全 文 ：一 1334一 药物分析杂志 Chi n Jh Parm An al Z 《 X拓 , 26 ( 9 )
薄层荧光扫描法测定虎杖中的白葬芦醇和白黎芦醇糖昔
舒友琴 ` ,2 , 陈敏 , ’ ,杨喜花` , 王巍`
( 1
. 中国农业大学食品学院 ,北京 l (X旧83 ;2 . 郑州牧业工程高等专科学校 ,郑州 45 以X)8
摘要 目的 :建立虎杖中白黎芦醇及其糖昔异构体含量的测定方法 。 方法 : 以甲醇提取目标组分 , 以聚酞胺薄膜为固定相 ,苯 -
甲醇 一 甲酸 ( 1:0 :5 1) 为展开剂层析分离 ,用荧光扫描法定量 , ^ E` 二 3 06 mn , ^ E , 二粼洲〕 mn ,线性参数 XS 二 3 。 结果 : 4种组分 (顺式
白黎芦醇及其糖昔和反式白黎芦醇及其糖昔 )的线性关系良好 ,相关系数为 0 . 望科2 一 0 . 9 9% ,平均回收率为 97 . 6% 一 98 . 6% ,
RS D 为 1. 8% 一 3 . 1% 。 测定 4 个虎杖样品中反式白黎芦醇和反式白蔡芦醇昔的含量分别为 0 . 20 % 一 0 . 2 % 和 2 . 以% 一 2 . 14 % ,
均未检出可定量测定的顺式异构体 。 结论 :方法简便 、快速 、 灵敏 、测定成本低。
关键词 :薄层荧光扫描法 ;虎杖 ; 白黎芦醇 ;白黎芦醇昔
中图分类号 : gR l7 文献标识码 : A 文章编号 :能54 一 179 3( 2仪拓 )o 一 13 34 一 03
T L C F’I u o er s e e cn e S c歇m in g ds et r n止n a it o n o f er s v e ar tr o l a n d
icP ie d in oP ly go
n u m c u sP 翻阮t u m S ie b . et Z cu .C
SHU Y o u 一 q in l , 2 , CHEN Mi n l ’ , Y AN G X i 一 h u a l , W AN G We i
( 1 Chi an A幼 e lu t以司 U in ve o i t y , B e ij i ng lX( X) 83 ;
2
. 劝 e r l砂 ou Col eg of A n im a] uH sb an d叮 E心~ ng
,乃 e n咧犯 u 45 X( 班) 8 , hC ian )
A b st r a t O bj ce it ve
: T o d e v e l o p a me
t h o d of r d e t e丽 in n g re s v e r a tr 0 1 an d p i e e id i n OP ly即 n u m e u s p id at u m s i e b . e t
Z u e e
. 场 T LC fl u o r e cs e n e e cs a n n i n g . N k 比侧如 : eR vs e raotr l an d iP e e id w er e x t r a c t e d 场 m et han o l
.
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( 10
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e t e耐 n e d 师 TL C fl u o re s e e n e e s earm i n g a n d 人E : = 3肠 n m ,
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。 = 4《洲) n m , SX = 3 . R es ul is : hT e e al ibart i o n e u vr e s sh owe d 脚d l i n e iar t y a n d th e i n t e er lat e d art i o was 0 . 9 94 2 -
0
. 奥珍6 . hT e va e r a g e er e o v e ir e s we er 97 . 6% 一 98 . 6% iw ht SR D I
.
8%
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. 供% 一 2 . 14% , er s p e e t iv e ly .
C o n c l u威o n : hT e er s u l t s show ht at th e m e ht o d 15 e o vn e in e n t , ar P id , s e n s i t i v e an d low e o st .
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,
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常用中药虎杖 ( oP lyg o n u m c哪i翻um is eb . 。 t 法 e[] 、毛细管电泳法和化学发光法等v[, ` 〕。 但这些方
uz
c c
.
)具有祛风利湿 ,祛痰止咳 ,活血化淤等功效川 。 法多数只能测定游离白黎芦醇或白黎芦醇昔的总量 ,
虎杖中含有白黎芦醇 ( er sve art olr )及白葬芦醇昔 ( iP 一 而不能分别测定它们的顺 、反式异构体 , 因而测定结
ce id )
。 研究发现 , 白黎芦醇和白黎芦醇昔具有抗肿 果不能反映虎杖中所含白黎芦醇及其糖昔异构体的
瘤 、抗凝血 、抗高血脂症 、抗菌 、 预防骨质疏松等多种 准确情况 。 本文首次采用聚酞胺薄膜作固定相 , 利用
生物活性 [ ’ , , ] 。 天然白黎芦醇和白黎芦醇昔都存在反 荧光扫描法定量 , 不仅能同时测定 4 种异构体 ,且与
式 ( tarn s 一 )和顺式 ( ic s 一 )二种构型 , 其中反式异构 硅胶作固定相的薄层层析法相比 ,测定的灵敏度提高
体的生物活性高于顺式异构体 ,反式的白黎芦醇或白 了近 10 倍 。 方法简便 、快速 、灵敏 、测定成本低 。 此
黎芦醇昔在紫外线照射下均能转化为相应的顺式异 法还可用于其他样品中白黎芦醇及其异构体的测定 。
构体 [’] 。 1 仪器与药品
目前 ,虎杖中白黎芦醇及其糖昔异构体的测定主 C S 一 9301 P C 双波长飞点扫描分析仪 ( 日本岛
要用 HPL c 法 5j[ ,另外还有薄层层析 一紫外分光光度 津 ) ;聚酞胺薄膜 ( 8 Cm x 8 Cm , 浙江台州市路桥四
第一作者 eT l : ( 03 7 1 ) 4 5 765 85 1
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2006. 09. 024
药物分析杂志 C ih n J hP ~ nA al 20( 巧 , 26 ( 9) 一 13 35 一
甲生化塑料厂 ) ;微量进样器 ( or 泌 , 上海安亭微量
进样器厂 ) ; z F 一 C 型三用紫外分析仪 ( 254 urn , 365
n m
, 上海康禾光电仪器有限公司 ) ;山 一 02 型高速
中药粉碎机 (浙江省温岭市大海药材器械厂 ) 。
反式白黎芦醇对照品 ( 纯度 > 9 % , is gm a 公
司 ) ;反式白黎芦醇糖昔对照品 (纯度 > 9 % , 复旦
大学药学院天然药物研究室 ) ,苯 、 甲醇 、 甲酸 、醋酸
乙醋 、 氯仿 、丙酮 、 醋酸 、 正己烷等均为分析纯 ;虎杖
样品购自河南中医学院一附院 。
2 溶液制备
2
.
1 对照品溶液 分别准确称取反式白黎芦醇和
反式 白黎芦醇昔对照 品 2 . 5 m g , 用 甲醇定容至
25 m L
,制成 0 . 1 m g · m L 一 ’的溶液 。 分别取以上两
溶液适量 , 置 365 n m 紫外光下分别照射 Z h 和 l h ,
制得顺式白黎芦醇和顺式白黎芦醇昔对照品溶液 ,
实验测得其转化率分别为 69 . 3% 和 58 . 2% 。
2
.
2 样品溶液 将虎杖粉碎后 , 准确称取虎杖粉约
0
.
5 9
, 用滤纸包裹后置于索 氏提取器 中 , 加甲醇
70 m L
,置 70 ℃水浴中回流提取 s h , 提取液用甲醇
定容至 l o m L ,提取和储存时注意避光 。 测定时 ,取
此溶液 s m L 用甲醇稀释至 25 m L 作为测试液 。
3 实验条件
薄层层析条件 : 以聚酞胺薄膜为固定相 , 苯 一 甲
醇 一 甲酸 ( 1:0 5 “ l) 为展开剂 ,上行一次展开 ,展距 6
c m
。 荧光扫描条件 :荧光反射法直线扫描 ,线性参
数 SX = 3 ,光源为汞灯 , 二号滤光片 , 入E。 = 40 n m ,
入E : = 306 n m ,狭缝 0 . 4 m m x 5 m m , △ Y = 0 . 04 m m ,
峰检出方式 :峰面积法 。
4 线性关系考察
准确吸取等体积 0 . 1m g · m L 一 ’ 反式白黎芦醇
和 0 . 1m g · m L 一 `反式白黎芦醇昔对照品溶液混合 ,
用甲醇稀释 or 倍后 , 取此溶液分别点样 0 . 4 , 1 . 0 ,
2
.
0
,
3
.
0
,
4
.
0 林L 于同一聚酞胺薄膜上 ; 同样 , 吸取
等体积顺式白黎芦醇和顺式白黎芦醇昔对照品溶液
混合 ,用甲醇稀释 5 倍后 , 分别点样 0 . 4 , 1 . 0 , 2 . 0 ,
3
.
0
,
4
.
0 林L 于另一聚酞胺薄膜上 。 按层析条件展
开 ,按扫描条件扫描 。 以峰面积 Y 对相应的对照品
的量 X ( gn )进行线性回归 ,反式白黎芦醇及其糖昔
和顺式白黎芦醇及其糖昔的回归方程分别为 :
Y 二 2 0 7
.
8 6X + 3 3 4
.
4 8 r = 0
.
99 7 2
Y = 5 0
.
17 7X + 88
.
0 85 r 二 0
.
99 9 1
Y = 18 4
.
7 9X + 16 4
.
9 4 r = 0
.
9 9 96
Y = 6 8
.
14 8X + 16 8
.
2 7 r 二 0
.
99 82
线性 范 围分别为 : 2 . 0 一 20 . o gn , .2 0 -
20
.
0 n g
,
2
.
7 7 一 2 7
.
7 n g
,
2
.
32 一 23
.
2 n g
。
5 稳定性考察
将有 4 种对照品斑点的聚酞胺薄膜分别在自然
光和避光条件下存放 ,在 10 h 内每隔 30 而 n 扫描 1
次 。 结果表明 ,在避光条件下 ,薄膜上组分的扫描峰
面积在 10 h 内稳定 ( SR D = 1 . 2% 一 1 . 5% ) ,不避光
保存时 ,斑点的扫描峰面积下降。 因此 ,操作中应注
意避光进行。
6 精密度考察
6
.
1 同板精密度 取 4 种对照品的混合液 ,在同一
聚酞胺薄膜上点同样的量 6 次 ,按测定条件进行展
开和扫描 ,分别测定其峰面积 ,求得 SR D 为 1 . 7% -
2
.
3%
6
。
2 异板精密度 取 4 种对照品的混合液 ,点同样
的量于 6 块不同的聚酞胺薄膜上 , 按测定条件进行
展开和扫描 , 分别测定其峰面积 , 求得 SR D 为
2
.
1% 一 3
.
1%
。
7 加样回收率试验
准确称取 5 份已知测定组分含量的虎杖粉 , 每
份均为 0 . 50 9 , 分别加人反式白妻芦醇对照品
1
.
0 5 m g
、反式白黎芦醇昔对照品 10 . 0 2 m g ,按样
品供试液的制备方法制备测试液 ,按层析条件展开 ,
按扫描条件扫描 , 以对照品斑点定性 , 以外标法定
量 。 测得反式白黎芦醇和反式白黎芦醇昔的平均回
收率分别为 9 7 . 1% ( R SD = 2 . 6% )和 96 . 3% ( SR D
= 2
.
5% )
。
8 样品测定
准确吸取样品测试液 1 卜L 与顺式及反式白黎
芦醇及其糖昔的混合对照品点样于同一聚酞胺薄膜
上 ,按测定条件层析和扫描 , 以样品与混合对照品斑
点的比移值及紫外灯下色斑特征定性 , 以外标法定
量 。 对照品薄层扫描结果见图 l , 样品薄层扫描结
果见图 2 , 表 1 为样品测定结果 。
9 讨论
,
.
1 取对照品混合液点样于聚酞胺薄膜上 ,按层析
条件展开后 ,用扫描仪进行各组分的斑点原位扫描 ,
测得反式白黎芦醇和反式白黎芦醇昔的最大吸收波
长分别为 306 lun 和 3 18 n m ,顺式白黎芦醇和顺式
白黎芦醇普则分别为 290 lun 和 28 n m 。 实验中兼
顾 4 种组分的吸收波长 , 选定的激光波长 A。 为
30 6
n m
,选择 二 号 滤 光 片 , 发 射光 波长 人E。 为
4X()
n m
。
一 13 36 一 药物分析杂志 C ih n J hP ~ A n al Z仪巧 , 26 ( 9)
1
.
0 0
0
.
00 0
40
.
0 5 0
.
0
孟 / 画
图 1
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对照品的薄层扫描图
T LC e肠ma t o目冠m
1
. 反式白黎芦醇 ( 矛恤玛
of 比 fe 花 n e e s u b s at n e es
一
esr
v e r a tr ol ) ; 2
. 反式白黎芦醇昔 ( 厂心川 -
iPce id ) ; 3
. 顺式白黎芦醇 ( isC 一 此 s v e ar Otr I ) ; 4 . 顺式白黎芦醇昔 (肠
一
iP
e e id )
个斑点的比移值适中 。 故试验以聚酞胺薄膜作固定
相 ,苯 一 甲醇 一 甲酸 ( 1:0 5 : 1) 为展开剂层析分离。
,
.
3 本文首次采用聚酞胺薄膜作固定相 ,不仅能分
离白黎芦醇与其糖普 ,而且能区分它们的顺 、反式异
构体 , 因此本方法除可用于检测虎杖制品中的白黎
芦醇含量外 ,还能检测虎杖制品在储存中发生的白
黎芦醇及其糖昔的顺反异构体转化 。 实验采用荧光
扫描测定 ,避免了使用紫外检测时其他组分的干扰。
同时测定的灵敏度提高了近 10 倍 。 方法简便 、快
速 、灵敏 、测定成本低 。
,
.
4 实验结果证明 ,在避光条件下提取和测定的 4
个虎杖样品中反式白黎芦醇和反式白妻芦醇昔的含
量分别为 0 . 20 % 一 0 . 2 % 和 2 . 04 % 一 2 . 14 % ,在此
条件下虎杖提取液中没有可定量测定的顺式异构
体 。
l
。
0 0
0
.
0 0
40
.
0 50
.
0 6 0
.
0 70
.
0
孟/画
图 2 样品的薄层扫描图
iF g
.
2 TL C
c b or m at o g r a n】 of amS
Pk
3
. 反式白黎芦醇 ( 月心瓜 一 esr v e m tm l ) ; 4 . 顺式白黎芦醇 ( arT sn 一 iP -
e ie d )
表 1 虎杖样品中白黎芦醉及白黎芦醇糖昔的含且 (% , n 二 4)
T a b
.
1 C o n et 。妇 or r e s v e ar 仕01 a n d icP e id in
物妙g加幽 c璐 p ids ot m Sihe . E t z uc ·
No
. 反式白黎芦醉 反式白黎芦醇昔 顺式白黎芦醇 顺式白黎芦麟
Zh川 一溉ve 口。刀 I rT 山“ 一 p iice d 弘 一~ e拍如 1 弘 一 p i此记
1 0
.
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2 0
.
2 37 2
.
08 麟 一 一
0
.
2 134 2
.
15肠
0
,
20 35 2
.
1389
“ 一 ” 未检出
“ 一 ” no d e l e丽 i n司
以硅胶 GF 254 作固定相 ,对多种展开剂试验 , 结
果表明 ,硅胶 G 只能分离 白黎芦醇与其糖昔 , 而不
能分开它们的顺 、反异构体 。 改以聚酞胺薄膜为固
定相 , 同样对多种展开剂试验 , 发现采用苯 一 甲醇 -
甲酸 ( 10 : 5 : l) 作展开剂展开 ,不仅分离度好 ,且各
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20 2
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17 ( 1 )
: 6
(本文于 2X() 6 年 6 月 18 日修改回 )