全 文 ：刺松藻多糖免疫调节与抗肿瘤增效研究
吴荣杰1，汪艳秋1，刘宪丽2，刘 芳2，侯 林1，邹向阳2
(1．辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116029;2．大连医科大学生物技术系，辽宁 大连 116044)
摘要:目的 研究刺松藻多糖(CFPS)对荷瘤小鼠化疗的免疫调节与抗肿瘤增效。方法 以 Hca-F 肝癌小鼠为模型，采用重量
分析法和 TUNEL检测分析 CFPS抗肿瘤作用;采用中性红比色法、MTT法检测 CFPS对小鼠脾脏巨噬细胞吞噬活性、淋巴细胞
杀瘤活性;ELISA法检测 CFPS对血清中细胞因子分泌水平影响。结果 与对照组相比，CFPS 组、5-Fu 组和 CFPS 与 5-Fu 联合
用药组抑瘤率分别为 59． 77%、60． 05%，72． 84%，抑瘤作用显著增强 (P ＜ 0． 05) ;CFPS 组、5-Fu 组、CFPS 与 5-Fu 联合用药组
肿瘤细胞出现明显凋亡迹象。CFPS调节细胞因子 IL-10、IL-12、TNF-α 分泌均有显著性作用(P ＜ 0． 05) ，IL-10、TNF-α 在 5-Fu
组、CFPS与 5-Fu联合用药组间差异显著(P ＜ 0． 05)。结论 CFPS 对荷瘤小鼠有免疫调节活性，在肿瘤的免疫治疗中发挥作
用，能直接起到抑瘤作用。并可明显增强抗肿瘤药物 5-fluorouracil (5-Fu)的抗肿瘤作用，可明显改善预后。
关键词:多糖;刺松藻;抑瘤;免疫
Immunomodulation and antitumor activity of polysaccharides
from Codium fragile in vivo
WU Rong-jie1，WANG Yan-qiu1，LIU Xian-li2，et al
(1． College of Life Sciences，Liaoning Normal University，Dalian 116029，China;
2． Department of Biotechnology，Dalian Medical University，Dalian 116044，China)
Abstract:Objective To investigate the antitumor and immunomodulation activities of wide seaweed Codium fragile (sur．)Hariot poly-
saccharides(CFPS)in vivo．Methods The antitumor effects of CFPS on Hca-F hepatoma-bearing mice were assessed by quality analysis
and TUNEL assay． The lymphocyte antitumor-activity was assessed by MTT assays，the effect of CFPS on phagocytosis of macrophages
was studied by neutral red method． The effect of CFPS on the level of cytokine secretion of the serum was detected by ELISA method． Re-
sults Compared with the control group，the antitumor activities obviously were improved(P ＜ 0． 05) ;the antitumor rates in CFPS
group，5-Fu group and CFPS plus 5-Fu group were 59． 77%，60． 05%，and 72． 84% respectively． There were signs of tumor-cell apopto-
sis in CFPS group，5-Fu group and CFPS plus 5-Fu group． A significant difference was observed in relative contents of IL-10，IL-12 and
TNF-α produced by CFPS in mice serum． Compared with the 5-Fu group，relative contents of IL-10，TNF-αproduced were higher in the
CFPS plus 5-Fu group(P ＜ 0． 05)． Conclusion CFPS may have great effects on hepatoma-bearing mice and act as a biological modula-
tor，with antitumor activity． It can enhance the effect of anti-tumor efficacy of 5-Fu，and improve the prognosis．
Key words:polysaccharides;Codium fragile;anti-tumor;immunity
作者简介:吴荣杰，男，硕士研究生
通讯作者:侯 林，男，教授，博士生导师，研究方向:海洋生物学，E-
mail:houlin01@ 126． com
化疗是肿瘤综合治疗中的主要手段之一，但是大多化疗
后常引起免疫抑制，预后不良［1］。5-Fu 影响核的生物合成的
抗代谢抗肿瘤药物，是临床治疗消化道等肿瘤的基础药物。
5-Fu毒副作用相对较强，在杀伤瘤细胞的同时，也大量杀伤
淋巴细胞和造血干细胞，致机体免疫、造血功能低下。寻找新
的低毒副作用高效抗肿瘤药或具协同增效作用的天然药
物［2 ～ 5］是医学界研究热点之一。
刺松藻多糖是源于海洋绿藻刺松藻细胞的细胞壁，富含
硫酸根的杂多糖［6］。刺松藻多糖有多种生物活性作用，具有
抗肿瘤、抗病毒、抗凝血［7］作用。研究表明刺松藻多糖对 H-
22 肿瘤生长有一定抑制作用，因此进一步研究刺松藻多糖对
化疗药物 5-Fu的增效作用及机理具有重要意义。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 动物和细胞系 昆明种小鼠，清洁级，6 ～ 8 周龄，体
重(20 ± 2)g，雌性，大连医科大学 SPF实验动物中心提供;小
鼠肝癌高淋巴道转移细胞系 Hca-F，由大连医科大学病理学
教研室建株并保存。
1． 1． 2 药品与试剂 RPMI1640 培养液，小牛血清，胰蛋白酶
均为 Gibco产品;5 氟尿嘧啶(5-Fu) ，为 Sigma 产品。兔抗 IL-
10、IL-12 多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司;羊抗
TNF-α多克隆抗体，Santa(USA) ;ELISA 试剂盒，其他试剂为
国产分析纯。
CFPS粗品由本研究室提取［8］，对粗品采用凝胶电泳分
析，然后使用透析方法，截留分子量范围≥14 000 Da 范围的
多糖分子，反复冻融去除不溶部分。
1． 1． 3 主要仪器设备 CO2 孵箱和酶标仪(Thermo Election
Corporation) ;旋转蒸发仪(Thermo Fish) ;超净工作台(上海博
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讯实有限公司医疗设备厂) ;FD-1 真空冷冻干燥机(北京博医
康实验仪器有限公司) ;倒置显微镜(Nikon)。
1． 2 方法
1． 2． 1 小鼠体内抗肿瘤实验 建立小鼠肝癌高淋巴道转移
细胞系 Hca-F 实体瘤模型，取接种 5 d 生长良好的小鼠肝癌
Hca-F腹水细胞，PBS洗涤 2 次，冰浴条件下以生理盐水制备
细胞悬液(每毫升含 1 × 107 个细胞) ，接种于昆明小鼠右腋皮
下 0． 2 ml(每只含 2 × 106 细胞) ，30 min 内完成。24 h后随机
分 4 组，每组 7 只:Ⅰ组生理盐水组，Ⅱ组 CFPS 组，Ⅲ组 5-Fu
组，Ⅳ组 CFPS与 5-Fu联合用药组，使用到的 CFPS、5-Fu用药
剂量(药物有效成分 /小鼠体重)分别是 100，20 mg·kg －1。
每日腹腔注射给药 1 次(每只 0． 2 ml) ，连续给药 7 d。实验期
间自由摄食和饮水。停药后次日，称总重，摘除眼球取血(0． 5
～ 1． 0 ml) ，收集于 EP管，3 000 rpm 离心，10 min，收集血清，
－ 20 ℃保存用于细胞因子检测。颈椎脱臼法处死小鼠，称肿
瘤、胸腺和脾脏(无菌，用于细胞免疫实验)重量;计算抑瘤
率、脾指数和胸腺指数。肿瘤组织 4%中性福尔马林固定，石
蜡切片，HE染色。
抑瘤率 =［(对照组瘤体比 －实验组瘤体比)/对照组瘤
体比］× 100%;脾指数 =脾重量(mg)/小鼠体重(g) ;胸腺指
数 =胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)。
1． 2． 2 小鼠脾巨噬细胞吞噬活性检测 常规制备不同实验
组小鼠脾巨噬细胞，用含 10%小牛血清 RPMI1640 培养基培
养，加入 96 孔板(每孔 1 × 106 个) ，每组 3 个复孔，置于 37℃、
5% CO2 饱和湿度培养箱中培养 72 h。每孔吸除 100 μl培养
液后，加入中性红溶液 100 μl，继续培养 30 min，1 500 rpm离
心 15 min，弃上清，PBS 洗 3 次，每孔加入 200 μl 细胞裂解液
(乙醇∶乙酸 = 1 ∶ 1) ，室温过夜，酶标仪测定波长为 589 /630
nm时吸光度值(A值) ，分析巨噬细胞吞噬活性。
1． 2． 3 小鼠脾淋巴细胞增殖活性检测 常规制备不同实验
组小鼠脾淋巴细胞(浓度为每毫升 1 × 106 个) ，加入到 96 孔
培养板中(每孔 200 μl) ，每组 3 个复孔，置于 37℃、5% CO2
饱和湿度的培养箱中培养 68 h。每孔加入 15 μl，5 g·L －1
MTT，避光继续孵育 4 h后，1 500 rpm离心 15 min，弃上清，每
孔加入 DMSO 150 μl，振荡 10 min，酶标测定仪测定 492 /630
nm波长下吸光度值(A值) ，分析淋巴细胞增殖活性。
1． 2． 4 小鼠血清 IL-10、IL-12、TNF-α水平测定 各实验组小
鼠血清，－ 20℃保存，使用 ELISA 试剂盒检测 IL-10、IL-12 和
TNF-α相对含量，用酶标仪在 589 nm 波长下测吸光度值(A
值) ，以吸光度 A值表示相对含量。
1． 2． 5 数据处理 应用统计学软件 SPSS11． 5 对所有数据进
行统计学处理，结果以(x ± s)表示，组间数据差异性检验采用
t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，P ＜ 0． 05 为差
异有统计学意义。
2 结果
2． 1 CFPS对小鼠肿瘤生长的抑制作用
2． 1． 1 小鼠肿瘤重量检测 CFPS对 Hca-F肝癌抑制率:Ⅱ、
Ⅲ、Ⅳ组抑瘤率分别为 59． 77%、60． 05%、72． 84%，与Ⅰ组比
较，差异极显著(P ＜ 0． 01 ) ;Ⅳ组与Ⅱ、Ⅲ组相比，有增加趋
势(图 1)。
2． 1． 2 TUNEL原位检测 肿瘤 HE 石蜡组织切片与 TUNEL
原位检测很好反映出药物诱导瘤细胞凋亡效果(图 2)。
2． 2 CFPS对小鼠脾指数、胸腺指数作用 与对照组相比，
小鼠脾指数和胸腺指数没有显著性差异(P ＞ 0． 05) ，但是具
有升高的趋势，CFPS 对小鼠脾指数和胸腺指数有一定影响
(图 3)。
图 1 接种 Hca-F的昆明小鼠模型的肿瘤实物图片资料
图 2 CFPS对小鼠 Hca-F肿瘤细胞的影响
注:A、B、C为石蜡组织切片HE染色;a、b、c为 Tunel试剂盒染色
结果。A、a为Ⅰ组瘤组织切片，B、b 为Ⅱ组，C、c 为Ⅳ组;明显看出 B
的瘤细胞出现瘤细胞凋亡迹象:核固缩、胞浆染色加深、胞内出现空
泡，C的瘤细胞生长受到抑制
图 3 实验组小鼠脾指数、胸腺指数趋势图
2． 3 CFPS对荷瘤小鼠脾巨噬细胞吞噬中性红能力的影响
脾巨噬细胞吞噬中性红实验结果显示，培养中继续给予
CFPS，脾巨噬细胞吞噬能力有所增加;若停止给药，则无明显
变化。表明 CFPS对荷瘤小鼠脾巨噬细胞的吞噬功能有促进
作用，但这种促进效应要在 CFPS 持续存在的条件下才能维
持，相比之下 5-Fu对荷瘤小鼠脾巨噬细胞吞噬功能的促进作
用更为持久。
2． 4 CFPS对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响 脾淋
巴细胞增殖实验显示，若细胞培养过程中未持续给予 CFPS、
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CFPS + 5-Fu，淋巴细胞的增殖能力显著下降(P ＜ 0． 01) ，表
明淋巴细胞的高增殖活性对药物具有较强的依赖性。
2． 5 CFPS 对荷瘤小鼠血清中 IL-10、IL-12 和 TNF-α水平
的影响 ELISA 法检测 CFPS 对荷瘤小鼠血清中 IL-10、IL-12
和 TNF-α的相对含量的影响，结果显示，肿瘤对于宿主的免
疫因子有较强作用。CFPS 能显著升高血清中 IL-10、IL-12、
TNF-α水平(P ＜ 0． 05) ，且 CFPS 能与 5-Fu 产生抗肿瘤协同
增效作用(表 1)。
表 1 CFPS对荷瘤小鼠血清中 IL-10、IL-12 和 TNF-α的
相对含量(A值 589 nm)的影响
组别 IL-10 IL-12 TNF-α
Ⅰ组 0． 85 ± 0． 16 1． 60 ± 0． 47 0． 10 ± 0． 23
Ⅱ组 1． 15 ± 0． 24* 2． 12 ± 0． 23* 0． 40 ± 0． 12*
Ⅲ组 1． 05 ± 0． 14* 2． 08 ± 0． 13* 0． 56 ± 0． 07＊＊
Ⅳ组 1． 32 ± 0． 26＊▲ 2． 20 ±0． 13* 0．75 ±0．08＊＊▲▲
注:与Ⅰ组相比* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01;Ⅳ与Ⅲ组相比▲ P ＜
0． 05，▲▲P ＜ 0． 01
3 讨论
本研究通过体内模型的构建以及细胞的体外培养方式得
到的数据显示，100 mg·kg －1的 CFPS 通过与 5-Fu 不同的肿
瘤作用机制，对机体肿瘤生长起到明显抑制作用，显著增强 5-
Fu的小鼠抗肿瘤活性，提高机体细胞因子 IL-10、IL-12 和
TNF-α的分泌水平。
CFPS通过对机体免疫系统进行活化，提高细胞与分子免
疫应答水平，调节细胞因子分泌，发挥抗肿瘤作用:IL-10、IL-
12 和 TNF-α 是重要免疫调节因子，与肿瘤免疫密切相关。
其中 IL-10 作为一种重要的免疫调节因子，能广泛作用于 T
细胞，NK细胞，Mφ等免疫细胞。它抑制 Mφ促进天然和特异
性免疫的功能，同时增强这些细胞作为肿瘤细胞的清道夫功
能。IL-12 是重要的抗肿瘤细胞因子之一，能诱导特异性杀
伤性 T细胞(CTL)的产生与成熟;与细胞因子 IL-18 协同促进
Th1 细胞的分化与成熟;促进 IL-2、IFN-γ 等的分泌［9］。TNF-
α是一种功能较强的抗肿瘤细胞因子，可以引起肿瘤组织出
血坏死，对于体外培养的多种肿瘤细胞株具有较强的细胞毒
性作用［10］。本研究表明 CFPS具有增加荷瘤小鼠体内免疫细
胞分泌 TNF-α的功能。近年研究表明，IL-12 与 TNF-α 具有
协同抗肿瘤效应，IL-10，IL-12 与 TNF-α通过多种途径发挥免
疫调节作用。这些与 5-Fu 在细胞内转化为有效的脱氧核糖
尿苷酸后，通过阻断脱氧核糖尿苷酸受细胞内胸苷酸合成酶
转化为胸苷酸，从而干扰 DNA 的合成的抗肿瘤机制不同。
CFPS对 IL-10、IL-12 和 TNF-α等多种肿瘤免疫相关细胞因子
的分泌均有增强作用，能增强机体细胞和分子的免疫活性，
是一种良好的免疫调节剂，具有潜在应用价值，CFPS 与 5-Fu
的联合用药可以实现协同增效。
CFPS的作用机理尚处于研究阶段，这也是本研究室研究
方向，在接下来实验开展中，关于 CFPS 抗肿瘤和免疫调节作
用的靶位点以及分子信号途径的深入研究将作为研究的重
点。
目前，临床应用多糖治疗肿瘤的报道多数是关于多糖联
合化疗治疗的研究［11］。随着近年来高效液相色谱及其联用
的广泛使用，CFPS 的纯化条件得到了很大改善。高纯度的
CFPS生物活性研究逐渐成为学科热点。海藻多糖的作用机
理的研究也取得了进展［12］:多糖通过刺激机体内各种免疫细
胞的成熟、分化和增殖，防止肿瘤细胞增殖和转移，诱导肿瘤
细胞凋亡或使之抑制或促进分泌多种效应分子，而清除靶细
胞。由于 CFPS所具备的诸多效应，使之在用于癌症的辅助
治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点。
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