全 文 ：白黎芦醇（resveratrol，RE）属于植物性雌激素，具
有类雌激素和抗雌激素活性的双重作用[1]，具有组织
特异性，同时也发现RE对一些肿瘤有预防和治疗作
用[2]。GH3细胞是大鼠的垂体瘤细胞系，可分泌垂体泌
乳素（PRL）和生长激素（GH），雌激素可诱发GH3细
胞发生一系列生物学反应[3]。因此，我们选用GH3细胞
作为研究对象，研究RE对GH3细胞增殖和PRL合
成分泌的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 GH3大鼠垂体腺瘤细胞株（引自中
国医学科学院基础所细胞中心）；HamsF10培养基
（Gibco），内含热灭活的 15%马血清和 2.5%胎牛血
清，5U/ml青霉素，5μg/ml链霉素。细胞常规在37℃、
5%CO2、100%湿度的孵箱中培养。实验前在倒置显微
镜下观察，取形态良好，对数生长期细胞，换无血清无
酚红HamsF12培养基（Gibco）培养。细胞贴壁24h
后给药，分别加入RE（Sigma）和 17β-雌二醇（E2，
Sigma），或两者合用，继续培养6h或3d后检测各项
指标。
1.2 细胞增殖检测 在给药6h或3d后检测细胞的
生长情况，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色分析法。
1×105个/ml细胞接种于96孔培养板内，200μl/孔。
药物作用后加5mg/mlMTT，20μl/孔，继续培养4h，
去上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200μl，震荡
10min，在Bio-Rad550酶标仪上490nm波长处测定
各孔吸光度值（A490nm值），计算变化率，变化率（%）
=（试验组A490nm值/对照组A490nm值）×100%。每组试
验重复3次，取平均值进行计算。
白黎芦醇对GH3细胞增殖和PRL合成的影响
王 超 1，胡志强 2，初 明 1，程 玉 1，杨孔宾 1，李守巍 1，胡恩喜 1
（1.哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科，黑龙江 哈尔滨 150001；2.北京世纪坛医院神经外科，
北京 100038）
摘要：目的 探讨白黎芦醇对垂体腺瘤GH3细胞增殖和泌乳素合成的影响，及其对雌激素的拮抗作用。方法 在无血清无酚红的培
养条件下，白黎芦醇单独或与雌二醇联合作用于GH3细胞，用MTT法测定细胞增殖，用免疫荧光法、RT-PCR和Western印迹法测
定泌乳素的表达情况。结果 白黎芦醇对GH3细胞增殖具有刺激和抑制双相作用，呈时间-剂量依赖性。并且白黎芦醇使GH3细胞
中PRL阳性细胞比例下降。同时，白黎芦醇抑制泌乳素的合成。白黎芦醇对雌二醇诱发的细胞增殖和泌乳素合成均有拮抗作用，但
对泌乳素合成的拮抗作用较强，而雌二醇刺激细胞增殖作用较其诱发泌乳素合成作用强。结论 白黎芦醇对GH3细胞增殖和泌乳
素合成均有抑制作用，从两方面发挥着抗肿瘤作用。
关键词：垂体肿瘤；白黎芦醇；催乳素；细胞增殖
中图分类号：R736.4 文献标识码：A 文章编号：1009-122X（2006）04-0160-04
EfectsofresveratroloncelgrowthandprolactinsynthesisinculturedratGH3cels
WANGChao1,HUZhiqiang2,CHUMing1,etal
1.DepartmentofNeurosurgery,FirstAfiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China;2.DepartmentofNeurosurgery,
ShijitanHospital,Beijing100038,China
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheefectsofresveratrolonthecelproliferation,thesynthesisofprolactin(PRL)anditsantiestrogenic
propertiesinGH3celofpituitaryadenomarat.MethodsGH3celsweretreatedwithresveratrol,oracombinationofresveratroland17
[beta]-estradiol(E2)inserum-free,phenolred-freemedia.ThecelproliferationwasassessedbytheMTTassay.PRLexpressionwas
examinedusingimmunocytochemistry,RT-PCR,Westernblotanalysis.ResultsResveratrolshowedabidirectionalefectsstimulatingand
inhibitingproliferationofGH3celswithatime-doseresponseanddecreasedthepercentageofPRL-positivecelsinGH3cels.Furthermore,
expressionofPRLgenewassuppressedbyresveratrol.ResveratrolinhibitedcelproliferationandPRLsynthesisinducedbyE2,andits
inhibitiononE2-inducedPRLsynthesiswasmoresensitivethanitssuppressiononE2-inducedproliferation.Onthecontrary,thePRL
responsewasmoresensitivetoE2thantheproliferationresponsetoE2inGH3cels.ConclusionThesefindingsindicatethatresveratrol,an
antiestrogen,exertsitsantitumorefectonGH3celsintwoways—bysuppressionofcelgrowthandbycausingadecreaseofPRLsynthesis.
Keywords:pituitaryneoplasms;resveratrol;prolactin;celproliferation
收稿日期：2006-01-16；修回日期：2006-03-04
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30370516）；黑龙江省青年科
学技术专项资金（QC05C32）
作者简介：王超（1975-），男，山东平度市人，医学博士，哈尔滨医科大
学附属第一医院主治医师。研究方向：垂体瘤的诊断和治疗
·实验研究·
中国微侵袭神经外科杂志（CMINSJ），2006，11（4）160· ·
图1 RE对GH3细胞增殖的影响与对照组比较，①P<0.01；
②P<0.01
注：①与对照组比较，P﹤0.01
表1不同浓度RE对GH3细胞组成的影响（%）
PRL+/GH+细胞 GH+细胞 PRL-/GH-细胞
对照组 9.2±0.6 73.5±2.1 17.3±1.4
0.1μmol/LRE 9.1±0.4 73.9±1.6 17.0±0.6
0.5μmol/LRE 9.3±0.1 73.7±0.6 17.0±1.0
1.0μmol/LRE 9.2±0.4 73.4±2.1 17.4±0.7
10μmol/LRE 7.6±0.7① 75.2±1.6① 17.2±0.2
20μmol/LRE 7.4±0.1① 75.3±0.9① 17.3±0.7
50μmol/LRE 6.2±0.8① 75.7±1.8① 17.1±1.0
组 别
1.3 免疫荧光标记 将涂有0.01%多聚赖氨酸的盖
玻片置入培养板内，使GH3细胞在其上生长。药物作
用完毕后取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，滴加第一个
一抗猴抗鼠GH抗体（Chemicon，工作浓度1∶500），
室温孵育1h，PBS洗片3次。再加入第二个一抗兔抗
鼠PRL抗体（SantaCruz，工作浓度1∶1000），室温孵
育1h，PBS洗片3次。然后加入TRITC标记的羊抗
猴IgG抗体（Sigma，工作浓度1∶100）混合液和FITC
标记的鸡抗兔 IgG抗体（Sigma，工作浓度1∶100），
室温孵育 30min。然后在激光共聚焦显微镜（Carl
Zeiss）下观察并拍照。
1.4 RT-PCR技术检测 GH3细胞中 PRLmRNA水
平 以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，行
RT-PCR技术检测。参考文献设计引物[4，5]，PRL上游
引物：5-CCTGAAGACAAGGAACAAGCC-3；下游
引物：5-TGGGAATCCCTGCGCAGGCA-3。扩增片
段长度344bp。逆转录反应按试剂盒（Invitrogen）说
明书操作。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳后照相。照片
经凝胶图像分析系统分析，PCR产物量=吸光度×面
积。结果以PRL和GAPDH的PCR产物量比值表示。
同时设对照组的相对比值为1。每组试验重复三次，取
平均值进行计算。
1.5 Western印迹法 药物作用完毕后，冰上加入
RIPA裂解液裂解细胞。12000rpm，4℃离心 15min
去除细胞碎片后，留取上清，取少量上清用考马斯亮
蓝法测定蛋白质含量。取含30μg蛋白的细胞裂解液
进行SDS-PAGE电泳，蛋白转移至PVDF膜上。2%牛
血清白蛋白室温封闭过夜，TBS-T洗涤液（10mmol/L
Tris-HCl，pH7.4，150mmol/LNaCl，1%Tween-20）
洗膜 4次，每次 5min。加入一抗兔抗鼠 PRL抗体
（SantaCruz，工作浓度1∶200），以β-肌动蛋白作为
内参照，于4℃条件下孵育过夜，再加入二抗（辣根过
氧化物酶结合的抗体，Amersham，工作浓度1∶1000），
室温下摇动1h，洗膜。用ECL（Amersham）化学发光
试剂盒检测杂交信号，用quantityone软件测量条带
的灰度,再以内参照β-肌动蛋白的灰度值为基础，测
定各组的相对比值。同时设对照组的相对比值为1。每
组试验重复3次，取平均值进行计算。
1.6 统计学处理 实验数据均以均数±标准差表示，
运用方差分析、Studentstest、χ2检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 RE对GH3细胞增殖的影响（图1） RE作用
于GH3细胞6h，各浓度均可抑制GH3细胞增殖，并
呈剂量-效应关系。但当RE作用GH3细胞3d时，RE
对增殖的影响呈双相性改变，在较低浓度（0.1～
1μmol/L）时刺激增殖，A490值约为对照组的2～3倍。
而在较高浓度（10～50μmol/L）时抑制增殖，A490值约
为对照组的1/2，50%抑制浓度约为10～20μmol/L。
GH3细胞由不同的细胞亚型构成：①只分泌GH
的GH+细胞；②只分泌PRL的PRL+细胞；③同时分
泌GH和PRL的GH+/PRL+细胞；④不分泌任何激素
的GH-/PRL-细胞[6]。对照组GH3细胞在无血清无酚
红的条件下培养 3d，可观察到（图 2）：GH+/PRL+细
胞、GH+细胞和GH-/PRL-细胞，未检测到只分泌PRL
的PRL+细胞。在同样培养条件下，与对照组比较，在
高剂量（10～50μmol/L）范围内，RE可使GH+/PRL+细
胞比例减少，而GH细胞比例增多。同样未检测到只
分泌 PRL的 PRL+细胞。低剂量（0.1～1μmol/L）范
围内，RE对GH3细胞组成无影响。在所选取的剂量
范围内，RE对 GH-/PRL-细胞所占比例无影响（表
1）。但与对照组比较，当RE浓度达到10μmol/L以上
时，PRL荧光强度明显降低。
2.2 RE对 GH3细胞合成 PRL的影响 RE作用
GH3细胞3d后，在无血清无酚红的培养条件下，对
照组细胞可合成PRL。实验组在0.01～10μmol/L浓度
范围内，细胞内PRLmRNA和PRL蛋白水平均下降，
因此RE可抑制PRL的转录和翻译，PRL合成受到抑
制（图3，4）。
2.3 RE对E2的拮抗作用 MTT结果显示（表2），
王超，等.白黎芦醇对GH3细胞增殖和PRL合成的影响 161· ·
图2 GH3细胞PRL和GH免疫双标结果在同一视野下图像 2AFITC标记的PRL荧光标记结果 2BTRITC标记的GH荧光标记
结果 2C亮视野图像
E2单独作用于 GH3细胞时，可以刺激 GH3细胞增
殖，A490nm值约为对照组的 2～4倍。而且较低浓度
（0.1pmol/L）E2即可促进增殖，0.01nmol/LE2促增
殖作用达最大。与对照组比较，MTT实验A490值增加
约4倍。但浓度进一步升高，E2的促增殖作用开始减
弱。当1nmol/LE2和不同浓度（0.01～10μmol/L）RE
共同作用GH3细胞时，较低浓度（0.01μmol/L）的RE
不能抑制1nmol/LE2所诱发的增殖，而0.1μmol/L的
RE才可抑制 1nmol/LE2所引起的增殖，10μmol/L
RE可完全抑制1nmol/LE2所引起的增殖。
Western印迹结果显示（表2，图5），不同浓度的
E2作用于 GH3细胞时，与对照组比较，E2能促进
GH3细胞合成 PRL。1nmol/LE2促 PRL合成作用最
大，半数有效浓度为 0.01nmol/L。当 1nmol/LE2和
不同浓度（0.01~10μmol/L）RE共同作用GH3细胞
时，RE可抑制E2所诱发的PRL合成增加，并呈剂量
依赖性。0.01μmol/LRE可使 1nmol/LE2诱发的细
胞内PRL水平减少50%。
3 讨 论
目前认为雌激素在 PRL腺瘤的发生、发展中起
重要作用，因此将PRL腺瘤列为雌激素相关肿瘤[6]。
近年来发现选择性雌激素受体调节剂（selective
estrogenreceptorregulators，SERMs）具有对抗雌激素
的特性[7]，这为垂体瘤的治疗提供了新途径。RE是近
年来研究较多的SERMs，其具有抗肿瘤特性，可抑制
细胞增殖和诱导细胞凋亡[8]。
实验证实，RE作用 GH3细胞 6h或 3d后，RE
对GH3细胞增殖具有双重作用，其效应呈时间和剂
量依赖性。在所选取的浓度范围内，RE作用GH3细胞图5 Westernblot分析RE对E2诱发PRL合成的拮抗作用
图4 Westernblot分析RE对PRL蛋白表达水平的影响
图3 不同浓度RE对PRLmRNA的影响
组 别
A490nm值
变化率（%）
相对PRL
灰度值
C（对照组） 100±0 1.00±0.00
1（10-13mol/LE2） 308±24① 1.15±0.13①
2（10-12mol/LE2） 354±18① 1.20±0.10①
3（10-11mol/LE2） 475±21① 1.47±0.09①
4（10-10mol/LE2） 450±14① 2.15±0.13①
5（10-9mol/LE2） 412±23① 2.85±0.20①
6（10-8mol/LE2） 398±19① 2.60±0.14①
7（10-9mol/LE2+10-8mol/LRE） 410±24① 1.40±0.13①②
8（10-9mol/LE2+10-7mol/LRE） 218±12①② 1.08±0.12②
9（10-9mol/LE2+10-6mol/LRE） 120±10①② 0.75±0.08①②
10（10-9mol/LE2+10-5mol/LRE） 95±6② 0.45±0.06①②
表2白黎芦醇对雌二醇诱发细胞增殖和PRL合成的拮抗作用
注：①与对照组比较，P﹤0.01；②与1nmol/LE2单独处理组比
较，P﹤0.01
中国微侵袭神经外科杂志（CMINSJ），2006，11（4）162· ·
3d，低浓度RE刺激增殖，高浓度RE抑制增殖，50%
抑制浓度约为 20μmol/L。而作用时间为 6h时，RE
抑制GH3细胞增殖，并呈剂量-效应关系。初明等[9]研
究表明：RE的抑制作用可能通过引起GH3细胞发生
细胞周期阻滞和诱发细胞凋亡而实现。
免疫荧光结果显示：高剂量（10～50μmol/L）RE
作用于 GH3细胞 3d后，GH+/PRL+细胞比例降低，
GH+细胞比例升高，RE抑制细胞增殖的同时，也使
PRL阳性细胞比例下降。Lee等[7]报道E2可使GH3细
胞中PRL阳性细胞比例增加，而雌激素受体拮抗剂
Tamoxifen可降低 GH3细胞中 PRL阳性细胞比例。
有研究表明：GH3细胞中的GH+/PRL+细胞具有双向
分化潜能，可向GH+细胞或PRL+细胞分化，GH3细
胞在E2和一些细胞因子的共同作用下，除改变细胞
亚型比例之外，还可诱导只分泌PRL的PRL+细胞出
现[3]。PRL阳性细胞分裂减少和细胞分化均有可能导
致PRL阳性细胞比例下降，需进一步研究，以明确细
胞分裂和细胞分化在其中是否发挥作用。另外，本实
验中，RE造成GH3细胞总数的减少，分泌PRL的细
胞比例下降，均会间接影响PRL水平。
实验中观察到E2可刺激细胞增殖，而且较低浓
度（0.1pmol/L）E2即可刺激GH3增殖，0.01nmol/L
E2的刺激作用最大。当浓度进一步升高时，E2的促增
殖作用开始减弱。当RE和E2共同作用于GH3细胞
时，低浓度（0.1μmol/L）RE不能抑制E2的促增殖效
应，只有高浓度（0.1~10μmol/L）RE才能抑制E2的
促增殖效应。目前研究表明：E2的促增殖作用是雌激
素受体亚型（ER-α）介导的[10]，RE对ER-α的亲和力
远远低于E2对ER-α的亲和力[1]，这可能在一定程度
上造成了只有高浓度RE才能拮抗E2的促增殖作用。
本组实验研究证实，RE通过抑制PRL的转录和
翻译，可直接抑制GH3细胞合成PRL。RE抑制PRL
合成，这可能在一定程度上造成了 PRL阳性细胞比
例下降。另外，我们也观察到 E2可促进 PRL合成，
1nmol/LE2促进PRL合成的作用最大，半数有效浓
度为0.01nmol/L。
E2既可刺激细胞增殖，又可刺激PRL合成，但两
者比较，E2的促增殖作用较强。RE可抑制E2诱发的
细胞增殖和PRL合成，我们对RE的这两种抑制作用
进行比较。结果发现：RE抑制E2诱发的PRL合成作
用较强，对于此种现象可能的解释是[11]：①PRL合成
和细胞增殖反应由不同的 ERs介导；②RE和 E2对
ERs的结合力不同；③ERs与促增殖应答元件的亲和
力比与促PRL合成应答元件的亲和力高；④可能存
在其他ERs亚型。尽管目前具体机制尚不清楚，但这
对PRL腺瘤的临床治疗比较有意义，例如PRL水平
的降低可改善微腺瘤内分泌症状。
PRL腺瘤的药物治疗目的是降低 PRL水平，改
善内分泌症状，缩小肿瘤体积。本实验证实RE可减少
PRL合成，抑制GH3细胞增殖，分泌PRL的细胞比例
下降，对PRL腺瘤发挥着两方面治疗作用，而且 RE
可拮抗 E2的促增殖和 PRL合成作用，说明 RE对
PRL腺瘤有治疗和预防双重作用。
参 考 文 献
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