全 文 ： 研究原著 文章编号:1000-2790(2005)20-1902-03
白黎芦醇脂质体的制备工艺改进
王　莉 1 ,周　红 1 ,张三奇2 ,顾　宜 2 ,方坤泉 2 ,周　敏2 ,奚苗苗 2 ,连佳芳 2
(1第三军医大学基础部药理学教研室 ,重庆 400038, 2第四军医大学西京医院药剂科 , 陕西 西安 710033)
收稿日期:2005-03-18;　修回日期:2005-05-15
通讯作者:张三奇. Te.l (029)83375471　Em ai.l sanq izhang@ yahoo.
com
作者简介:王　莉(1979-), 女 (汉族), 陕西省扶风县人. 药师. Te.l
(023)68753466　Em ai.l w ang jishi7910@ sin a. com. cn
Study on preparation of resveratrol li-
posom es
WANG Li1 , ZHOU Hong1 , ZHANG San-Q i2 , GU Y i2 , FANG
Kun-Quan2 , ZHOU M in2 , X IM iao-M iao2 , LIAN J ia-Fang2
1Depa rtm en t o f Pha rm aco logy, Faculty o f P rec linical M edic ine,
Third M ilitary M edical Un ive rsity, Chongq ing 400038,
2Depa rtm en t o f Pharm acy, X ijingH ospital, Fourth M ilitaryM edi-
ca l Un ive rsity, Xian 710033, China
【Abstract】A IM:To op tmi ize the fo rmu la tion and prepa ra-
tion techn iques o f resve ratro l liposomes and to p repa re
them. METHODS: The resve ratro l liposomes were p re-
pa red by fiml -u ltrasound techn ique. The op tmi a l fo rm u la tion
and p repara tion techn iques w ere se lected by means o f an
o rthogona l des ign tes.t The en trapmen t ra te and appea r-
ance o f liposomesw ere de te rm ined to eva luate the fo rmu la-
tion and prepa ra tion techn ique. RESULTS:The appear-
ance o f p repa red liposomes was regu lar and the ir size
ranged from 80 to 100 nm. The entrapm ent ra te o f th is k ind
o f liposomes was 96. 52% and its load ing quan tity w as
19. 81%. CONCLUSION: The se lec ted form u la tion and
p repa ration techn ique o f resve ra tro l liposomes is ra tiona l
and p racticab le.
【Keywords】 resve ra tro l; liposomes;en trapmen t ra te;o r-
thogona ldes ign
【摘　要】目的:制备白黎芦醇脂质体 , 优选最佳处方及最佳
制备工艺. 方法:以大豆磷脂 、胆固醇为载体 , 采用薄膜超声
分散法制备白黎芦醇脂质体 , 设计正交实验 ,以包封率 、形态
为考察指标选择最优处方. 结果:按最优处方制得的白黎芦
醇脂质体均匀圆整 , 平均粒径范围 80 ～ 100 nm , 包封率为
96. 52%, 载药量为 19. 81%. 结论:选择薄膜超声分散法优化
工艺制备白黎芦醇脂质体处方合理 ,工艺可行 , 包封率及载药
量高.
【关键词】白黎芦醇;脂质体;包封率;正交设计
【中图号】R944　　　【文献标识码】A
0　引言
1940年 , Takaoka首先从毛叶藜芦中分离出白藜
芦醇 ,其化学结构为 3, 5, 4′-三羟基-二苯乙烯. 由
于白藜芦醇是一种天然活性成分 ,且其资源广泛 ,故
有关其生物学特性广受关注 [ 1] . 多项研究表明 ,白藜
芦醇的药理作用广泛 ,主要包括:①抑制血小板聚
集 、预防心脏病发生;②调节血液中胆固醇的含量;
③抗菌作用;④抗癌作用;⑤抗衰老作用;⑥植物
雌激素样作用等 [ 2] . 除以上作用外 ,最新研究表明 ,
白藜芦醇还能通过降低血清和肝脏的脂质 ,减少脂质
过氧化物在体内的积累 ,从而起到保护肝脏的作用.
基于此 ,许多研究者试图利用多种载体将白藜芦醇靶
向作用于肝脏 ,从而有效发挥其肝保护作用. 但目前
尚未找到较为理想的白藜芦醇肝靶向载体制剂. 我
们旨在利用脂质体作为载体 ,包裹白藜芦醇 ,制成生
物学特性较为稳定的白藜芦醇 -脂质体 ,为临床应用
白藜芦醇作为肝保护剂打下基础 [ 3] .
1　材料和方法
1. 1　材料　LC-10VP高效液相色谱仪 (日本岛津公
司 );Sephedex-G 50凝胶 (S igm a公司);RE-52旋转蒸
发仪(上海亚荣生化仪器厂 );KQ-250型超声波发生
器(江苏昆山淀山湖检测仪器厂 );JEM-2000Ex型透
射电子显微镜 (日本电子 );BP-190S电子天平 (德国
赛多利斯 );白黎芦醇 (S igm a公司);大豆磷脂 (上海
太伟药业有限公司 ,批号 040716);胆固醇 (CH 上海
生物化学试剂公司 ,批号 021023);其他试剂均为国
产分析纯.
1. 2　方法
1. 2. 1　处方优化选择　通过预实验 ,确定影响包封
率 、形态 、均匀度 、粒径分布的三种主要因素 ,即大豆
磷脂∶胆固醇 (A),大豆磷脂∶白黎芦醇 (B), 60 g /L甘
露醇 (C),采用正交设计筛选处方 ,各因素取三水平 ,
以包封率为衡量指标 ,进行正交试验(Tab 1, 2).
1. 2. 2　白黎芦醇脂质体的制备　采用薄膜超声分散
法制备. 分别称取大豆磷脂 、胆固醇 、白黎芦醇 ,置于
100 mL圆底烧瓶 ,加入氯仿∶甲醇(1∶1)混合物 30mL
1902 第四军医大学学报(J Fourth M ilM ed Univ)2005;26(20)　http:/ /jou rna .l fmm u. edu. cn
使之溶解 , 41℃减压旋转蒸发除去溶剂 ,使磷脂在瓶
壁形成一层均匀薄膜. 加入 60 g /L甘露醇 10mL,水
合 2 h即得脂质体粗混悬液. 冰水浴条件下超声 20
m in, 0. 45 μm微孔滤膜过滤 ,分装 [ 4] .
表 1　正交设计的三因素三水平
Tab 1　The facto rs and leve ls o f orthogoma l de sign
Level
Factor
A (phospholipid∶
C holesterol)
B (phosph olip id∶
Resveratrol)
C (60 g /L
m an icol)
1 2∶1 3∶1 10
2 3∶1 4∶1 15
3 4∶1 5∶1 20
表 2　正交试验
Tab 2　Results o f o rthogona l test
N o.
F acto r
A (phospho lip
id:
Choleste ro l)
B (phospho lip
id:
Resve ra tro l)
C (60 g /L
manicol)
En trapment
rate(%)
Loading
quantity(%)
1 2∶1 3∶1 10 96. 52 19. 81
2 2∶1 4∶1 15 85. 00 13. 43
3 2∶1 5∶1 20 75. 68 10. 19
4 3∶1 3∶1 15 79. 56 21. 23
5 3∶1 4∶1 20 78. 88 15. 27
6 3∶1 5∶1 10 63. 70 11. 68
7 4∶1 3∶1 20 83. 02 22. 88
8 4∶1 4∶1 10 82. 35 16. 43
9 4∶1 5∶1 15 62. 11 12. 26
K1 85. 73 86. 36 80. 85
K2 74. 05 82. 07 75. 55
K3 75. 83 67. 16 79. 19
R 11. 68 19. 21 5. 30
K 1 - K 3:The m ean of en trapm en t rates conespond ing to each factor;
R:Range.
1. 2. 3　白黎芦醇 HPLC测定方法及其可行性　采用
HPLC测定药物含量. 具体条件为:色谱柱:K romasil
C18 (416 mm ×150 mm , 5 μm );流动相:甲醇 ∶水
(48∶52);流速:0. 8 mL /m in;柱温:室温;柱压:15. 0
M Pa;检测波长:303 nm;进样体积:20μL. 白藜芦醇脂
质体含量测定的色谱图显示在药物出峰位置未见其他
杂质峰 ,说明此法对药物测定无干扰(Fig 1). 含量测定
时峰面积 A与浓度 C回归方程为 A=163911. 3406C -
4908. 2829(r=0. 9997),浓度在 0. 05 ～ 5. 0 mg /L范围内
线性关系良好. 高 、中、低 3种浓度时的回收率分别为
(98. 3±2. 1)%, (99. 5±1. 8)%, (98. 9±2. 0)%,平均
日内差及日间差分别为 1. 28%和 2. 32%.
A:Contro l;B:S tandard;C:Samp le.
F ig 1　Chrom atig ram s of HPLC
图 1　高效液相色谱图
1. 2. 4　包封率及载药量测定方法　包封率的测定采
用凝胶层析法. 柱层析条件:凝胶柱为 Sephedex-
G50,洗脱液为蒸馏水 ,流速为 0. 5mL /m in,层析温度
为室温. 分别移取白黎芦醇脂质体 0. 5 mL上柱 ,每
3. 0 mL收集 1次 ,以柱层析条件洗脱 ,应用 HPLC测
定脂质体中药物含量以及游离药物量. 包封率 EE%
=(W总 -W游 ) /W总 ×100%. W总 表示总药物含量 ,
W游 表示游离药物量. 载药量% =(W t -W i) /W c ×
100%. 其中 W t为脂质体胶体溶液中药物量 ,W i为
溶液中游离药物量 ,W c为载体药物量 [ 5] .
1. 2. 5　脂质体形态观察　取脂质体少许滴至专用铜
网 ,用 20 g /L磷钨酸负染 ,自然干燥 ,使粒子在铜网
上浓缩沉积 ,用 JEM-2000Ex型透射电子显微镜观察
并拍照.
统计学处理:将实验测定的包封率数据代入
SPSS软件 ,进行方差分析检验[ 6] .
2　结果
2. 1　直观分析　以包封率(Y%)为衡量指标进行直
观分析 ,由极差 R确定主次因素顺序:B >A >C.
K1 , K2 , K3表示各因素水平所对应包封率的均数.
其中 , A因素:K1 >K 3 >K 2;B因素:K1 >K 2 >K3;
C因素:K1 >K3 >K2. 因此 ,确定 A1 B1C1 为较优处
方. 由此可知 ,影响包封率的主要因素为大豆磷脂与
白黎芦醇的比例 ,其次为大豆磷脂与胆固醇的比例 ,
60 g /L甘露醇对包封率的影响最小 (Tab 2).
2. 2　方差分析　由统计结果可知 , A因素和 B因素
对药物包封率结果均有显著影响 (P <0. 05),即将
A比例调整为 2∶1 , B比例调整为 3∶1,制得的脂质体
具有较高的包封率;而 C因素对实验结果影响不显
著. 因此 ,确定最优处方为 A1 B1C1 ,即按最优处方制
得脂质体包封率为 96. 52%, 载药量为 19. 81%
(Tab 3).
2. 3　最佳工艺验证　按最优处方进行了 3次重复验
1903第四军医大学学报( J Fourth M ilM ed Un iv)2005;26(20)　http:/ /journa.l fmm u. edu. cn
证试验 ,制备 3批脂质体 ,包封率分别为 97. 34%,
98. 78%, 95. 45%,重现性较好.
表 3　三种因素对白藜芦醇脂质体包封率影响的正交实验方
差分析
Tab 3　Variance analy sis of o rthogona l test on the effe cts o f three
facto rs on the en trapm ent ratio o f resve ra tro l liposome
Sou rce of
variation
SS DF MS F P
A 237. 889 2 118. 944 31. 491 0. 031
B 609. 580 2 304. 790 80. 695 0. 012
C 44. 082 2 22. 041 5. 835 0. 146
E rror 7. 554 2 3. 777
Total 899. 104 8
2. 4　脂质体形态观察　显微镜下观察 ,脂质体为近
球状小囊泡 ,形态圆整 , 粒径小而均匀 ,平均粒径在
80 ～ 100 nm之间(F ig 2).
F ig 2　TEM m icrog raph o f resveratrol lipo som es　TEM ×10 000
图 2　白藜芦醇脂质体透射电镜照片
3　讨论
脂质体的制备工艺主要包括薄膜分散法 、冷冻干
燥法 、逆向蒸发法 、乙醚注入法等. 其中逆向蒸发法
适于包裹水溶性药物 、大分子生物活性物质如各种抗
生素 、胰岛素 、免疫球蛋白 、核酸等;乙醚注入法制得
的多为小单室脂质体;而薄膜分散法适于包封脂溶性
药物 ,制备工艺简单 ,所需成本低 ,因此 ,我们选用此
法 [ 7] . 我们选用氯仿和甲醇作为溶剂 , 因其密度较
大 ,在旋转蒸发过程中脂质体不能够很好地分散于水
相之中 ,为了解决这一问题 ,旋转后在冰水浴条件下
进行超声 ,可将脂质体很好地分散于水相之中.
通过预实验表明 ,药物浓度的高低是影响包封率
的因素之一 ,即随着药物浓度的升高 ,包封率先增加
后减小 ,说明白藜芦醇脂质体的包封有饱和性. 其
次 ,冰水浴超声时间的长短对包封率和载药量均有不
同程度影响 ,超声时间越长 ,吸附药物量越大.
我们发现 ,载体胆固醇的加入能增加白藜芦醇脂
质体的稳定性 ,原因可能是随着双分子层中胆固醇浓
度的增加 ,双分子层的刚性增加 ,降低了药物的泄漏 ,
增加了保留量. 当胆固醇浓度达 40% ～ 50%后 ,脂质
体刚性达一稳定水平 ,再增加胆固醇浓度 ,几乎不影
响包封率. 我们选用生理盐水 、60 g /L甘露醇作为分
散介质 ,实验证明 ,用 60 g /L甘露醇水溶液作分散介
质室温放置 3 mo无明显变化 ,而生理盐水不到 1 wk
即混浊 、分层 ,表明药物大量泄漏 ,磷脂凝聚. 原因可
能是电解质的加入改变了各种粒子间电荷的相互作
用 ,促进了磷脂晶型的转变. 鉴于我们的正交设计方
案 ,结果 2. 2仅对三种因素的主效系进行了方差分
析 ,对三种因素之间交互作用的研究尚需在进一步增
加试验次数的基础上进行. 另外 ,由于光线对白藜芦
醇的稳定性有一定影响 ,故所有操作均应避光.
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编辑　王　睿
1904 第四军医大学学报(J Fourth M ilM ed Univ)2005;26(20)　http:/ /jou rna .l fmm u. edu. cn