全 文 ：第 卷第 期
年 月
激 光 生 物 学 报 丫,
一
一
激光辐照拟微绿球藻的当代生物学效应研究
刘晓娟 , 庄惠如 `, 陈 荣 , , 王 凡
福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心 、生命科学学院 、福建省现代发酵技术工程研究中心
福建 福州 福建师范大学物理与光电信息科技学院 , 福建 福州
摘 要 采用 激光 波长 林 ,功率 ,光束长 辐照拟微绿球藻
,辐照时间为 、 、 ,通过测定藻色素 、多糖 、蛋白质及油脂含量 ,研究 激光对藻的生物学
效应 。结果表明 、 、 辐照条件下 ,对拟微绿球藻细胞生长及代谢产物均有一定的促进作用 ,其中
激光 处理组有利于拟微绿球藻的生长及色素的积累 ,但 剂量下更有利于多糖 、蛋白质及油脂含量
的积累 ,分别比对照组提高了 胞外多糖 , 总多糖 、 、 。
关键词 激光 拟微绿球藻 油脂
中图分类号
文献标识码
文章编号 一 一 习
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收稿日期 刁 一 修回日期 一 一
基金项目 福建省自然科学基金项目
作者简介 刘 晓娟 一 ,女 ,福建龙岩市武平县人 ,硕士研究生 , 主要从事水生生物学研究 。 手机
电子邮箱
通讯作者 庄惠如 一 ,女 ,福建福州人 ,福建师范大学教授 ,硕士 ,主要从事藻类生物学研究 。 电话
电子邮箱 巧
第 期 刘晓娟等 激光辐照拟微绿球藻的当代生物学效应研究
引言
目前 ,我国能源短缺形势严峻 ,石油等化石能源
储备严重不足 ,远不能满足经济和社会高速发展的
需要 ,迫切需要从战略角度发展新的可再生能源 。
利用微藻产油不仅能够缓解能源不足带来的压力 ,
而且还可以达到二氧化碳减排效果 ,是环境友好型
能源 ,是国际上可再生能源的新生力量 。
拟微绿球藻 胡 具有
容易培养 ,繁殖迅速 ,富含 、蛋白质 、维生素等物
质 〕。其中 不仅是水产动物幼体发育必需脂肪
酸之一 ,还能增强水体养殖动物的免疫力 ,提高抗病
力和成活率 “〕。因此 ,它是一种非常重要的海产经
济饵料藻 。有研究发现 ,在 、 含量丰富的培养基
中 ,微拟球藻的总脂含量最高可达 ,因此 ,拟
微绿球藻也是一种极具潜力的能源微藻种类 。
激光作为一种诱变育种的手段 ,具有简单方便 、
效果明显 、无毒 、无污染等优点。激光与生物有机体
相互作用后能产生光 、热效应进而导致生物有机体
的生化性质变化及遗传物质的结构发生改变 ,为激
光诱变育种提供了有利条件 。 激光器在动植物
与微生物诱变育种中的应用比较广泛并已取得令人
瞩目的成果 名。近年来国内藻类学研究者通过不
同的方法来提高藻类产油能力 ,而利用激光诱变来
提高微藻产油能力的研究则尚未见报道 。本文应用
激光辐照拟微绿球藻 ,对辐照产生的生物学效
应进行初步研究 ,为进一步的能源微藻高产藻株的
筛选奠定实验基础 。
材料与方法
藻种及培养基
实验藻种为福建长乐漳港海蚌场提供的 “云微
藻 ” ,该藻种原为上个世纪 年代由福建海域分离
的野生藻株 ,经培养驯化已经成为福建沿海水产养
殖中的主要基础饵料生物 。藻种经福建师范大学生
命科学学院微藻实验室分离纯化鉴定为拟微绿球藻
叩 护 。取天然海水过滤 ,采
用夕 营养盐配方 〔配制培养液 ,经高温灭菌并冷却
后备用 。
激光处理及培养条件
采用型号为 的 激光器 ,波
长 卜 ,光纤端功率 ,光束长 ,经过预
实验初筛确定激光辐照时间 , 、 、 。
取对数生长期藻液 于规格为 的
小称量瓶中 , 激光辐照 。辐照的同时使用磁力
搅拌器 ,使转子匀速转动实现藻液被均匀辐照 。辐
照后立即将藻液接人 三角瓶 ,暗培养一个晚
上后放在控温藻种培养架上静置培养 ,温度为
士 ℃,冷 白荧光灯提供连续光照 , 光强为
一 。培养期间每天摇动 次 。培养一
周后转接到 三角瓶中。整个过程设置空白
对照组 ,各处理组均设 个平行。
生长速率测定
辐照后 ,隔天定时取 藻液 ,用 “血球计数
板 ”进行细胞数目统计 ,根据生长速率计算公式 , 二
一 一 。其中 , 为比生长速率常数
, 、 为培养时间 , 、 为培养 、 天时藻细胞
数目。
色素含 测定
取 藻液于 离心管中 ,用 的丙酮
提取藻细胞的色素 ,分别于 、 、
波长下测其吸光值 。计算公式如下
二 “ 一 晰
二 晰 一 · “
、 。二 , 。一 一
式中 、 为类胡萝 卜素的总浓度 ,单位为
· 一, 、 和 。分别为叶绿体色素提取液
在波长 、 和 。 下的吸光度 。
多糖含 的测定
参照文献 「 ,采用苯酚一浓硫酸法 ,以烘干至
恒重的葡萄糖做标准物 。
蛋白质含 的测定
参照文献「 〕,采用考马斯亮蓝法 ,以牛血清蛋
白做标准物 。
油脂相对含量的测定
有文献报道油脂可用尼罗红荧光标记 ,在激发
波长 一 下 ,油脂 荧光 的发 射波长
。 左右 ”一, 〕。本实验用荧光分光光度计分析经
尼罗红标记后藻细胞油脂的相对含量 ,在激发波长
条件下 ,藻细胞油脂荧光的发射波长确定为
。具体方 法如下 取处 于稳定期 的藻液
, ,加 空白培养基稀释后与 林 尼罗
红染液 岁 溶于丙酮 , 分钟后用荧光光度
计分析 。
结果与分析
, 激光辐照对藻生长的影响
激 物 学撒 儿 生 刊 子 寸仅 第 份光 报
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图 不同剂量 激光处理后藻的生长曲线 油 一 朗
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图 不同剂量 激光处理后藻的色素含量
一 ` 补 。一
,一 、 ,
激光处理 组的叶绿素 和类胡萝 卜素分别比对
照组提高了 , 尸 ,差异极显
著 激光处理 组的叶绿素 和类胡萝 卜素
分别比对照组提高了 , ,
差异极显著 。说明在一定剂量范围内的 激光
可以促进藻类色素含量的提高 ,其中 处理的效
果最好 。
激光对藻多糖含量的影响
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图 不同剂量 激光处理后藻的比生长速率
一
由图 、图 可知 , 激光在一定剂量范围内
对拟微绿球藻的生长均起到不同程度的促进作用 。
其中 激光辐照时间为 时处理效果最好 ,在
第二天时 ,处理组的比生长速率与对照组的比生长
速率区别不大 ,但是当生长到第八天时 , 、 、
处理组的比生长速率分别比对照组提高了
、 、 。
激光对藻色素含量的影响
由图 可知 ,色素的积累和生长曲线呈正相关 ,
对激光辐照后藻的色素含量进行单因素方差分析 ,
得出叶绿素 的 二一 , 二 ,类胡
萝 卜素的 , 二 ,即激光对
叶绿素 和类胡萝 卜素的含量存在极显著影响 。多
重比较表明 激光处理 组的叶绿素 和类
胡萝 卜素分别比对照组提高了 尸 ,
差异不显著 , ,差异极显著
月闷 , 日
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图 不同 量 激光处理后藻的多糖含量
一
从图 一图 发现 , 激光辐照 、 、
均促进细胞生长 ,其中辐照 的效果最好 ,由图
可知辐照 、 、 同样可以促进细胞多糖的
积累 ,但是 处理组却比 处理组更有利于藻
多糖的积累 。对不同剂量处理后拟微绿球藻多糖含
量进 行单 因素 方差 分 析 ,得 出胞 外 多糖 二
, 二 ,总多糖 ,
尸二 ,即不同剂量对藻多糖含量有极显
第 期 刘晓娟等 激光辐照拟微绿球藻的当代生物学效应研究
叫尸卜。祠口的﹄鸽︵卜省。蒸工︶粼米侧攀
著的影响。多重比较表明 辐照组的胞外多糖
和总多糖比对照组分别提高了 ,
尸 ,差异极显著 辐照组比对照组分别
提高了 , 尸 ,差异极显著
辐照组比对照组分别提高了 ,
尸 ,差异极显著 ,此外 ,胞外多糖和总多糖
各处理组之间的差异都是极显著 尸 。
激光对藻蛋白质含量的影响
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目
日
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图 不同剂量 激光处理后藻的油脂含量
图 不同剂量 激光处理后藻的蛋白质含量
一
对激光处理后拟微绿球藻蛋白质含量进行单因
素方差分析 ,得出 二 , 二 一,即
激光对藻蛋白质含量有极显著的影响。多重比较表
明 激光处理后蛋白质含量均有一定提高作用 ,其中
处理组的作用最显著 ,比对照组提高了
尸 ,差异极显著 辐照组比对照组提高
了 ,差异极显著 辐照组比
对照组提高了 尸 ,差异不显著 。除
了对照组与 处理组的差异不显著 ,其它任意两
组之间差异极显著 ,表明 和 激光处理对提
高拟微绿球藻蛋白质含量均具有很明显的作用 见
图 〕。
激光对藻油脂含量的影响
对激光处理后的拟微绿球藻油脂相对含量进行
单因素方差分析 ,得出 二 ,尸二
,即激光处理对藻油脂含量具有显著性的影响 。
多重比较表明 处理组的作用最显著 ,单位体积
细胞的荧光强度比对照组提高 了 尸
, ,差异极显著 辐照组比对照组提高了
,差异极显著 辐照组比对
照组提高了 尸 ,差异极显著 ,并且
各处理组之间的差异也是极显著 尸 。实验
统计结果表明从 到 三个激光剂量对拟微绿
球藻油脂含量的提高均具有很显著的影响 见图
。
讨论
本研究首次采用 激光诱变拟微粒球藻 ,旨
在提高其产油能力。结果表明 激光功率 ,
波长 林 ,光束长为 条件下 , 、 、
三种辐照剂量均能促进拟微绿球藻细胞生长 ,提
高色素 、多糖 、蛋白质及油脂含量 。其中辐照时间为
时最有利于细胞的生长 ,其生长速率比对照组提
高了 尸 ,差异显著 但是代谢物积
累较少 ,而 辐照下 ,虽然细胞生长情况没有
好 ,但积累的胞外多糖 、总多糖 、蛋白质及油脂含量
反而 高于 处 理组 ,分别 比对 照组 提高 了
, , 差 异 极 显 著 、
,差异极显著 、
,差异极显著 。上述结果说明 , 激光促进
藻生长及代谢产物积累的有效剂量是不一致的 ,因
此 ,在诱变育种中 ,综合考虑多方面因素确定适宜剂
量是很有必要的 。王明兹等 ` 〕曾报道激光辐照对
细胞和细胞壁均有一定损伤 ,多糖含量的增加是细
胞防止或减轻照射伤害的一种保护性途径 ,而且照
射还可能引起细胞代谢流及胞壁通透性改变 ,从而
引起多糖含量增加 。等 ” 曾报道盐胁迫会导致
紫球藻多糖浓度的增加 ,由此产生耐盐性的提高 ,并
有利于对其他逆境的适应 。。等 “认为类胡萝
卜素可以保护植物组织免受强光导致的细胞光氧化
破坏 。因此推断 ,当藻处于逆境时 ,类胡萝 卜素的增
加也具有保护光合系统的作用 。本实验中 , 激
光辐照后 ,藻的多糖含量和类胡萝 卜素含量均比对
照组高 ,此结果进一步证实了上述论断 。
︵省二加︶︺。祠叫召口七曰二已切︶和侧仁洲喇
激 光 生 物 学 报微 尤 字 于反 第 卷
展示出激光在能源微藻高产油脂藻株选育中的诱人
前景。
参考文献
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尼罗红 二 、、 是一种嗯嗦类染料 ,专门
用于染脂类物质 ,可直接应用于细胞的检测 ,并能很
好的溶解于细胞脂质中 ,是一种方法简便快速的油
脂标记材料。 年 一 。等 ”〕利用尼罗红
荧光染色法研究了 对小球藻生长和油脂含量
的影响 年 一 。 等一 利用该染色
法快速筛选出一些产油高的藻株 ,并发现重量法和
荧光定量分析油脂含量的方法之间有很高的相关系
数 年 。等 〕用微波协助尼罗红的方
法定量分析了微藻中中性油脂的含量。本研究用尼
罗红标记拟微绿球藻的油脂并用荧光光度计分析藻
细胞油脂的相对含量 ,进一步发现与传统的油脂检
测法相比 ,尼罗红荧光染色法是一种简便快速的有
效方法 。
激光是一种光量子流 ,或称为光微粒 。激光辐
射后可通过产生光 、热 、压力及电磁场效应的综合作
用 ,直接或间接地影响生物有机体 ,从而引起
或 变化 、染色体畸变效应 、酶的激活或抑制 、以
及细胞分裂或细胞代谢活动发生改变。微藻是一种
光能自养的单细胞生物 ,具很强的光敏性 ,一旦遗传
物质发生变异或细胞生理出现变化 ,很快就能获得
表达和体现 ,并且容易被检测到 ,因此在激光诱变育
种中具有很大的便利性 。目前 ,较多应用于生物研
究的激光有 、 和 一 激光等 。赫冬梅 认
为 ,当外界条件发生变化时 ,生物有机体自身可进行
代谢调整 ,以适应外界环境和生长发育的需要 。环
境因素正是通过某些分子机理 ,实现对物质代谢中
相关酶的表达及活性的调控 ,从而影响相关物质的
含量及组成 ,使细胞得以迅速适应环境变化的。本
研究中激光与藻细胞间相互作用的具体机制则还有
待于进一步的深人研究 。
近十年来 ,激光诱变在藻类育种上的应用研究
有所进展 。庄惠如 等用 激光对长期保
存的湛江叉鞭金藻进行诱变 ,研究激光对藻生长和
生理生化特性的影响 ,并探讨了激光复壮藻种的可
能机制 。陈必链 。〕等用 一 、倍频 、半导
体激光等对钝顶螺旋藻进行辐照 ,对于藻体形态和
色素含量等均出现促进或抑制作用 ,具有明显的诱
变效应 。黄鹭强 ” 等用半导体激光对紫球藻进行
辐照 ,发现激光对紫球藻细胞干重 、胞外多糖产量均
有不同程度的促进作用 。本研究选择拟微绿球藻为
材料 ,经一定剂量 激光辐照后 ,发现藻细胞在生
长及油脂等代谢产物积累上均有明显提高 ,进一步
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吴瑞珊 , 魏东 盐度及其凋节方式对眼点拟微球藻的 长和
积累的影响匕 现代食 , 科技 , , 一 ,
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魏东 , 张学成 , 隋正红 , 等 氮源和 对眼点拟微绿球藻
的生长 、总脂含量和脂肪酸组成的影响 〔 〕 海洋科学 、
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郝丽珍 , 侯喜林 , 袁德正 , 等 激光对茄子种子发芽指
标的影响及其数学模拟 〕 激光生物学报 , ,
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张建东 , 陈怡平 , 张晋豫 , 等 激光对玉米种子萌发及
幼苗生长发育的影响 〕 激光技术 , ,
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王昆林 , 任兆鸿 , 徐卫华 , 等 激光诱变滇糯稻诱变剂
量的筛选及其效应研究 〕激光杂志 , ,
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胡卫红 , 陈有为 , 李绍兰 , 等 激光辐照对酿酒酵母菌
的诱变作用 〔 〕 微生物学通报 , , 一
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李佳 , 刘鑫 , 李克武 , 等 激光辐照总状毛霉发酵产蛋
白酶优化条件 〕激光技术 , , 一
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第 期 刘晓娟等 激光辐照拟微绿球藻的当代生物学效应研究
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赫冬梅 , 段舜山 代谢调控在微藻油脂积累中的作用 〔 〕
生态科学 , , 一
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庄惠如 , 陈荣 , 黄建忠 , 等 激光辐照对湛江叉鞭金藻的复
壮作用及机制研究 〕光子学报 , , 习
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陈必链 , 王明兹 , 庄惠如 , 等 半导体激光对顿顶螺旋藻形
态和生长的影响 〕光子学报 , ,
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黄鹭强 , 王明兹 , 李素萍 , 等 半导体激光对紫球藻生物学
效应的影响 〔 生物技术 , , 一 一 ,
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〔 梁英 , 孙世春 魏建功 海水生物饵料培养及开发利用
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「川 张志良 , 翟伟着 植物生理学实验指导 〔 〕北京 高等教
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