全 文 ：2011 年 21(4) 生 物 技 术
3 讨论
枯草芽孢杆菌因能产生耐热芽孢和多种抗菌物质成为植
物病害生物防治的重要生防菌株，抗菌物质的拮抗作用是枯
草芽孢杆菌发挥生防功能的主要机制之一［5］，目前，对于枯草
芽孢杆菌产生抗菌物质的报道较多，已从不同来源的枯草芽
孢杆菌中分离出对不同植物病原菌具有拮抗作用的抗菌物
质［6 － 9］，主要包括抗菌蛋白和脂肽类抗生素两大类。在已报
道的抗菌蛋白中，多数抗菌活性不强，抗菌谱较窄［10］，枯草芽
孢杆菌 TF26 产生的抗菌蛋白抑菌谱广，抑菌活性强，能够抑
菌 13 种植物病原真菌的生长，抑菌率在 74%以上。迄今为
止，关于枯草芽孢杆菌抗菌蛋白同时对葵花菌核病菌等 13 种
土传和叶部病害病原菌具有较强抑制作用还未见报道。
抗菌蛋白的生物稳定性是决定其是否具有应用潜力的关
键。近年来国内外学者对抗菌蛋白的温度、pH 和蛋白酶稳定
性进行了较深入的研究。陈夕军等［11］报道水稻内生枯草芽孢
杆菌 G87 抗菌蛋白对热(60℃)不够稳定，在较碱(pH 8)条件
下抑菌活性下降;翟茹环等［10］报道枯草芽孢杆菌 G8 抗菌蛋
白对温度有较高的稳定性，抗菌蛋白经 100℃处理 60min保持
原有活性的 80. 8%，在常温下 120d保持原有活性的 71. 54%。
张宝俊等［12］报到内生解淀粉芽孢杆菌 LP － 5 抗菌蛋白对高
温敏感，100℃处理 30min，抑菌活性仅为对照的 18. 4%，对酸
稳定、对碱敏感，pH 13 处理后抑菌活性下降为原有活性的
74. 1%。本文报道的枯草芽孢杆菌 TF26 产生的抗菌蛋白具
有很强的耐热性，酸碱稳定性，抗紫外线照射，储存条件宽泛，
100℃处理 30min，抑菌活性为对照的 91. 0%，pH 12 处理后抑
菌活性为原有活性的 75. 6%，4℃和室温(20℃)储存 180d 抑
菌活性为对照的 90. 2% 和 89. 6%，该抗菌蛋白的耐热性、储
存稳定性优于文献报道，酸碱稳定性与张宝俊报道的相当。
这些性质表明该抗菌蛋白在较恶劣的环境下，稳定性好、活性
高，因此在抗菌蛋白的生产和实际应用中有良好的应用前景，
具有一定的开发应用价值，值得进一步加强研究。本项研究
仅对抗菌蛋白进行初步分离，需要进一步分离纯化出单一抗
菌蛋白，明确其结构、功能和抑菌机理，为抗菌蛋白的基因克
隆及蛋白农药的开发应用奠定基础。
参考文献:
［1］张彦杰，罗俊彩，武延萍，等 . 生防枯草芽孢杆菌研究进展［J］. 生
命科学仪器，2009，7(4) :19 － 23.
［2］刘雪，穆常青，蒋细良，等 . 枯草芽孢杆菌代谢产物的研究进展及
其在植病生防中的应用［J］. 中国生物防治，2006，22(增刊) :179 －
184.
［3］VanLoon L C. The nomenclature of pathogenesis － related proteins［J］.
Physiol Mol Plant Pathol，1990，37:229.
［4］Selitrennikoff C P. Antifungal proteins［J］. Appl Environ Microbiol，
2001，67(7) :2883.
［5］高兆建，孙会刚，侯进慧，等 . 枯草芽孢杆菌 XZG － 11 抗菌蛋白对
番茄青枯假单胞菌抗菌活性研究［J］. 中国农学通报，2011，27(1) :234
－ 238.
［6］李智洋，郑兰娟，李亚男 . 枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的性质及对魔芋
软腐病菌的抑制作用［J］. 湖北农业科学，2008，47(1) :55 － 57.
［7］石怀兴，尚玉珂，季静，等 . 培养条件对枯草芽孢杆菌 G8 抗菌蛋白
含量的影响及蛋白液对黄瓜菌核病的生防效果［J］. 农药学学报，
2009，11(2) :244 － 249.
［8］刘永锋，张杰，陈志谊，等 . 枯草芽孢杆菌 Bs － 916 胞外抗菌蛋白
质的生物功能分析［J］. 江苏农业学报，2008，24(3) :269 － 273.
［9］沈锦玉，尹文林，曹铮，等 . 枯草芽孢杆菌 B115 抗菌蛋白的分离纯
化及部分性质［J］. 水生生物学报，2005，29 (6) :689 － 693.
［10］翟茹环，尚玉珂，刘峰，等 . 枯草芽孢杆菌 G8 抗菌蛋白的理化性
质和抑菌作用［J］. 植物保护学报，2007，34(6) :592 － 596.
［11］陈夕军，李娟，孙启利，等 . 水稻内生枯草芽孢杆菌 G87 抗菌蛋白
的分离纯化、组成分析及理化特性［J］. 微生物学报，2010，50(10) :
1353 － 1357.
［12］张宝俊，张家榕，韩巨才，等 . 内生解淀粉芽孢杆菌 LP － 5 抗菌蛋
白的分离纯化及特性［J］. 植物保护学报，2010，37(2) :143 － 147.
半导体激光辐照对拟微绿球藻的生物学效应
刘晓娟1，姜宝楠2，庄惠如1* ，陈荣2
(1. 工业微生物教育部工程研究中心、福建师范大学生命科学学院、福建省现代发酵技术工程研究中心，福建 福州 350108;
2. 福建师范大学物理与光电信息科技学院，福建 福州 350007)
摘要:目的:研究半导体激光对拟微绿球藻的生物学效应，进而利用激光诱变筛选高产优质藻株。方法:采用半导体激光辐
照拟微绿球藻，辐照时间为 10min、20min、30min。结果:诱变后藻的代谢物产量均有提高。结论:10min、20min、30min 辐照条件
下，对拟微绿球藻细胞生长及代谢产物均有不同程度的促进作用，其中 10min辐照组有利于拟微绿球藻的生长及色素的积累，分
别比对照组提高了 45. 06%、86. 59%、56. 06%;但在 20min剂量下更有利于胞外多糖、总多糖、蛋白质及油脂含量的积累，分别比
对照组提高了 67. 7%、51. 89%、19. 16%、69. 78%。
关键词:半导体激光;拟微绿球藻;油脂
中图分类号:Q948. 8 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 04． 110
Semiconductor － laser on the Biological Effect of Nannochloropsis sp. YW0980
LIU Xiao － juan1，JIANG Bao － nan2，ZHUANG Hui － ru1* ，CHEN Rong2
(1. Engineering Research Center of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Engineering Research Center
of Fujian Modern Fermentation Technology，College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou 350108，China;
2. College of Physics and Optoelectronics Technology，Fujian Normal University，Fuzhou 350007)
Abstract:Objective:The biological effect of Nannochloropsis sp. YW0980 was researched under semiconductor － laser － irradiation to
58
生 物 技 术 2011 年 21(4)
screen high － yield and high － quality algae strains. Method:The algae was induced bysemiconductor － laser in the does of 10min，20min，
30min. Result:The yield of metabolites was increased after mutagenesis. Conclusion:The growth and metabolites accumulation of the algae
were promoted by all three dose of semiconductor － laser. The dose of 10min was favourable to the growth and pigment accumulation of the
algae，compared with CK，their content was increased by 45. 06%，86. 59%，56. 06% respectively;but the dose of 20min was more favour-
able to stimulate the accumulation of polysaccharide，protein and lipid content. Compared with CK，the algae’s exocellular polysaccharide，
total polysaccharide，protein and lipid content was increased by 67. 7%，51. 89%，19. 16%，69. 78%，respectively.
Key words:semiconductor － laser;Nannochloropsis sp. YW0980;lipid
收稿日期:2011 － 02 － 22;修回日期:2011 － 05 － 14
基金项目:福建省自然科学基金项目(2010J01144)资助
作者简介:刘晓娟(1985 －) ，女，硕士生，从事水生生物学研究，Email:
liuxiaojuansk2005@ 126. com。* 通讯作者:庄惠如(1957 －) ，女，硕士，
教授，从事藻类生物学研究，Tel:0591 － 83432109，Email:hrzhuang@
fjnu. edu. cn。
0 引言
随着化石能源的不断减少及所造成的环境污染的加剧，
微藻被认为是当今最有开发前途的可再生生物能源之一。拟
微绿球藻富含 EPA、蛋白质、维生素等物质［1］。其中 EPA能增
强水产养殖动物的免疫力，提高抗病力和成活率［1，2］。因此，
它是一种非常重要的海产经济饵料藻。同时拟微绿球藻还具
有易培养、生长周期短、生物量大、脂类物质含量较高等优点，
因此也是良好的能源微藻候选者之一。
激光是一种光量子流，激光微束［3］可聚焦于微藻细胞内
的细胞核及多种细胞器，在不破坏细胞膜的前提下实现对其
改造达到育种目的。近年来，国内藻类研究者利用激光诱变
紫球藻、螺旋藻、金藻、小球藻等［4 － 10］的研究较多，而在拟微绿
球藻育种中的应用研究则尚未见报道。本文针对半导体激光
辐照拟微绿球藻的生物学效应进行初探，以期利用激光诱变
筛选高产优质藻株。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
实验藻种为福建长乐漳港海蚌场提供的“云微藻”，该藻
种原为 20 世纪 80 年代由福建海域分离的野生藻株，经培养驯
化已经成为福建沿海水产养殖中的主要基础饵料生物。藻种
经福建师范大学生命科学学院微藻实验室分离纯化鉴定为拟
微绿球藻(Nannochloropsis sp. YW0980)。
1. 1. 2 试剂
丙酮、浓硫酸、乙醇、NaH2PO4·2H2O、NaHPO4·12H2O
(均为 AR) ，西陇化工股份有限公司;葡萄糖、磷酸、NaCl、牛血
清蛋白(均为 AR) ，国药集团化学试剂有限公司;重蒸馏苯酚，
北京索莱宝科技有限公司。考马斯亮蓝 G －250，Sigma公司。
1. 1. 3 仪器
半导体激光器;紫外可见分光光度计;超声波破碎仪;荧
光分光光度计。
1. 1. 4 培养基
取天然海水过滤，采用 f /2 营养盐配方［11］配制培养液，经
高温灭菌并冷却后备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 激光处理及培养条件
采用型号为 630nm －半导体激光器，波长 440nm，光纤端
功率 150mw，光束长 3cm，经过预实验 s 初筛确定激光辐照时
间:10min、20min、30min。
取对数生长期藻液 2ml 于规格为 25 × 25cm 的小称量瓶
中，半导体激光辐照。辐照的同时使用磁力搅拌器，使转子匀
速转动实现藻液被均匀辐照。辐照后立即将藻液接入 50ml
三角瓶，暗培养一个晚上后放于温度控制在 20℃ ± 1℃的藻种
培养室，光强控制在 3 000 ～ 5 000lx的冷白荧光灯提供连续光
照。培养期间每天摇动 3 次。培养 1w后转接到 150ml三角瓶
中。整个过程设置空白对照组，各处理组均设 3 个平行。
1. 2. 2 生长速率测定
辐照后，隔天定时取 4ml藻液，用“血球计数板”进行细胞
数目统计，根据生长速率计算公式，K =(lgX2 － lgX1)/(T2 －
T1). 其中，K为比生长速率常数;T1、T2 为培养时间;X1、X2 为
培养 T1、T2 天时藻细胞数目。
1. 2. 3 色素含量测定
取藻液 5ml于 7ml 离心管中，用 90%的丙酮提取藻细胞
的色素，分别于 663nm、645 nm、470 nm 波长下测其吸光值。
计算公式如下:
CA = 12. 21OD663 － 2. 81OD646
CB = 20. 13OD646 － 5. 03OD663
Cx·c =(1000OD470 － 3. 27CA － 104CB)/ 229
式中:Cx·C为类胡萝卜素的总浓度，单位为 mg·L
－1;
OD663、OD646和 OD470分别为叶绿体色素提取液在波长 663nm、
646nm和 470nm下的吸光度［12］。
1. 2. 4 多糖含量测定
采用苯酚 －浓硫酸法［13］，以烘干至恒重的葡萄糖作标准
物。
1. 2. 5 蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝法［13］，以牛血清蛋白作标准物。
1. 2. 6 油脂相对含量测定
有文献报道油脂可用尼罗红荧光标记，在激发波长 450 ～
500nm下，油脂荧光的发射波长 528nm ～ 600nm 左右［14 － 16］。
实验用荧光分光光度计分析经尼罗红标记后藻细胞油脂的相
对含量，在激发波长 490nm条件下，藻细胞油脂荧光的发射波
长确定为 580nm。具体方法如下:取处于稳定期的藻液
0. 2ml，加 4. 8ml 空白培养基稀释后与 50μl 尼罗红染液
(0. 1mg /ml溶于丙酮) ，7min后用荧光光度计分析。
2 结果与分析
2. 1 激光辐照对藻生长的影响
由图 1、2 可知，半导体激光在一定剂量范围内对拟微绿
球藻的生长均起到不同程度的促进作用。其中半导体激光辐
照 10min时效果最好，在第 2d，处理组的比生长速率与对照组
68
2011 年 21(4) 生 物 技 术
图 1 不同剂量半导体激光处理后藻的生长曲线
Fig. 1 The growth of algae under different semiconductor － laser dose
图 2 不同剂量半导体激光处理后藻的比生长速率
Fig. 2 The relative grow rates of algae under different semiconductor － la-
ser dose
的比生长速率区别不大，但是当培养到第 8d时 10min、20min、
30min处理组的比生长速率分别比对照组提高了 45. 06%，
29. 48%、32. 78%。对激光辐照后第 8d 藻的比生长速率进行
单因素方差分析，得出 F = 1. 373E8，P = 0. 000 ＜ 0. 01，即激光
辐照对藻细胞生长存在极显著的影响。多重比较表明:激光
处理后各组之间的差异性也是极显著(P ＜ 0. 01)。
2. 2 激光辐照对藻色素含量的影响
图 3 不同剂量半导体激光处理后藻的色素含量
Fig. 3 The pigment content of algae under different semiconductor － laser
dose
由图 3 可知，色素的积累和生长曲线呈正相关，对激光辐
照后藻的色素含量进行单因素方差分析，得出叶绿素 a的 F =
2. 970E10，P = 0. 000 ＜ 0. 01，类胡萝卜素的 F = 3. 822E13，P =
0. 000 ＜ 0. 01，即激光对叶绿素 a 和类胡萝卜素的含量存在极
显著影响。多重比较表明:半导体激光处理 10min 组的叶绿
素 a和类胡萝卜素分别比对照组提高了 86. 59%、56. 06%(P
＜ 0. 01，差异极显著) ;半导体激光处理 20min组的叶绿素 a和
类胡萝卜素分别比对照组提高了 40. 5%、19. 92%(P ＜ 0. 01，
差异极显著) ;半导体激光处理 30min 组的叶绿素 a 和类胡萝
卜素分别比对照组提高了 36. 27%、9. 84%(P ＜ 0. 01，差异极
显著)。说明在一定剂量范围内的半导体激光可促进藻类色
素含量的提高，其中 20min处理组的效果最好。
2. 3 激光辐照对藻多糖含量的影响
图 4 不同剂量半导体激光处理后藻的多糖含量
Fig. 4 The polysaccharide content of algae under different semiconductor
－ laser dose
从图 1 ～ 3 发现，半导体激光辐照 10min、20min、30min 均
促进细胞生长，其中辐照 10min 的效果最好，由图 4 可知辐照
10min、20min、30min 同样可促进细胞多糖的积累，但是 20min
处理组却比 10min处理组更有利于藻多糖的积累。对不同剂
量处理后藻多糖含量进行单因素方差分析，得胞外多糖 F =
1. 811E12，P = 0. 000 ＜ 0. 01，总多糖 F = 1. 613E11，P = 0. 000 ＜
0. 01，即不同剂量对藻多糖含量有极显著的影响。多重比较
表明:10min辐照组的胞外多糖和总多糖比对照组分别提高了
25. 1%、28. 4%(P ＜ 0. 01，差异极显著) ;20min 的比对照组分
别提高了 67. 7%、51. 89%(P ＜ 0. 01，差异极显著) ;30min 的
比对照组分别提高了 48. 77%、36. 12%(P ＜ 0. 01，差异极显
著) ，此外，胞外多糖和总多糖各处理组之间的差异都是极显
著(P ＜ 0. 01)。
2. 4 激光辐照对藻蛋白质含量的影响
图 5 不同剂量半导体激光处理后藻的蛋白质含量
Fig. 5 The protein content of alage under different semiconductor － laser
dose
对激光处理后该藻蛋白质含量进行单因素方差分析，得 F
= 1. 164E11，P = 0. 000 ＜ 0. 01，即激光对藻蛋白质含量有极显
著的影响。多重比较表明:激光处理后蛋白质含量均有一定
提高，其中 20min 处理组的作用最明显，比对照组提高了
19. 16%(P ＜ 0. 01，差异极显著) ;10min 的比对照组提高了
15. 66%(P ＜ 0. 01，差异极显著) ;30min 的比对照组提高了
15. 65%(P ＜ 0. 01，差异极显著)。除了 10min处理组与 30min
处理组的差异不显著(P ＞ 0. 05) ，其它任意两组之间差异极显
著，表明 10min、20min和 30min激光处理对提高该藻蛋白质含
量均具有很明显的作用(见图 5)。
2. 5 激光辐照对藻油脂含量的影响
78
生 物 技 术 2011 年 21(4)
图 6 不同剂量半导体激光处理后藻的油脂含量
Fig. 6 The lipid content of alage under different semiconductor － laser
dose
对激光处理后的该藻油脂相对含量进行单因素方差分
析，得 F = 8089854. 000，P = 0. 000 ＜ 0. 01，即激光处理对藻油
脂含量具有显著性影响。多重比较表明:30min处理组的作用
最显著，单位体积细胞的荧光强度比对照组提高了 93. 54%(P
＜0. 01，差异极显著) ;20min处理组单位体积细胞的荧光强度
比对照组提高了 69. 78%(P ＜ 0. 01，差异极显著) ;10min 辐照
组比对照组提高了 18. 44%(P ＜ 0. 01，差异极显著) ，并且各
处理组之间的差异极显著(P ＜ 0. 01)。实验统计结果表明从
10min ～ 30min三个激光剂量对该藻油脂含量的提高均具有很
显著的影响(见图 6)。
3 讨论
本研究采用半导体激光诱变拟微绿球藻，旨在提高其产
油能力。结果表明半导体激光辐照对该藻的生物学影响，主
要表现在以下几个方面:生长速率提高，比生长速率加快，色
素含量、多糖含量、蛋白质含量和油脂含量增加等。其中辐照
10min时最有利于细胞的生长，其比生长速率比对照组提高了
45. 06%;同时 10min处理组条件下的色素积累最多，叶绿素 a
和类胡萝卜素分别比对照组提高了 86. 59%、56. 06%;但是
10min处理组的代谢物积累较少，20min 处理组的反而更多，
其中胞外多糖含量、总多糖含量、蛋白质含量及油脂含量分别
比对照组提高了 67. 7%、51. 89%、19. 16%、69. 78%;对于油
脂含量的提高在 30min 处理组的作用最显著，单位体积细胞
的荧光强度比对照组提高了 93. 54%。上述结果表明，半导体
激光促进藻生长及代谢物积累的最佳剂量是不一致的，因此，
在实验中或生产实践中，应综合考虑多方面的因素，确定一个
最佳剂量是很有必要的。
已有的研究表明，适宜功率的激光辐照对多种微藻均具
有明显的生理刺激效应，如黄鹭强的研究发现，半导体激光能
促进紫球藻细胞的生长、色素含量及胞外多糖含量的提高［4］;
庄惠如等［17，18］曾报道，波长为 650nm的半导体激光辐照后，能
显著提高雨生红球藻细胞的光合活性和细胞生物量，而波长
为 1. 06μm的 Nd:YAG 激光，在一定剂量范围内，能促进金藻
细胞形成大量的脂质颗粒，同时向胞外分泌多糖或脂类物质，
并认为低功率激光是通过激活藻细胞中叶绿素合成酶的活
性，进而促进藻细胞的光合活性与细胞的增殖;王明兹［19］等认
为激光辐照对细胞有一定损伤，多糖含量的增加是细胞防止
或降低照射伤害的一种保护性途径，而且照射还可能引起细
胞代谢流及胞壁通透性发生改变，从而引起多糖含量增加;有
国外学者［20］认为类胡萝卜素可以保护植物组织因强光导致
的细胞光氧化破坏。因此推断，当藻处于不利条件时，类胡萝
卜素的增加也具有保护光合系统的作用。本研究中，半导体
激光辐照后，拟微绿球藻的生长速率、色素、多糖、蛋白质以及
油脂含量均有不同程度的增加，此结果进一步证实了上述研
究的论断。但是 2007 年孙杰等［10］研究 YAG、LD 和 Ar +激光
辐照对盐生杜氏藻生长及 β －胡萝卜素积累的影响，发现在辐
照时间超过 1min时对其细胞的增值具有明显的抑制作用，同
时抑制胡萝卜素的合成。此研究结果有异于上述的报道，笔
者认为，激光辐照效应的差异，很大程度上与选择的激光功
率、照射剂量以及藻种生理状态的不同有关。由于生物体本
身的复杂性和可修复性等特点，至今激光诱变生物体的真正
机理还有待于进一步深入的研究。
尼罗红(C20H18N2O2)是一种嗯嗪类染料，专门用于染脂
类物质，可直接应用于细胞的检测，是一种方法简便快速的油
脂标记材料。近年来，已有报道采用尼罗红荧光染色法定量
分析微藻的中性油脂含量［14 － 16］。本研究用尼罗红标记拟微
绿球藻的油脂并用荧光光度计分析藻细胞油脂的相对含量，
与传统的油脂检测法［21，22］相比，发现这种方法具有简便、快
速、有效的特点，因此，尼罗红染色结合荧光分光光度计作为
高产油脂藻株的筛选方法值得推广。
参考文献:
［1］Urano K，Maruyama K，Ogata Y，et al. Characterization of the ABA －
regulated global responses to dehydration in Arabidopsis by metabolomics
［J］. Plant J，2009，57(6) :1065 － 1078.
［2］吴瑞珊，魏东 . 盐度及其调节方式对眼点拟微球藻的生长和 EPA
积累的影响［J］. 现代食品科技，2007，23(12) :5 － 8.
［3］林彤，欧琳 . 作物物理诱变新技术研究进展［J］. 福建农业科技，
2004，(4) :21 － 22.
［4］黄鹭强，王明兹，李素萍 . 半导体激光对紫球藻生物学效应的影响
［J］. 生物技术，2002，12(1) :14 － 16.
［5］陈必链，王明兹，庄惠如 . 半导体激光对钝顶螺旋藻形态和生长的
影响［J］. 光子学报，2000，29(5) :411 － 414.
［6］庄惠如，陈荣，黄建忠 . 激光辐照对湛江等鞭金藻的复壮作用及机
制研究［J］. 光子学报，2009，3(4) :911 － 917.
［7］张建民，张倩，王相伟 . He － Ne激光辐照海洋微藻的生物学效应的
研究［J］. 应用激光，2008，28(5) :406 － 409.
［8］田燕，庄惠如，黄建忠 . Nd:NAP 激光辐照对雨生红球藻生理效应
的荧光分析［J］. 生物技术，2008，18(3) :26 － 29.
［9］陈冠楠，黄祖芳，陈荣 . 基于激光共聚焦扫描术的亚心形扁藻显微
图像与光谱［J］. 光谱学与光谱分析，2009，29(9) :2330 － 2333.
［10］孙杰，庄惠如，高如承 . 不同激光辐照对盐生杜氏藻生长及 β －
胡萝卜素累积的影响研究［J］. 激光生物学报，2007，16(1) :68 － 73.
［11］梁英，孙世春，魏建功 . 海水生物饵料培养及开发利用［M］. 北
京:中国农业出版社，2003:30 － 32.
［12］Jensen A. Chlorophyll and carotenoids handbook of physiological meth-
ods［A］. In:Hellebust J. A. and Craigie T. S. ed. Physiological and Bio-
chemical Methods［M］. New York:Camhridge University Press，1978，59
－ 70.
［13］张志良，翟伟菁 . 植物生理学实验指导［M］. 北京:高等教育出版
社，2003:57 － l35.
88
2011 年 21(4) 生 物 技 术
［14］LIU Zhi － Yuan，WANG Guang － Ce，ZHOU Bai － Cheng. Effect of i-
ron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris［J］. Bioresource
Technology，2008，99:4717 － 4722.
［15］HUANG Guan － Hua，CHEN Gu，CHEN Feng. Ripid screening method
for lipid production in alga based on Nile red fluorescence［J］. Biomass
and Bioenergy，2009，33:86 － 92.
［16］CHEN Wei，Milton Sommerfeld，HU Qiang. Microwave － assisted Nile
red method for in vivo quantification of neutral lipids in microalgae［J］.
Bioresource Technology，2011，102(1) :135 － 141.
［17］庄惠如，陈必链，卢海声 . 不同激光对雨生红球藻的刺激效应
［J］. 激光生物学报，2000，9(4) :256 － 260.
［18］庄惠如，陈荣，黄建忠 . 激光辐照对湛江等鞭金藻的复壮作用及
机制研究［J］. 光子学报，2009，38(4) :911 － 917.
［19］王明兹，陈必链，庄惠如 . 倍频 ND:YAG 激光对紫球藻生长与胞
外多糖产量的影响［J］. 激光生物学报，2002，11(1) :6 － 9.
［20］Davison P，Hunter C N，Horton P. Overexpression of β － carotene
hydroxylase enhances stress tolerance in Arabidopsis［J］. Nature，2002，
418:203 － 206.
［21］胡章喜，安民，段舜山 . 不同氮源对布朗葡萄藻生长、总脂和总烃
含量的影响［J］. 生态学报，2009，29(6) :3288 － 3294.
［22］李秀波，徐旭东，孔任秋 . 五种微绿球藻产油和产不饱和脂肪酸
的研究［J］. 水生生物学报，2010，34(5) :893 － 897.
产有机酸采油菌的筛选及产酸情况的分析
康宏1，郭艾琳1，马梦彪2，曹凤麟1，李胜贤1，杨光1，王靖然1
(1. 黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080;2. 山东鲁抗生物制造有限公司，山东 济南 272000)
摘要:目的:从大庆油田原油样品中筛选出 2 株产有机酸量较高的菌株，并对其产物进行分析。方法:根据形态特征、生理生
化性质和 16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定，并运用 GC /MS法对发酵液进行分析。结果:经鉴定这两株为枯草芽孢杆菌，菌株
T10 － 3 的发酵液中含有乙酸 11. 407%，异丁酸 9. 375%，丁二醇 79. 217%;菌株 DH －2 － 1 发酵液的中含有异丁酸 41. 56%，丁二
醇 46. 619%，异戊酸 4. 138%，异庚酸 10. 680%。结论:这两株细菌在微生物采油方面均有良好的应用前景。
关键词:微生物采油;16S rDNA;有机酸;气质联仪
中图分类号:Q939. 97 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 04． 111
Screening of Organic Acid Yielding Strain and
Analysis of Result of Producing Organic Acid
KANG Hong1，GUO Ai － lin1，MA Meng － biao2，GAO Feng － lin1，
LI Sheng － xian1，YANG Guang1，WANG Jing － ran1
(1. College of Life Science in Heilongjiang University，Harbin 150080;2. Shandong Lukang Biological Manufacturing Co. Ltd，Ji’nan 272000，China)
Abstract:Objective:Two strains with high production of organic acids were selected from Daqing crude oil samples. Method:The GC /MS
method was adopted to detect the type of the organic acid and organic alcohol with low molecular weight in T10 － 3 and DH － 2 － 1 fermen-
tations. Result:The fermentation of T10 － 3 is composed of acetic acid(11. 407%) ，isobutyric acid(9. 375%) ，butanediol(79. 217%) ;
The fermentation of DH － 2 － 1 is composed of isobutyric acid(41. 56%) ，butanediol(46. 619%) ，isoamyl acid(4. 138%)and enanthic
acid. Conclusion:The two strains which can grow on oil sole carbon source anaerobicly have good prospects in MEOR.
Key words:microbial enhanced oil recovery;16S rDNA;organic acid;gas chromatography － mass spectram
收稿日期:2011 － 01 － 10;修回日期:2011 － 03 － 17
基金项目:黑龙江大学校青年基金项目(“生物表面活性剂产生菌的筛
选及其在三次采油中的应用”，No. QL200724)资助
作者简介:康宏(1977) ，女，硕士，实验师，从事生物工程及微生物采油
等研究，发表论文 10 余篇、教材 1 部，获省市奖 3 项，Email:kanghonghd
@ 163. com。
微生物的代谢产物能产生有机酸或有机醇，溶蚀孔喉中
岩石表面的碳酸盐矿物或无机垢，改善地层渗透性，有利于提
高原油产量［1 － 4］。井下一般为厌氧环境，如果菌株能在厌氧
和好氧环境下均能产酸(醇)则利用价值更高［5，6］。我们筛选
到了 2 株能以原油为唯一碳源、在有氧和无氧环境下均能代
谢产生有机酸，具有厌氧硝酸盐还原能力，不产硫化氢的枯草
芽孢杆菌 T10 － 3 和 DN － 2 － 1 可作为采油菌作进一步的研
究。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种来源
实验采用黑龙江大学生命科学学院微生物三次采油课题
组储存的从大庆油田原油样品中分离的细菌。
1. 1. 2 仪器
pH计:DELTA 320(梅特勒—托利多仪器有限公司) ;气
－质联用仪:6890 /5973N(美国 Agilent公司)
PCR 仪:Eppendorf AG(EPPENDORF) ;凝胶成像系统:
UVP White /ΜLtraviolet Transilluminator(UVP)。
1. 1. 3 培养基
原油培养基:NaCl 0. 5 g /L，MgSO4·7H2O 0. 025 g /L，
(NH4)2 SO40. 1 g /L，K2HPO4·3H2O 1 g /L，KH2PO4 0. 4 g /L，
原油 2 g /L，pH 7. 5，121℃灭菌 15min。
LB液体培养基:胰化蛋白胨 10 g /L，酵母提取物 5 g /L，
NaCl 10 g /L，pH 7. 0，121℃灭菌 20min。
SOC培养基:胰化蛋白胨 0. 5 g /L，酵母提取物 2 g /L，
NaCl 0. 05 g /L，KCl 1mL，MgCl2 0. 5mL(单独灭菌) ，葡萄糖溶
液 2mL。
葡萄糖蛋白胨培养基:蛋白胨 5 g /L，葡萄糖 5 g /L，NaCl
98