全 文 ：收稿日期:2012 07 17
作者简介:李可欣(1979 ) ，女(汉族) ，辽宁沈阳人，讲师，E-mail kexinbest@ 163． com;* 通讯作者:徐世义(1962 ) ，
男(满族) ，辽宁沈阳人，教授，主要从事中药质量控制的研究，Tel． 13066735477，E-mail xsy-08@ sohu． com。
文章编号:1006 2858(2013)03 0222 04
荆豆凝集素修饰的牛血清白蛋白脂质体的
免疫学性质
李可欣1，陈大为2，徐世义1*
(1. 沈阳药科大学 医疗器械学院，辽宁 沈阳 110016;2. 沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 对荆豆凝集素修饰的牛血清白蛋白脂质体进行免疫学评价。方法 3 组小鼠分别于 0、
7、14、21 d口服免疫牛血清白蛋白溶液(bovine serum albumin，BSA)、BSA 脂质体及荆豆凝集素修
饰的 BSA 脂质体，建立 ELISA 法测定小鼠在 7、14、21、28、35 及 42 d 时体内产生的系统及黏膜免
疫应答。结果 与 BSA 溶液组相比，将抗原包裹于脂质体、尤其是荆豆凝集素修饰的脂质体中免疫
小鼠后，可在小鼠血清及小肠分泌液中检测到较高的 IgG 及 IgA 水平。其中，免疫后 42 d，凝集素
修饰脂质体组的 IgG 和 IgA 水平分别为 BSA 溶液组产生相应抗体值的 4. 33 倍和 4. 74 倍。结论
荆豆凝集素修饰脂质体口服免疫小鼠后可同时诱导机体产生黏膜及系统免疫应答，可以作为口服
疫苗的载体。
关键词:脂质体;牛血清白蛋白;荆豆凝集素;免疫学评价
中图分类号:R 94 文献标志码:A
凝集素修饰的脂质体既可利用脂质体细胞膜
亲和力强、能够被 M 细胞吞噬的优势，又可发挥
凝集素的靶向性［1 － 2］，使凝集素修饰的脂质体能
够主动靶向位点，促使肠黏膜诱导部位的 M 细胞
摄取肠腔里的抗原物质，经小肠派伊尔氏结(Pey-
ers patches，PPs)传递后产生免疫应答［3］。同时，
植物凝集素与脂质体偶联结合后，还有助于其通
过肠相关淋巴组织，从而为口服疫苗的吸收利用
提供帮助。本文作者将含有相同抗原量的不同载
体分别口服免疫小鼠，通过对小鼠体内诱发的全
身及黏膜免疫应答的比较，继而探讨植物凝集素
修饰的脂质体作为口服疫苗载体的潜力。
1 仪器与材料
WX 80A 涡旋混合器(上海精科实业有限公
司) ，FA1104 型电子天平(上海民桥精密科学仪
器有限公司) ，E039003 型酶标定量测定仪(奥地
利 TACAN 公司) ，LS320 激光粒度仪(美国 Beck-
man公司) ，Delsa 440SX Zeta电位仪(美国 Beck-
man公司)。
牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，
第四军医大学) ，胆固醇(天津市博迪化工有限公
司) ，1 乙基 3 (3 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺
盐酸盐［1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo-
diimide hydrochloride，EDC，美国 Sigma 公司) ，
N 羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS，
上海嘉辰化工有限公司) ，胆固醇单琥珀酸酯(实
验室自制) ，脱脂奶粉封闭液(上海西唐生物科技
有限公司) ，小鼠免疫球蛋白 A(immunoglobulin
A，IgA，上海森雄科技实业有限公司) ，小鼠免疫
球蛋白 G(immunoglobulin G，IgG，上海森雄科技
实业有限公司) ，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgA
和 IgG(上海鑫乐生物科技有限公司)。
KM 小鼠，沈阳药科大学实验动物中心，生产
许可证号:SCXK 辽 2003 0008 号，体质量:(20 ±
2)g。
2 方法与结果
2. 1 荆豆凝集素修饰的牛血清白蛋白脂质体的
制备
采用逆向蒸发法［4］制备脂质体。称取磷脂
200 mg、胆固醇 100 mg，放入茄形瓶中，加入
10 mL二氯甲烷，室温下用注射器缓慢注入 3 mL
质量浓度为 3 g·L －1的 BSA 溶液作为内水相;搅
拌 10 min形成乳状液，涡旋混合 3 min，水浴超声
3 min。减压蒸发，滴加外水相 pH 值 7. 4 的 PBS
溶液至终体积 15 mL，搅拌 30 min 后，充分水合
制得牛血清白蛋白脂质体(BSA-loaded lipo-
somes，LIP)。 LIP 平 均 粒 径 为 (4. 323 ±
1. 076)μm，Zeta 电位为(－ 15. 4 ± 2. 6)mV，包封
率为(69. 7 ± 3. 4)%。
称取磷脂 200 mg、胆固醇和胆固醇单琥珀酸
酯各 50 mg，按上述方法制得含有胆固醇单琥珀
酸酯的脂质体。采用碳化二亚胺法［5 － 6］，向脂质
体悬液中加入 NHS 和 EDC，置于冷肼中，于
－ 4 ℃反应以活化插入脂质体双分子层的胆固醇
单琥珀酸酯上的游离羧基，使之生成活化酯。反
应完毕后将反应液装入透析袋中透析 48 h(截留
相对分子质量为 14，000) ，除去过量的 EDC 和
NHS，并中途更换新鲜介质。取出透析内液
1 mL，向其中加入 1 mL 含有不同浓度荆豆凝集
素(ulex europaeus agglutinin I，UEAI)的 PBS
(phosphate buffer)溶液，4 ℃孵化一段时间，即得
荆豆凝集素修饰的牛血清白蛋白脂质体(UEAI
modified liposomes loading BSA，UEAI-LIP)。
UEAI-LIP平均粒径为(5. 016 ± 1. 721)μm，Zeta
电位为(－ 24. 4 ± 4. 7)mV，包封率为(72. 4 ±
4. 1)%，荆豆凝集素的连接率为(65. 4 ± 3. 8)%。
取 UEAI-LIP适量，加 pH7. 4 的 PBS 稀释至适宜
浓度，在透射电子显微镜下观察脂质体形态。由
图 1 可见，制备的为大单室脂质体，呈圆球形，脂
质双分子层明显，大小基本均匀，形状比较规则。
Fig． 1 Transmission electron micrograph (TEM)of
UEAI-LIP(The scale bar is 5 μm)
图 1 荆豆凝集素修饰牛血清白蛋白脂质体的透射电镜
图(标尺长度是 5 μm)
2. 2 ELISA的建立
2. 2. 1 酶标板的制备
在 96 孔聚苯乙烯酶标板的每孔中加入
100 μL 用 pH 9. 6 的碳酸钠缓冲液配制的
10 mg·L －1 BSA 溶液进行包被，4 ℃孵化过夜。
用 PBST(phosphate buffered saline add Tween-20)
洗涤 5 次，滤纸上印干。每孔加入 100 μL 质量分
数为 2% 的脱脂奶粉封闭液在 37 ℃ 下封闭
60 min。洗涤后，每孔加入 100 μL 用 PBST 按体
积比 1∶ 5 稀释的血清样本或直接稀释的小肠黏膜
分泌液，在 37 ℃条件下孵化 60 min。洗涤后，每
孔加入 100 μL 用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠
IgG 和 IgA，37 ℃ 条件下分别孵化 30 min 和
60 min。洗涤后，每孔加入 100 μL 的邻苯二胺(o-
phenylenediamine，OPD)底物溶液，37 ℃条件下
显色 10 min。用 50 μL 的 2 mol·L －1的 H2SO4 溶
液终止反应，用酶标仪在 492 nm 处测定 A 值。
2. 2. 2 标准曲线的制备
设标准孔 8 孔，每孔中加入样品稀释液
100 μL，向第一孔中加入小鼠 IgG 标准品或小鼠
IgA 标准品 100 μL，混匀后用加样器吸出
100 μL，移至第二孔，如此反复对倍稀释至第七
孔，最后，从第七孔中吸出 100 μL 弃去，使之体积
均为 100 μL。第八孔为空白对照。按上述建立
的间接法操作，测定吸光值绘制标准曲线。标准
品 IgG 以 0、0. 16、0. 31、0. 62、1. 25、2. 50、5. 00、
10. 00 g·L －1的质量浓度(ρ)作为横坐标，各浓度
的光密度(optical density，OD)值作为纵坐标，得
到 IgG 的标准曲线符合对数方程，为 y =
0. 407 5 × ln(ρ)+ 0. 8056，r = 0. 994 4。标准品
IgA 以 0、0. 31、0. 62、1. 25、2. 50、5. 00、10. 00、
20. 00 g·L －1的质量浓度(ρ)作为横坐标，各浓度
的 OD 值作为纵坐标，得到 IgA 的标准曲线符合
乘幂方程，为 y = 0. 100 1 × 0. 836 2ρ，r = 0. 987 7。
2. 3 免疫实验的建立
2. 3. 1 免疫程序
雄性 KM 小鼠(SPF 级，18 ～ 22 g) ，分成 3
组，每组 18 只，实验期间正常饮食和饮水。小鼠
每次免疫前禁食 12 h，禁水 4 h。给药前 15 min，
灌胃 0. 5 mL 的 pH7. 4 的 PBS 溶液冲洗胃肠道，
灌胃相同抗原量的 BSA 溶液、LIP 和 UEAI-LIP。
所有小鼠均在 0、7、14 和 21 d接受 4 次免疫，后 3
次为加强免疫，免疫 1 h 后，恢复正常饮食饮水。
血清样品和肠道分泌液在初次免疫后的 7、14、
21、28、35 和 42 d收集，进行免疫分析。
2. 3. 2 生物样本采集
血清样本采集 每次免疫后 7 d，每组中 3 只
小鼠眼眶静脉穿刺取血，用干净试管收集血液，室
温凝固 30 min，在 1 000 r·min －1下离心 15 min
后，立即分析或者 － 20 ℃ 冷冻保存，用于分析血
322第 3 期 李可欣等:荆豆凝集素修饰的牛血清白蛋白脂质体的免疫学性质
清中的 IgG 的水平［7］。
肠道分泌液样本采集 将上述取血后的小鼠
用乙醚麻醉后，打开腹腔，取近端小肠，即十二指
肠上端至下 20 cm 处肠段，用注射器插入肠道中，
以 0. 15 mol·L －1的 PBS 反复冲洗肠道表面，去除
内容物，置于滤纸上吸干，然后用剪刀将小鼠肠道
纵行剪开，载玻片轻刮小肠黏液，精密称其质量，
并转移至离心管内［8］。加入 PBS 并定容至2 mL，
涡旋混合 1 min使小肠黏液与 PBS 充分接触后，
于 10 000 r·min －1下离心 20 min，继续吸取上清
液 1 mL，PBS 定 容 至 2 mL 后，再 于
10 000 r·min －1下离心 20 min，收集上清液于
－ 80 ℃贮存，检测小肠分泌液中的 IgA 抗体。
2. 3. 3 小鼠体内免疫应答
3 组小鼠分别在 0、7、14 和 21 d给予 BSA 溶
液，LIP，UEAI-LIP 后，在初次免疫后的 7、14、21、
28、35 和 42 d测定血清中 IgG 水平和小肠黏膜分
泌液中的 IgA 水平，结果见图 2 和图 3。各数据
均用 珋x ± s 表示，采用 SPSS11. 0 软件对数据进行
单因素方差分析后，LIP组和 UEAI-LIP组分别与
对照组相比，比较采用 T检验，P ＜ 0. 05 表示有显
著性差异，P ＜ 0. 01 表示有非常显著性差异。
Fig． 2 Production of BSA-specific IgG antibody after o-
ral immunization with BSA solution(BSA)，BSA-loaded
liposomes(LIP)and UEAI modified liposomes(UEAI-
LIP)［Data are expressed as the 珔x ± s(n =3)］
图 2 小鼠口服免疫 BSA 溶液、LIP、UEAI-LIP 后，血清
中 IgG 水平的比较(珔x ± s，n =3)
Fig． 3 Production of BSA-specific IgA antibody after o-
ral immunization with BSA solution(BSA)，BSA-loaded
liposomes(LIP)and UEAI modified liposomes(UEAI-
LIP)［Data are expressed as the 珔x ± s(n =3)］
图 3 小鼠口服免疫 BSA 溶液、LIP、UEAI-LIP 后，小肠
黏膜分泌液中 IgA水平的比较(珔x ± s，n =3)
由图可见，给予 UEAI-LIP 组小鼠所诱发的
IgG 和 IgA 水平最高，42 d 的 OD 值分别达到了
0. 528 和 0. 772，其次是 LIP 组，最低的为 BSA 溶
液组，42 d 时的 IgG 和 IgA 值分别为 0. 122 和
0. 163。对于 BSA 溶液组，42 d 内只能诱发较弱
的 IgG 和 IgA 水平，而且数值没有明显变化，分析
原因为 BSA 为大分子蛋白，口服溶液后，在胃蛋
白酶，胰蛋白酶以及胃酸的作用下降解失活，导致
实际达到小肠吸收部位的 BSA 很少，同时，BSA
的较大分子质量很难透过小肠的上皮细胞，这也
是它吸收的一个主要屏障。对于 LIP 组，小鼠在
免疫后的抗体 IgG 和 IgA 水平均高于 BSA 溶液
组，由于脂质双层的保护，会在一定程度上降低胃
肠道消化酶对包裹蛋白的降解，使到达小肠吸收
部位的抗原量增加。对于 UEAI-LIP 组，由于荆
豆凝集素在脂质体表面的修饰，使脂质体对包裹
抗原的保护作用增强，因而产生的抗体 IgG 或
IgA 值均显著高于(P ＜ 0. 05)或非常显著高于(P
＜ 0. 01)BSA 溶液组所产生的相应抗体值，42 d
时，IgG 和 IgA 水平分别为 BSA 溶液组产生相应
抗体值的 4. 33 倍和 4. 74 倍。由此可见，荆豆凝
集素修饰的脂质体口服免疫后可同时诱导机体产
生粘膜及系统免疫应答，从而验证了该载体作为
口服疫苗载体的可行性。
3 结论与讨论
a. 荆豆凝集素是报道较多的与 M 细胞特异
结合的凝集素，将其修饰于脂质体表面，具有以下
优点［9 － 11］:可黏附于肠道细胞，增加抗原与免疫
细胞的接触时间;荆豆凝集素本身具有免疫原性，
有助于增加免疫细胞产生的免疫应答;能专属识
别并结合小鼠小肠 M 细胞顶侧黏膜上的 α-L-岩
藻糖残基，增强了口服黏膜免疫的靶向性程度;调
节上皮细胞的通透性，防止牛血清白蛋白被蛋白
酶降解，促进胞吞及胞饮作用。因此，以其为载体
表面的修饰材料，可以依靠其专属黏附于小肠的
性质，延长抗原与免疫细胞的接触时间，促进抗原
的吸收，从而增强载体的免疫效果。
422 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 30 卷
b. UEAI-LIP能够同时诱发机体产生较强的
黏膜和系统免疫应答，分析原因如下:①Gabor［12］
曾报道 UEAI 在胃肠道中很稳定，即使与高浓度
胃蛋白酶，胰蛋白酶共同孵化，也不会发生降解反
应。所以，当 UEAI 以长链形式修饰于脂质体表
面时，增加了空间位阻，减少酶对脂质体的攻击几
率，大大地提高了脂质体的稳定性，从而能够将更
多抗原送入胃肠道，诱发免疫反应。②UEAI 与
PPs结表面 M 细胞特异性结合，延长了脂质体在
小肠内的滞留时间，使包裹的抗原能从骨架内缓
慢释放，从而增加抗原对免疫细胞的刺激时间，产
生较强的免疫应答;③脂质体被 M 细胞摄取后停
留在 PPs内，胞内加工后以吞噬小泡形式转送至
侧面胞膜处，并以胞吐方式分泌入细胞间隙。在
M 细胞基底膜深深凹陷形成一个上皮内凹腔，腔
内含 T、B 淋巴细胞和巨噬细胞。侧面聚集有淋
巴细胞及巨噬细胞，从而迅速识别 M 细胞提供的
抗原。通过这种方式，位于肠上皮下的黏膜免疫
诱导部位迅速识别肠腔内抗原并产生黏膜免疫应
答，分泌大量 IgA 进入肠腔［13］。因此，荆豆凝集
素修饰的脂质体可以作为口服疫苗的载体，诱发
机体产生较强的体系及黏膜免疫应答。
参考文献:
［1］ CHRISTIANE B，CLAUS-MICHAE I，JOHN F W．
Lectin-mediated drug targeting:history and applica-
tions［J］． Advanced Drug Delivery Reviews，2004，56
(3) :425 － 435．
［2］ 刘亮，田保成．生物黏附材料 植物凝集素及在制剂
中的应用进展［J］．中南药学，2007，5(2) :164 －167．
［3］ HUSSAIN N，JANI P U，FLORENCE A T． Enhanced
oral uptake of tomato lectin-conjugated nanoparticles
in the rat［J］． Pharm Res，1997，14(5) :613 － 618．
［4］杜修桥，胥传来，乐国伟．逆相蒸发法制备猪用生长
激素脂质体工艺的优化研究［J］． 中国油脂，2003，
28(3) :47 － 50．
［5］蔡勤，孟延发． 5 氟尿嘧啶 花生凝集素结合物的制
备与结合率测定［J］． 生物医学工程学杂志，2005，
22(3) :545 － 547．
［6］ ISABEL E，MIGUEL A． Preparation of Ulex europae-
us lectin-gliadin nanoparticle conjugates and their in-
teraction with gastrointestinal mucus［J］． International
Journal of Pharmaceutics，1999，191:25 － 32．
［7］ SEIICHIRO M，KAZUNORI I． A pplication of poly-
ethyleneglycol(PEG)-modified liposomes for oral
vaccine:effect of lipid dose on systemic and mucosal
immunity［J］． Journal of Controlled Release，2003，
89:189 － 197．
［8］ TAKUYA I，SHINOBU W． Humoral immune re-
sponse induced by oral immunization with liposome-
entrapped antigen［J］． Developmental and Compara-
tive Immunology，2003，27:413 － 421．
［9］ BAINTNER K，JAKAB G，GYORI Z． Binding of
FITC-labelled lectins to the gastrointestinal epithelium
of the rat［J］． Pathol Oncol Res，2000，6(3) :179 －
183．
［10］ CLARK M A，JEPSON M A，HIRST B H． Lectin
binding defines and differentiates M-cells in mouse
small intestine and caecum［J］． Histochem Cell Biol，
1995，104(2) :161 － 168．
［11］ JEPSON M A，CLARK M A，FOSTER N，et a1． Tar-
geting to intestinal M cells［J］． J Anat，1996，189(3) :
507 － 516．
［12］ GABOR F，BOGNER E，WEISSENBOECK A，et a1．
The lectin-cell interaction and its implications to intes-
tinal lectin mediated drug delivery［J］． Adv Drug De-
liv Rev，2004，56:459 － 480．
［13］ JAGANATHAN K S，SURESH P V． Strong systemic
and mucosal immune responses to surface-modified
PLGA microspheres containing recombinant Hepatitis
B antigen administered intranasally［J］． Vaccine，
2006，24(19) :4201 － 4211．
Imuune evaluation of ulex europaeus agglutinin I
modified liposomes loading bovine serum albumin
LI Ke-xin1，CHEN Da-wei2，XU Shi-yi1*
(1． School of Medical Apparatus，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China;2． School
of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China) (下转至第 231 页)
522第 3 期 李可欣等:荆豆凝集素修饰的牛血清白蛋白脂质体的免疫学性质
术醇的气相色谱测定［J］． 中国临床药学杂志， 2001，10(2) :107 － 109．
Biotransformation optimization of curcumol by As-
pergillus niger AS 3. 739
SUN Min-ge，ZHAO Qian，CHEN Li-xia，QIU Feng*
(School of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，
China)
Abstract:Objective To optimize the biotransformation conditions of curcumol by Aspergillus niger AS
3. 739． Methods Biotransformation conditions were optimized by altering the inoculum size，nitrogen re-
source，inoculum time and the time of adding substrate． Mycelia concentration，pH value and transformation
ratio were evaluated for the optimization of the biotransformation conditions． Results The optimized cultiva-
ting condition:yeast extract paste was 1. 8 g·L －1，inoculum size was 3%，inoculum time was 24 h，and the
time of adding substrate was 12 h after inoculation． Conclusions The biotransformation ratio for curcumol in-
to 3α-hydroxy curcumol by Aspergillus niger AS 3. 739 could be greatly increased under the optimized con-
dition．
Key words:curcumol;Aspergillus niger AS 3. 739;cultivating condition;

biotransformation
(上接第 225 页)
Abstract:Objective To establish the immune evaluation method of ulex europaeus agglutinin I modified li-
posomes loading bovine serum albumin． Methods Three groups of mice were respectively immunized by
BSA solution，LIP and UEAI-LIP． All animals received four immunization doses at 0，7，14 and 21 day and
samples were collected after 7，14，21，28，35 and 42 days of primary immunization． Results Results indicate
that antigen encapsulated in liposomes，especially the UEAI-modified ones，was favorable for inducing im-
mune response． At 42 days after the first immunization，the highest IgG and IgA antibody levels produced by
UEAI-LIP occurred，respectively showing 4. 33-fold and 4. 74-fold higher levels compared to those of the
groups receiving BSA alone． Conclusions UEAI-modified liposomes has high potential when used as carrier
for oral vaccines．
Key words:liposome;bovine serum albumin;ulex europaeus agglutinin I;immune evaluation
132第 3 期 孙敏鸽等:黑曲霉(AS 3. 739)对莪术醇的生物转化及条件优化