全 文 ：收稿日期:2008-04-27;修回日期:2008-05-07
作者简介:刘海华(1982-),女, 辽宁辽阳人 ,主要研究方向为资源微生物.E-mail:w hitetiger31@163.com
通讯作者:龙章富.E-mail:lzf0028@163.com.
文章编号:　0490-6756(2008)05-1235-04
郁金提取物对山葵墨入菌(Phoma wasabiae)
的抑菌活性研究
刘海华 , 尉　研 , 崔　佳 , 黄译影 , 王立洪 , 刘世贵 , 龙章富
(四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 , 成都 610064)
摘　要:应用生长速率法测定了用清水 、95%乙醇溶液提取郁金获得的水提物 、醇提物对山葵
墨入菌的抑菌活性 ,结果表明在供试浓度为 1.0×10-3 g/mL 时 ,郁金 95%乙醇热搅拌提取物
对山葵墨入菌的菌丝生长表现出明显的抑制作用 ,其抑制率为 67.08%;将其 95%乙醇粗提物
依次用正己烷 、乙酸乙酯 、甲醇萃取后测定其生物活性 ,结果表明郁金提取物的抑菌活性物质
主要在正己烷萃取物中 ,在供试浓度为 1.0×10-3 g/mL 时 , 对山葵墨入菌的抑菌率达到
79.70%,其 EC50为 0.3299×10-3 g/mL ,在供试浓度为 10.0×10-3 g/mL 时 ,郁金正己烷萃
取物对墨入菌孢子萌发抑制率为 97.2%.郁金正己烷萃取物对常见的植物病原真菌:小麦赤
霉菌 、油菜菌核菌 、番茄灰霉菌均有较高的抑菌率 ,其 EC50分别为 0.2517×10-3 g/mL 、0.2809
×10-3 g/mL 、0.1749×10-3 g/mL .
关键词:郁金;山葵墨入菌;抑菌活性
中图分类号:Q93　　　文献标识码:A
Antifungal activities of the extracts from Curcuma
phaeocaulis against Phoma wasabiae
LIU Hai-Hua , WEI Y an , CUI Jia , WANG Li-Hong , LIU Shi-Gui , LONG Zhang-Fu
(Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-environment of Ministry of Education , College of Life Sciences ,
Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:The bioactivity of w ater and 95% ethanol ex tracts f rom C.phaeocaulis against P.wasabiae
Yokogi were tested in the laboratory w ith grow th rate method.Results showed that the inhibi tion rate of
95% ethanol ext racts f rom C.phaeocaulis was 67.08%on P.wasabiae Yokogi at the concentration of 1.0
×10-3 g/mL.Then the 95%ethanol ex tracts of C.phaeocaulis were ex t racted by Hexane , Ethylacetate and
methanol step by step and the antifungal activi ty w ere tested further.The results indicated that active compo-
nents w ere present in Hexane ext racts of C.phaeocaul is and it had 79.9% inhibiting rate on P .wasabiae
Yokogi at the concentration of 1.0×10-3 g/mL w ith EC50 being 0.3299×10-3 g/mL , and 97.2% inhibit-
ing rate on spo re germination against P .wasabiae Yokogi at the concentration of 10.0×10-3 g/mL.Three
representative fungi as tested objects for further bioactivity study.The EC50 of ex tracts w ith Hexane to
Fusarium graminearum , Sclerot inia sclerot iorum , Botry tis Cirerea , were 0.2517×10-3 g/mL , 0.2809×
10
-3
g/mL , 0.1749×10-3 g/mL , respect ively .
Key words:C.phaeocaulis , P.wasabiae , antifungal activity
2008年 10月 　
第 45卷第 5期　
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
　 Oct.2008
Vol.45　No.5
1　引　言
山葵墨入菌病在 20世纪 90 年代后期随山葵
的引种而传入我国 ,其致病菌山葵墨入菌属于半知
菌亚门 ,茎点霉属(Phoma),在山葵的生长期间为
害植株最严重.该病作为传入我国大陆的新病害 ,
目前药剂防治效果不明显[ 1] ,且造成了一定程度
的环境污染 、残毒危害 、病菌产生抗药性 、人畜安全
受到威胁等一系列问题 , 给人们的健康带来隐
患[ 2 ,3] .开发生物活性高 、对非靶标生物安全 、环境
相容性好的生物农药已成为农药发展的新趋势.高
效低毒的生物农药将成为今后植物病害防治的热
点药物.地球植物资源丰富 ,据估计全球约有 50万
种植物 ,已知的植物次生代谢产物有 40万种 ,种类
繁多的植物次生代谢产物是开发植物源杀虫 、抑菌
剂的物质基础.近百年来 ,人们已发现 300余种中
药具有抗真菌活性[ 4 , 5] .目前 ,有关山葵病害的研
究资料大多来自台湾和日本等地区 ,研究重点主要
集中在山葵病害的发生以及山葵栽培管理措施等
方面 ,有关山葵病害防治方面的研究报道较少[ 6] .
四川省植物资源丰富 ,是很多中药的道地产区 ,因
此 ,本研究从川产道地中药郁金中筛选出对山葵墨
入菌具有抑菌活性的物质 ,并对其进行抑菌活性的
初步研究.
2　材料与方法
2.1　材　料
2.1.1 　供试病原菌 　山葵墨入病菌(Phoma
wasabiae Yokogi),由四川省农业厅植检站宁红博
士馈赠.小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)、油
菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)均由中国科学
院成都生物研究所陈家任教授馈赠;番茄灰霉病菌
(Botry tis Cirerea)由本实验室保存.培养基为马铃
薯葡萄糖琼脂培养基(PDA).
2.1.2 　供试中药材料 　郁金(Curcuma phaeo-
caulis Val)购自四川崇州.
2.2　方　法
2.2.1　供试样品的制备　郁金阴凉处晾干 ,干燥
箱中 60 ℃烘干 、粉碎后按照粉末和溶剂(w∶v)1∶
10的比例用清水进行冷浸提取 、热搅拌提取 , 95%
乙醇进行热搅拌提取和索氏提取.提取液经旋转蒸
发仪浓缩后得到浸膏状粗提物[ 7] .郁金 95%乙醇
热搅拌粗提物依次用正己烷 、乙酸乙酯 、甲醇萃取 ,
经减压浓缩得到膏状物 , 4 ℃保存 ,备用.
2.2.2　郁金提取物对墨入菌抑菌活性的测定
采用生长速率法[ 8] .将上述备用的总提物 、甲醇萃
取物用无菌水溶解 ,正己烷萃取物 、乙酸乙酯萃取
物用丙酮溶解后再与 PDA 培养基混匀 ,并倒入直
径为 90 mm 的培养皿中制成含药平板 ,用无菌水
作为空白对照(CK),丙酮作为溶剂对照 ,各处理重
复 3次.培养皿中心点接直径为 6.0 mm 的供试菌
饼 , 26 ℃培养 ,十字交叉法测量菌丝生长直径并计
算抑菌率.
2.2.3　郁金 95%乙醇粗膏 、正己烷萃取物对墨入
菌孢子萌发的影响　在墨入菌孢子悬液中分别加
入终浓度为 10×10-3 g/mL的郁金 95%乙醇提取
物 、正己烷萃取药液 ,并设置空白对照(CK)和丙酮
对照 ,采用凹玻片法[ 9] 、26 ℃培养 12 h 后检查孢
子萌发 ,计算孢子萌发率.孢子萌发率(%)=孢子
萌发数/检查孢子数×100;孢子萌发抑制率(%)=
(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌
发率×100.
2.2.4　郁金正己烷萃取物对三种病原真菌抑菌活
性的测定　供试菌种为小麦赤霉菌 、油菜菌核菌 、
番茄灰霉病菌 ,测定方法同 2.2.2.
2.2.5　郁金正己烷萃取物最低抑菌浓度 M IC 值
和最低杀菌浓度 MBC 值的测定　配制 PD液体培
养基(马铃薯 20%, 葡萄糖 2%)分装于若干试管
中 ,待灭菌培养基冷却后 ,采用丙酮配制的郁金正
己烷萃取物母液(0.05 g/mL)后 ,倍比稀释法使各
管含药量分别为 25×10-3 g/mL 、12.5×10-3 g/
mL 、6.25×10-3 g/mL 、3.13×10-3 g/mL 、1.56×
10-3 g/mL 、0.78×10-3 g/mL ,最后加入墨入菌菌
悬液;并设置无菌水 、丙酮为阳性对照 ,不接种作阴
性对照.26 ℃摇床培养 48 h ,以阴性管为对照 ,若
培养物出现浑浊或底部出现絮状物为生长 ,澄清或
无絮状物则为不生长.倍比稀释的各管以无菌生长
的郁金丙酮溶解液的最高稀释度作为该受试菌种
的最低抑菌浓度 ,即为该菌的 M IC值.取出真菌不
生长的药液培养基涂布到 PDA平板上 ,于26 ℃培
养一周 ,再观察结果 ,真菌不生长的最高稀释度为
该药的最低杀菌浓度(MBC),实验重复 3次[ 10] .
3　结　果
3.1　郁金提取物对墨入菌的抑制效果
郁金冷水浸提 、清水热搅拌提取物 、95%乙醇
热搅拌提取物 、95%乙醇索式提取物在药基浓度为
1.0×10-3 g/mL 时 ,对山葵墨入菌的抑菌率分别
1236 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
为 2.30%,3.25%, 67.08%,62.01%,由此可见郁
金水提液对山葵墨入菌的抑菌活性较低 , 但其
95%乙醇提取物对山葵墨入病菌的抑菌率较高 ,通
过生长速率法测定抑菌活性后 ,筛选到郁金 95%
乙醇提取物对山葵墨入病菌具有一定的抑菌活性.
3.2　郁金 95%乙醇粗提物的各种萃取物对墨入
菌的抑制效果
从表 1可以看出 ,郁金正己烷萃取物对山葵墨
入菌的抑菌效果明显优于乙酸乙酯和甲醇萃取物 ,
将抑菌的百分率转换成几率值 ,浓度转换成对数 ,
进行几率值分析可以得到郁金 95%乙醇热搅拌提
取物 、正己烷萃取物对墨入菌的毒力回归方程 ,其
抑制中浓度(EC50)分别为 0.5707×10-3 g/mL 、
0.3299×10-3 g/mL(表 2), 说明郁金有效抑菌成
分在正己烷萃取物中得到浓缩.
表 1　郁金 95%乙醇提取物及各萃取浸膏
对墨入菌的抑菌率
Tab.1　The inhibition effect of different solvent ex tracts from
C.phaeocaulis on P.wasabiae Yokogi
抑菌率(%) 提取物浓度(×10
-3 g·mL-1)
2.5 2.0 1.0 0.5 0.25
95%乙醇浸膏 80.69 73.21 67.08 46.96 31.11
正己烷萃取物 92.51 85.49 79.70 68.27 37.86
乙酸乙酯萃取物 45.70 41.26 37.09 20.08 -0.19
甲醇萃取物 20.56 11.38 8.18 3.99 2.59
表 2　郁金 95%乙醇浸膏和正己烷萃取物
对墨入菌的抑制效果
Tab.2　The inhibition effect of ex tracts from C.phaeocaulis
on P.wasabiae Yokogi
提取物 毒力回归方程(Y =a+bX) 相关系数
EC50
(×10-3 g/mL)
95%乙醇浸膏 5.3148+1.2923 x 0.9781 0.5707
正己烷萃取物 5.7430+1.5427 x 0.9468 0.3299
3.3　郁金提取物对墨入菌孢子萌发的影响
郁金 95%乙醇粗膏 、正己烷萃取物对墨入菌
孢子萌发的抑制作用结果(表 3)表明:在供试浓度
为 10×10-3 g/mL 时 , 95%乙醇粗膏对墨入菌孢
子萌发抑制率为 90.5%,正己烷萃取物对孢子萌
发抑制率为 97.1%.说明郁金的 95%乙醇粗膏经
过萃取后 ,其对孢子萌发的抑制能力有所提高.
表 3　郁金提取物对墨入菌孢子萌发抑制作用
Tab.3　The Inhibition effect of ex tracts from C.phaeocaulis
on spore of P .wasabiae Yokogi
提取物 萌发率(%) 抑制率(%)
95%乙醇粗膏 8.8 90.5
正己烷萃取物 2.6 97.1
丙酮对照 90.1 0.03
空白对照 93.0 0.00
3.4　郁金正己烷萃取物的最低抑菌浓度和最低杀
菌浓度
采用试管倍比稀释法对郁金正己烷萃取物的
最低抑菌浓度 M IC 值和最低杀菌浓度 MBC 值进
行测定 ,结果见表 5.郁金正己烷萃取物对于供试
病原菌均有不同程度的抑制作用 ,对灰霉的 M IC
和 MBC 相同均为 1.56×10-3 g/mL;油菜菌核菌
M IC和 MBC 均为 3.13 ×10-3 g/mL;山葵墨入
菌 、小麦赤霉菌的 MIC 值和 MBC 为 6.25×10-3
g/mL.
3.5　郁金正己烷萃取物对三种病原菌的抑制效果
以小麦赤霉菌 、油菜菌核菌 、番茄灰霉病菌为
供试菌 ,应用生长速率法测定郁金正己烷萃取物的
抑菌效果.研究结果表明 ,郁金正己烷萃取物浓度
在 1.0×10-3 g/mL 时 ,对小麦赤霉菌 、油菜菌核
菌 、番茄灰霉菌均有较高的抑菌率 ,抑菌率分别为
76.82%、 86.58%、100%, EC50分别为 0.2517 ×
10
-3
g/mL 、0.2809×10-3 g/mL 、0.1749×10-3 g/
mL(表 6).
表 5　郁金正己烷萃取物的 MIC 和 MBC
Tab.5　M IC and MBC of Hexane ex tracts from C.phaeocaulis
病原菌 最低抑菌浓度 MIC(×10
-3 g/mL) 最低杀菌浓度 MBC(×10-3 g/mL)
0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 1.56 3.13 6.25 12.5
山葵墨入菌 + + + - - + + - -
小麦赤霉菌 + + + - - + + - -
油菜菌核菌 + + - - - + - - -
番茄灰霉菌 + - - - - - - - -
”+” :阴性;” -” :阳性
1237第 5期 刘海华等:郁金提取物对山葵墨入菌(Phoma wasabiae)的抑菌活性研究 　
表 6　郁金正己烷萃取物对 3 种病菌菌丝生长的抑制作用
Tab.6　The inhibition effect of Hexane ex tracts from C.phaeocaulis on three species of fungi
病原菌 抑菌率(%) 毒力回归方程(Y =a+bX) 相关系数
EC50
×10-3 g/mL
小麦赤霉菌 76.82 5.6782+1.1319 x 0.9248 0.2517
油菜菌核菌 86.58 5.8899+1.6137 x 0.9475 0.2809
番茄灰霉菌 100 7.2392+2.9576 x 0.9172 0.1749
注:抑菌率为药基浓度为 1.0×10-3 g/mL 时测定
4　讨　论
山葵墨入病作为传入我国大陆的新病害 ,必须
严格控制其扩散 ,而蚜虫 、菜青虫等害虫极大地增
加了病害的扩散速度和可能性 ,因此采取及时有效
的措施防除山葵害虫对防治山葵墨入病具有重要
意义[ 2 , 11] .本研究发现川产道地药材郁金对山葵
墨入菌具有较高的抑菌活性 ,经分步萃取和抑菌活
性检测发现 ,其抑菌活性成分主要存在于其正己烷
萃取物中.
郁金为姜科姜黄属(Curcuma)植物 ,全世界约
60余种 ,我国有 16种.四川省有 1000多年的栽培
历史 ,主产于四川省岷江河流域沿岸各区县 ,尤以
成都市的双流 、崇州为道地产区[ 12 ,13] .目前对中药
郁金的研究主要集中在化学成分和药理作用方
面[ 14 , 15] ,但未见其抑菌或杀菌活性的相关报道 ,本
研究筛选出的郁金正己烷萃取物对于供试的病原
真菌均具有较强的抑制作用 ,为新型高效抑菌剂的
研制和开发提供理论依据 ,但郁金正己烷萃取物中
抑菌活性物质和抑菌机理有待进一步研究.
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[责任编辑:白林含]
1238 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷