强度的增强 ,使得更新率 25%的采收
量从低于 、相同到高于更新率 10%时的采收量 。从
总的平均采收量看 ,在 25%更新率下的日平均采收
量显著高于 10%时的采收量(见表 1)。
图 3　不同处理对采收量的影响
Fig.3　Effects of different treatments on recovery yields
2.4　光 、氮关系及对采收量影响
为分析光 、氮关系及对采收量的影响 ,对更新率
10%和 25%下的采收量进行回归分析 ,分别得方程
(1)和(2),其相应等高线图(表达为等采收量)见图
4(a ,b):
Y =-0.834 5+0.213 5N -0.019 1N 2+
0.000 5N3+0.001 8NL -0.000 1N2L +0.150 0L-
0.001 0L 2 (1)
(R 2=0.971 8 , P <0.000 1 , n=45)
Y =1.017 1-0.030 5N2+0.001 2N3+
0.012 3NL -0.000 4N2 L +0.0443 L (2)
162 中 国 水 产 科 学 第 11 卷
(R 2=0.945 3 , P<0.000 1 , n =45)
据图 4a ,在更新率 10%下 ,光照强度曲线变化
比不同 NO-3 -N水平的曲线变化陡 ,即光照强度对
采收量影响比 NO-3 -N 水平影响大。在相同 NO-3
-N 水平下 ,采收量都随着光照强度的增强而增加;
而在不同光照强度下 ,不同 NO-3 -N水平的影响极
为不同。光照强度低时 ,不同 NO-3 -N 水平的影响
相对较小 ,而光照强度越强 ,不同 NO-3 -N 水平的
影响就越大。在 25%的更新率下(图 4b),光照强度
与 NO-3 -N 水平对采收量的影响与 10%更新率下
的影响趋势较一致 ,但光照强度在低 NO-3 -N 水平
下对采收量的影响比 10%下相应 NO-3 -N 水平的
影响更大(曲线更陡)。结合图 4(a , b)分析 ,当光照
强度最弱时 ,即使 NO-3 -N 浓度最高 ,其采收量仍
较低;反之 ,当光照强度最强时 ,低 NO-3 -N 水平也
不能获得最高的采收量 ,经寻优计算 , 结果列于表
2。
图 4　不同更新率下光 、氮关系及采收量效应
Fig.4　Interrelation of light and nitrogen in different renewal rates and its effects on recovery yields
a.更新率为 10%;b.更新率为 25%　　a.Renew al rate 10%;b.Renewal rate 25%
表 2　方程寻优结果
Table 2　Calculated optimal results of different equations
方程
Equat ion
N L Y Max Y Min
1
10.6
0
80.0
22.9
6.3
—
—
2.1
2
12.1
0
80.4
22.9
9.5
—
—
2.0
注:N -氮水平 , mg/ L;L-光照强度 , μmol/(m2·s);Y max-采收量最
大值 , 108/ d;Y M in-采收量最小值 , 108/ d
Note:N -Nit rogen level , mg/ L;L -Light intensity , μmol/(m2·s);
Y max-Maximum yield , ×108/d;Y Min-Minimum yield , ×108/ d
3　讨论
3.1　更新率与光 、氮关系
更新率 、光照强度和氮浓度及其交互作用对半
连续培养微绿球藻的生长与采收量均有显著的影响
(表 1)。其中 ,以更新率影响最为明显 ,它可改变培
养液中的光照强度和 NO-3 -N 浓度 。首先 ,更新率
越大 ,采收后的细胞密度就越低 ,由于在特定容器培
养时的光衰减主要取决于藻的生物量浓度[ 10] ,故培
养液中光衰减变小 ,导致了藻生长率增大(图 2),反
之亦然。这种更新率越大 ,生长率也随之变大的现
象在三角褐指藻的研究中也有类似情况[ 5] 。其次 ,
更新率越大 ,意味着向培养液中添加的 NO-3 -N 浓
度比更新率低时的浓度大。可见 ,更新率大时 ,光照
强度和 NO-3 -N 浓度得到共同提高 ,促进了光 、氮
间的利用关系(见下文),使生长率和采收量增加 。
3.2　更新率对采收量的影响
在半连续培养下 ,不同更新率影响藻的细胞密
度 ,从而影响采收量。10%更新下 ,细胞密度呈增加
趋势 ,其平均细胞密度高于起始接种细胞密度;而在
25%更新下 ,平均细胞密度呈下降趋势 ,平均细胞密
度低于起始接种细胞密度(表 1 ,图 1)。即细胞密度
163第 2 期 朱艺峰等:光 、氮和半连续培养更新率对微绿球藻生长与采收量的影响
随着更新率的增加而降低 ,这与其他藻类的研究相
类似 ,而且两者间存在显著的负线性关系[ 4-5] 。根
据采收量的计算公式 Y =V·R·B 分析 ,由于 R 和
B 为负相关 ,因此 ,在半连续培养时均存在一个最适
的更新率 R 值 ,使日平均细胞密度 B 最大 ,从而获
得最大的采收量。当更新率低于最适更新率时 ,细
胞增长数量比更新掉的细胞数量多 ,使细胞密度呈
增加态势 ,反之细胞密度下降 。但值得注意的是 ,半
连续培养时的不同培养容器和不同微藻最适更新率
差异较大 ,如在光生物反应器中培养小球藻 ,最适更
新率约为 33%,日采收量达6.8×107 mL-1·d-1[ 2] ;
杜氏藻(Dunaliel la tertiolecta)最适更新率为 20%
～ 30%,日采收量为 3×106 mL-1·d-1[ 4] 。而在三
角烧瓶中培养的三角褐指藻 ,最适更新率约为 18.
2%,日采收量达 6.67×105 mL-1·d-1[ 5] 。
3.3　光氮关系及其采收量效应
采收量的等高线图显示 ,光对采收量的影响比
NO-3 -N 重要 ,而且在低 NO-3 -N 水平时 ,光的影
响更大(图 4a ,b)。由于在特定的更新率下 ,获得特
定采收量的光照强度与 NO-3 -N 浓度值并不唯一 ,
说明光照强度和 NO-3 -N 浓度对采收量具有相互
调节的作用。光照强度越低 ,不同 NO-3 -N浓度下
的采收量间相差不大 ,相似地 , NO-3 -N 浓度越低 ,
光照强度最高也不能获得较大的采收量 。这在陆地
植物光 、氮关系研究中也有类似的效应 ———光肥效
应 ,即光照强度与肥料(NO-3 -N)对生长起相互调
节作用 ,光照不足时 ,无法用施肥来弥补 ,反之亦然 。
即施肥所起的作用 ,只能是调节在既定的光照条件
下的光与肥的平衡状态[ 11] 。
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164 中 国 水 产 科 学 第 11 卷
Effects of light intensity , concentration of nitrogen and renewal rate in semicon-
tinuous cultures on growth and recovery yield of Nannochloropsis oculata (Droop)
Hibberd
ZHU Yi-feng , LIN Xia , XU Tong-cheng , YU Xiao-hua , GAO Cheng-mian , ZHANG Shi-jian
(Department of Fisheries , Ningbo University , Ningbo 315211 , China)
Abstract:A 5×3×2 factorial experiment w as designed wi th five concentrations of nit rogen(0 , 3 , 6 , 12
and 24 mg/ L in the form of NO-3 -N), three light intensities [ 22.9 μmol/(m2·s), 43.2 μmol/(m2·s)
and 80.4μmol/(m 2·s)] and two renew al rates(10% and 25%)to determine the ef fects of light intensi ty ,
concentration of nit rogen and renewal rate in semicontinuous cultures on the grow th and recovery yield of
Nannochloropsis oculata(Droop)Hibberd.N .oculata , rich in EPA , is one of the main feed source of
aquat ic animals in aquaculture.The results of GLM ANCOVA show that concentration of ni trogen , light
intensi ty , renewal rate and their interactions have significant ef fects on cell density , g row th rate and recov-
ery yield(P <0.001)of N.oculata , and the most affecting factor is renew al rate , and follow s the light in-
tensity and concentration of nit rogen.With the renewal rate of 25%, the average cell density (753.2×
10
4/mL)was low er than that with renew al rate of 10%, which was 1 737.5×104/mL , but mean grow th
rate and recovery yield w ere greater than the lat ter′s , which were 0.349/d and 4.69×108/d , respectively.
Under the light intensity of 22.9μmol/(m2·s), cell densi ty , grow th rate and recovery yield were signifi-
cant ly low er than any other g roup of light intensity , and their maxima values , which w ere 1 721.1×104/
mL , 0.283/d and 6.51×108/d , respectively , were obtained only w ith light intensity of 80.4μmol/(m2·
s).In different t reatments of ni trogen concentrations , the significantly dif ferent cont ributions of nit rogen
concentration to cell density , g row th rate and recovery y ield f rom low to high were 0 mg/ L , 3 mg/L and 6
mg/L.The results also indicate that increasing renew al rate not only promotes grow th rate because of light
attenuation reduct ion , but also enhances recovery yield because of increasing the concentration of nit rogen ,
and meanwhile , improving the balanced utilization between light and nit rogen.But it is noted that cell den-
si ty decreases w ith increasing renew al rate.Obviously , the renew al rate w as major factor influencing recov-
ery yield , and furthermo re , an optimal renewal rate causing maximum recovery yield w as also existence.
Thus , these results have interesting applications for the management of reasonable renew al and scientific ni-
t rogen application in semicontinuous cultures.
Key words:Nannochloropsis oculata(Droop)Hibberd;semicontinuous culture;renewal rate;light inten-
sity ;nitrogen;g row th;recovery yield
＊This study is supported by a local prog ram of Ningbo City (No.01N40100-58), and a prog ram of the
Education Department of Zhejiang Province (No.20010233).
165第 2 期 朱艺峰等:光 、氮和半连续培养更新率对微绿球藻生长与采收量的影响