全 文 ： 2010, Vol. 31, No. 17 食品科学 ※基础研究186
坛紫菜不同溶剂组分的抗氧化活性
赵国玲 1，刘承初 1 ,*，谢 晶 1，李应森 2，李家乐 2 ,3
(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，
上海 201306；3.上海市高等学校水产养殖学 E-研究院，上海 201306)
摘 要：为研究坛紫菜酚类化合物的抗氧化活性，通过提取和萃取得到坛紫菜 4种溶剂组分：石油醚、乙酸乙酯、
正丁醇和水溶性组分，对其DPPH自由基清除率和还原力大小进行比较，并研究其中多酚和黄酮类化合物的分布。
结果表明：4种溶剂组分在 0.2～1.5g/L质量浓度范围内与抗氧化活性均存在显著剂量效应关系，其DPPH自由基清
除率和还原力大小均为：乙酸乙酯＞正丁醇＞石油醚＞水溶性组分。在质量浓度为 1.5g/L时，乙酸乙酯组分的还
原力吸光度为 1.97，大于 80%茶多酚(1.90)，接近于 BHT(2.00)。对多酚类化合物和黄酮类化合物而言，同样是
在乙酸乙酯组分中分布最多(分别为 69.84mg GAE/g md和 299.49mg RE/g md)，在水溶性组分中最少(分别为 11.1mg
GAE/g md和 32.36mg RE/g md)，因此酚类化合物主要分布在中等极性溶剂中，而不是强极性溶剂中。研究还发现，
1g/L坛紫菜 4种溶剂组分的多酚类化合物含量与DPPH自由基清除率、还原力间的相关系数为：r =0.9311和 r=0.7530，
而黄酮类化合物含量与DPPH自由基清除率、还原力间的相关系数为 r=0.8899和 r=0.7211，可见坛紫菜多酚类化合
物为其抗氧化的主要活性成分。
关键词：坛紫菜；抗氧化；D P P H 自由基；还原力；多酚类化合物含量；黄酮类化合物含量；相关性
Antioxidant Effects of the Soxhlet Extraction Product from Porphyra haitanensis and Its Different
Solvent-soluble Fractions
ZHAO Guo-ling1，LIU Cheng-chu1,*，XIE Jing1，LI Ying-sen2，LI Jia-le2,3
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；
2. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education,
Shanghai 201306, China；3. Aquaculture Division, E-Institute of Shanghai Universities, Shanghai 201306, China)
Abstract：The Soxhlet extraction product from Porphyra haitanensis was fractionized according to solubility difference in
different solvents into petroleum ether (PE)-soluble fraction, ethyl acetate (EA)-soluble fraction, n-butanol-soluble fraction and
water-soluble, and the extraction product and its fractions were tested and compared for their DPPH radical scavenging capacity
and reducing power and their contents of total polyphenols and total flavonoids were also determined. All these fractions had an
antioxidant effect in a significant dosage-dependent manner in the range of 0.2 to 1.5 g/L and the EV-soluble fraction exhibited the
highest ranking for both DPPH radical scavenging capacity and reducing power and followed by the n-butanol-soluble fraction,
the PE-soluble fraction and the water-soluble fraction. The EA-soluble fraction at a concentration of 1.5 g/L exhibited a
reducing power absorbance of 1.97, which was higher than that (1.90) of 80% tea polyphenols, a commercial product and
close to that (2.00) of BHT. Likewise, the EV-soluble fraction ranked first for both the contents of total polyphenols (69.84 mg
GAE/g dry weight) and total flavonoids (299.49 mg RE/g dry weight), and the water-soluble fraction last, with a total polyphenol
content of 11.1 mg GAE/g dry weight and a total flavonoid content of 32.36 mg RE/g dry weight. Therefore, phenolics are mainly
distributed in mid-polarity solvents rather than high-polarity ones. Moreover, the contents of total polyphenols and total
flavonoids of the Soxhlet extraction product and its four fractions were linearly plotted against their DPPH radical scavenging
capacities or reducing power at 1 g/L, respectively, and the results showed that correlation coefficients were 0.9311 and 0.7530
收稿日期：2010-06-20
基金项目：上海高校创新团队建设项目；上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)
作者简介：赵国玲(1986—)，女，硕士研究生，主要从事海洋生物资源利用研究。E-mail：ziziguoling@126.com
* 通信作者：刘承初( 1 9 6 5 —)，女，教授，博士，主要从事海洋生物资源利用、营养与食品安全研究。
E-mail：chengchuliu@yahoo.com
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紫菜是世界上经济价值最高的大型海藻之一，自
2003年来，仅中国、日本、韩国 3 国的紫菜年产值就
超过了 20亿美元，其中至 2006年底我国坛紫菜养殖面
积近 1.7万 hm2，年产干品紫菜超过 4万 t，产量已占全
国紫菜产量的 80%以上[1]。坛紫菜(Porpyra haitanensis)
是我国特有的栽培品种，隶属红藻门、原红藻纲、红
毛菜目、红毛菜科、紫菜属，主要养殖于福建、浙
江和广东等长江以南地区，而长江以北多为条斑紫菜
(Porphyra yezoeniss )。同时，坛紫菜是一种高蛋白
(34.48 %～37.21%)、低脂肪(0.5%～2.09%)、富含多种矿
物质和膳食纤维且味道鲜美的天然食品。除此之外，坛
紫菜还富含VC(12.1%)和胡萝卜素(1.87%)、叶绿素 a、类
胡萝卜素等[2-3]。对于其含有的具有生物活性的物质，报
道较多的有R-藻蓝蛋白[4]、藻胆蛋白[5-6]、紫菜硫酸多糖[7-8]
等，但是对酚类化合物的研究相对较少。
酚类化合物是一类以苯酚为基本骨架，苯环的多羟
基取代为特征的化学物质的统称，从低分子质量的简单
酚类到分子质量大至数千道尔顿的单宁类，是自然界来
源最丰富的次生代谢产物之一，仅次于纤维素、半纤
维素和木质素[9]。抗氧化是酚类化合物最重要的性质之
一，由于酚类化合物分子中含有一个或多个极易被氧化
的酚羟基，使酚类化合物具有很强的抗氧化和清除自由
基的能力，可保护机体免受自由基和过氧化物产物的损
伤。此外海藻类多酚还有抗菌、抗肿瘤、调节血脂及
化学防御等多种生理功效[9-11]，已逐渐成为当前酚类化
合物领域的研究热点，其优异的抗氧化特性在食品抗氧
化剂、防腐剂和天然药物开发方面也具有重要意义。
目前国内外对海藻多酚及其抗氧化活性的研究主要
集中在鼠尾藻、马尾藻和海黍子等褐藻上 [ 1 2 -1 4 ]，即使
是作为重要经济海藻之一的红藻，也仅有零星的关于
松节藻[1 5]和条斑紫菜的报道[1 6]，而对坛紫菜多酚的研
究尚未见报道。为了弥补此空白，本实验对坛紫菜不
同溶剂组分的抗氧化活性(还原力、DPPH 自由基清除
率和油脂过氧化抑制率)和酚类化合物的含量(总多酚和
总黄酮)进行比较，并通过两者间的相关性分析来揭示
酚类化合物在抗氧化过程中所发挥的作用，以期为坛
紫菜的进一步加工利用和天然食品抗氧化剂及天然药物
的开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
坛紫菜(Porphyra haitanensis)购自昆山一弘藻业有
限公司，采自福建宁德海域，采收时间为 2009年 3月。
Folin- Ciocalteau试剂 上海荔达有限公司；没食子酸
(GA)、芦丁 上海伯奥科技生物公司；DPPH 东京化工株式
会社；2,6-二叔丁基对甲酚(BHT) 国药集团上海试剂公司；
80%茶多酚 浙江省茶科院茶学研究所；以上药品均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HR2860搅拌机 珠海飞利浦家庭电器有限公司；
CR21G型高速冷冻离心机 东京日立公司；RE-52型旋
转蒸发仪 上海青浦沪西有限公司；SHA-B型恒温水浴
摇床 常州国华电器有限公司；752N型紫外分光光度计
上海精密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 坛紫菜不同溶剂组分的制备
称取 50g过 20目筛的坛紫菜置于索氏提取器中，用
500mL的 80%乙醇溶液提取 6h，倒出提取液后，再重
复提取 1 次。合并两次提取液，并真空浓缩至干，得
到 6.05g粗提物，然后用 90%乙醇溶液完全溶解后，用
100mL的石油醚萃取 3次，其中水相部分真空浓缩至浸
膏状，用 200mL的蒸馏水完全溶解并继续用 100mL的乙
酸乙酯和正丁醇各萃取 3次[17 ]，制备流程如图 1所示。
图 1 坛紫菜不同溶剂组分的制备
Fig.1 Flow chart for the preparation and fraternization of the Soxhlet
extraction product from Porphyra haitanensis
坛紫菜(50g)
索氏提取(80%乙醇，6h，两次)
粗提物(6.05g)
石油醚(PE)萃取，3次
PE组分(2.47g) 非 PE组分
乙酸乙酯(EA)萃取，3次
EA组分(0.18g)非EA组分
正丁醇萃取，3次
正丁醇组分(0.70g) 水溶性组分(1.97g)
for the relationship between total polyphenol content and DPPH scavenging capacity or reducing power and 0.8899 and 0.7211
for the relationships between total flavonoid content and DPPH scavenging capacity or reducing power, respectively. Based on
these investigations, it can be concluded that polyphenlics mainly contribute to the antioxidant effect of Porphyra haitanensis.
Key words：Porphyra haitanensis；anti-oxidation；DPPH；reducing power；total polyphenol content；total fla-
vonoid content；correlation
中图分类号：TS254.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)17-0186-06
2010, Vol. 31, No. 17 食品科学 ※基础研究188
1.3.2 不同溶剂组分抗氧化活性的测定
1.3.2.1 DPPH自由基清除率的测定
参照文献[18]，取 4种组分不同浓度的提取液 3mL，
加入 3mL DPPH溶液(0.2μmol/L)混合均匀，室温避光
30min后于波长 517nm处测定吸光度。并用相同质量浓
度的 BHT和 80%茶多酚作对比，每份样品平行操作 3
次，DPPH 自由基清除率按式(1)计算。
清除率 /%=[(AControl－ ASample)/AControl]× 100 (1)
式中：AControl为 DPPH溶液与 80%乙醇溶液混合后
的吸光度；ASample为DPPH溶液与海藻提取液混合后的吸
光度。
1.3.2.2 还原力的测定
测定原理[18]：VC和多酚物质将K3Fe(CN)6还原，再
和 Fe3+形成普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)]，根据普鲁士蓝生成
量作为还原力大小的指标，颜色越深，还原力越大。
提取液中还原力的测定：移取不同样品提取液 1mL
至 50mL离心管中，然后加入2.5mL磷酸缓冲溶液(0.2mol/L，
pH6.6)和 2.5mL 1g/100mL的铁氰化钾溶液，混合均匀，
50℃水浴40min后，加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸溶
液，于 5000r/min离心 10min。取上清液 5mL，加入 5mL
蒸馏水和 1mL 0.1g/100mL三氯化铁溶液，混合均匀，室
温下反应 10min，于波长 700nm处测吸光度[19]。用相同
质量浓度的 BHT和 80%茶多酚作对比，每份样品平行
操作 3 次。
1.3.3 不同溶剂组分多酚类化合物含量的测定
1.3.3.1 多酚类化合物含量的测定
标准曲线的绘制：吸取没食子酸标准液(0.1mg/mL)
0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于 10mL
比色管中，再加入 1mL Folin-Ciocalteau试剂(已稀释 1
倍)，摇匀后再加入 4mL 7.5g/100mL Na2CO3溶液，定
容至 10mL，于 40℃水浴反应 40min后在波长 765nm处
测定其吸光度，绘制标准曲线[20]。得回归线性方程为：
Y = 0.0982X＋ 0.0792，式中：X为没食子酸终质量浓
度 /(μg/mL)；Y为吸光度，R2=0.9916，线性关系较好。
提取液中多酚类化合物含量的测定：移取待测提取
液 1mL于 10mL比色管中，依次加入 1mL Folin- Ciocalteau
显色剂及4mL 7.5g/100mL Na2CO3溶液并定容，反应40min
后测定吸光度，根据标准曲线计算多酚类化合物的没食
子酸当量(gallic acid equivalents，GAE)，计算公式如下：
GAE=(Y×10×n)/(m×1000) (2)
式中：Y为从标准曲线上获得的与样品吸光度对应
的 GA含量 /(μg/mL)；n为提取液稀释倍数；m为提取
组分质量 / g。
1.3.3.2 黄酮类化合物含量的测定
标准曲线的绘制[21]：分别取芦丁标准液(0.1mg/mL)
0、0 . 5、1 . 0、2 . 0、3 . 0、4 . 0、5 . 0、6 . 0、7 . 0m L，
并加入 5g/100mL 亚硝酸钠 0.5mL，混匀，静置 6min，
各加入 10g/100mL硝酸铝溶液0.5mL，混匀并静置6min；
后加入 4g/100mL氢氧化钠溶液 5mL，用 80%乙醇定容
至 15mL，静置 15min后于波长 510nm处测定吸光度，得
回归线性方程为：Y＝ 0.013X－ 0.014；式中：X为芦
丁终质量浓度 /(μg/mL)，Y为吸光度，R2＝ 0.998，线
性关系较好。
样品提取液中黄酮含量的测定：取 2mL提取液，操
作如上，于波长 510nm处测定吸光度。最后黄酮含量用
芦丁当量(rutin equivalents，RE)来表示，计算公式为：
RE=(Y×n)/(m×1000) (3)
式中：Y为从标准曲线上获得的与样品吸光度对应
的芦丁含量 /(μg/mL)；n为提取液稀释倍数；m为提取
组分质量 / g。
图 2 没食子酸标准曲线
Fig.2 Standard curve of gallic acid
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
A
76
5n
m
没食子酸质量浓度 /(μg/mL)
0 2 4 6 8 10 12 14
图 3 芦丁标准曲线
Fig.3 Standard curve of rutin
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
A
51
0n
m
芦丁质量浓度 /(μg/mL)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
1.3.4 数据处理
所有的数据结果均来自于 3个独立平行样，用 x± s
表示，采用Original 8.0 软件及其 one-way ANOVA Fisher
LSD方法进行数据分析和显著性分析(P＜ 0.05)，并采用
Microsoft Excel 2003直观分析和图形处理。
2 结果与分析
2.1 不同溶剂组分的得率
189※基础研究 食品科学 2010, Vol. 31, No. 17
图 5为不同溶剂组分清除DPPH自由基的质量浓度
变化趋势。可以看出，坛紫菜 4种溶剂组分对DPPH自
由基清除率活性大小为：EA＞正丁醇＞ PE＞水溶性组
分。可见抗氧化物质主要分布在中等极性溶剂中，在
强极性溶剂中分布最少。
坛紫菜多酚类化合物对 DPPH 自由基的清除活性
与质量浓度呈现较好的量效关系，尤其是在质量浓度
0.2～1g/L范围内；但在 1～1.5g/L范围内时，随着质量
浓度的增加，其对 D PPH 自由基的清除效果增幅不明
显。在 1.5g/L时，乙酸乙酯和正丁醇组分对DPPH自由
基的清除率可达到 89 . 05% 和 87 . 6%，接近于茶多酚
(91 .34%)、和 BH T(96.26%)。此结果与Wang等[15]报
道的红藻多酚清除DPPH自由基的结论较为接近：其 EA
组分在 50mg/L时，对DPPH自由基的清除率达到了 95%
接近于没食子酸(96%)和抗坏血酸(97%)，远远大于BHT
(63%)。
2.2.2 还原力的大小
在众多抗氧化机制中，还原力是一个重要的指标，
其强弱反映内源性抗氧化活性的变化[19]。用 FRAP法测
定的还原力结果如图 6所示。可以看出，坛紫菜 4种溶
剂组分中，还原力大小依次为：EA ＞正丁醇＞ PE ＞
水溶性组分，顺序与 DPPH自由基清除率的结果相同。
而且坛紫菜不同溶剂组分还原力大小在质量浓度 0.2～
1.5g/L范围内呈现了较好的量效关系，在 1.5g/L时，EA
组分还原力最高，吸光度大小可达到 1 . 9 7，大于茶
多酚(1.90)，接近于BHT(2.00)。Ganesan等[22]对印度鱼
栖苔的研究表明，EA 组分还原力活性最高，并呈现较
好的浓度剂量效应，浓度越大还原力越高。
2.3 不同组分中酚类化合物的分布
多酚类化合物中儿茶素、酚酸、单宁等多酚类和
黄酮类物质是研究较多的 JUYOU抗氧化活性的物质。另
外，酚类还具有抑菌、抗炎等多重生物活性，可能和
抗氧化机理也有一定的联系。因此，用 Folin-酚法和亚
硝酸钠法测定的不同溶剂组分中总多酚含量和总黄酮含
量的结果见表 1。
图 5 坛紫菜不同溶剂组分对 DPPH 自由基的清除效果
Fig.5 DPPH radical scavenging activities of the Soxhlet extraction
product from Porphyra haitanensis and its fractions
100
80
60
40
20
0
BHT
茶多酚
EA
正丁醇
粗提物
PE
水溶性
D
PP
H
自
由
基
清
除
率
/%
组分质量浓度 /(g/L)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
图 4 坛紫菜不同溶剂组分的得率
Fig.4 Yields (%) of the Soxhlet extraction product from Porphyra
haitanensis and its fractions
14
12
10
8
6
4
2
0
组
分
得
率
/%
石油醚 乙酸乙酯 正丁醇 水溶性 粗提取物
从图 4可以看出，得率最高的是石油醚(PE)组分为
4.94%，其次是水溶性组分为 3.94%和正丁醇组分 1.40%，
最低的为乙酸乙酯(EA)组分为 0.36%；而粗提取物的总
得率为 13.10%。
2.2 不同溶剂组分的抗氧化活性
2.2.1 对DPPH自由基的清除率
图 6 坛紫菜不同溶剂组分的还原力大小
Fig.6 Reducing power of the Soxhlet extraction product from
Porphyra haitanensis and its fractions
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
BHT
茶多酚
EA
正丁醇
粗提物
PE
水溶性
A
70
0n
m
组分质量浓度 /(g/L)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
注：同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜ 0.05)。
溶剂组分 多酚类化合物含量 /(mg GAE/g md) 黄酮类化合物含量 /(mg RE/g md)
粗提物 51.03± 1.74b 127.30± 2.52b
P E 19.56± 0.05c 47.79± 0.58d
EA 69.84± 1.45a 299.49± 3.41a
正丁醇 20.26± 0.50c 74.87± 2.87c
水溶性 11.1± 0.29d 32.36± 1.53e
表 1 坛紫菜不同溶剂组分的多酚和黄酮类化合物含量 (x ± s，
n=3)
Table 1 Contents of total polyphenols and total flavonoids of the
Soxhlet extraction product from Porphyra haitanensis and its fractions
(x ± s，n=3)
2.3.1 多酚类化合物含量
坛紫菜不同溶剂组分中多酚类化合物分布存在显著
差异(P＜0.05)，含量最高的是EA组分，为69.84mg GAE/
g md，其次为正丁醇组分，为 20.26mg GAE/g md，最
低为水溶性组分，仅为 11.1mg GAE/g md。Li等[23]发现
2010, Vol. 31, No. 17 食品科学 ※基础研究190
从图 7可以看出，在坛紫菜不同溶剂组分(粗提物、
PE、EA、正丁醇和水溶性)质量浓度为 1g/L时，不同
溶剂组分中多酚类化合物含量与DPPH清除率、还原力
间的相关系数分别为 r=0.9311和 r=0.7530，黄酮类化合
物含量与 DPPH自由基清除率、还原力间的相关系数
分别为 r=0.8899和 r=0.7211。因此与黄酮类化合物相
比，多酚类化合物可能是抗氧化过程中发挥主要作用的
物质。尤其是多酚中具有多重生物活性的儿茶素、酚酸
和单宁等物质，均可能是贡献抗氧化活性的重要成分。
这个结论与Antonio等[24]的 4种大型海藻的总酚含
量与其抗氧化活性呈显著相关的研究一致。而 Li等[23]报
道极地雪地衣藻等 23种微藻溶剂组分中多酚和抗氧化活
性间的关系为 R2=0.0075～0.5851，其中 EA组分相关性
最高。这个差异可能是由微藻和大型海藻活性成分构比
差异造成的。
3 结 论
坛紫菜 4种不同溶剂组分质量浓度和DPPH自由基
清除率、还原力在 0.2～1.5g/L范围内具备良好的剂量效
应关系，其中抗氧化活性最高的为乙酸乙酯和正丁醇组
分，水溶性组分最低。有趣的是，不同溶剂组分中的
多酚类化合物含量和黄酮类化合物含量分布同抗氧化活
性基本一致，乙酸乙酯组分最高，其次是正丁醇组分，
因此坛紫菜提取物中主要抗氧化的多酚类物质为中等极
性。同时通过对坛紫菜多酚类化合物与抗氧化活性相关
性的分析，揭示了多酚在抗氧化过程中发挥比黄酮更重
要的作用，这可能与其结构的差异有关。
质量浓度为 1.5g/L时，乙酸乙酯组分的还原力和抗
氧化剂BHT和茶多酚没有显著差异(P＜ 0.05)，显示了
坛紫菜多酚类化合物在食品抗氧化、天然药物和化妆品
等领域具有较好开发前景。而且在所有组分中石油醚组
分的得率最高(4.94%)，为乙酸乙酯组分(0.36%)的 13.7
倍，亦显示了良好的研究前景，但是不同组分中多酚
种类和结构尚需进一步研究。
参 考 文 献 ：
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图 7 坛紫菜不同溶剂组分抗氧化活性和多酚 (a)、黄酮 (b)类化合
物含量的线性关系
Fig.7 Linear plots of the contents of total polyphenols and total
flavonoids of the Soxhlet extraction product and its four fractions
versus their DPPH radical scavenging capacities and reducing power
100
80
60
40
20
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2D
PP
H
自
由
基
清
除
率
/%
黄酮类化合物含量 /(mg RE/g md)
0 100 200 300
r=0.8899
r=0.7211
DPPH自由基清除率
还原力
A
700nm
b
100
80
60
40
20
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2D
PP
H
自
由
基
清
除
率
/%
多酚类化合物含量 /(mg GAE/g md)
0 20 40 60 80
r = 0.9311
r = 0.7530
DPPH自由基清除率
还原力
A
700nm
a
23种微藻中己烷组分中多酚类化合物含量普遍较高，其
次为 EA 组分，最后为水溶组分。因此，多酚类化合物
质在非极性和中等极性溶剂中分布要多于强极性溶剂中。
且从表 1和图 5可以看出，多酚类化合物含量高的
组分，在质量浓度在 0.5～1.5g/L范围内时其DPPH自由
基清除率和还原力也高。
2.3.2 黄酮类化合物含量
同样，在坛紫菜黄酮类化合物的最高分布也是在
EA组分中，为 299.49mg RE/g md，其次为正丁醇组分
(74.87mg RE/g md)和 PE组分(47.79mg RE/g md)，水溶性
组分中的黄酮类化合物含量最低，为 32.36mg RE/g md，
呈现了同多酚类化合物类似的分布。
2.4 多酚类化合物和抗氧化活性的关系
很多研究表明，抗氧化活性高低和多酚类化合物含
量的多少有良好的相关性，但抗氧化活性还和多酚类化
合物的类型有关[11,13,15]。图 7展示了多酚类化合物和黄酮
类化合物对抗氧化活性的贡献。
191※基础研究 食品科学 2010, Vol. 31, No. 17
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