全 文 ：中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:B 文章编号:1002 － 3127(2015)03 － 0238 － 04 ·安全性评价·
毛郁金醇提物的急性毒性和遗传毒性研究
莫叶勤，冯洁，蒙志斌，刘华钢
(广西医科大学药学院，广西 南宁 530021)
关键词:毛郁金;急性毒性;遗传毒性
基金项目:国家自然科学基金 (31160077) ;广西自然科学基金
(2010GXNSFA013187) ;南宁市科学研究与技术开发计划
(20133166) ;南宁市青秀区科技局科学研究与技术开发计
划(2013S20)
作者简介:莫叶勤，硕士研究生，研究方向:天然药物药理学。
通讯作者:冯洁，博士，教授，研究方向:天然产物活性成分及生物转化。
毛郁金(Curcuma aromatica Salisb)为姜科姜黄属
植物的根茎，别名广西黄姜，主要分布于广西等省区，
目前已收载于《广西壮药质量标准》第二版［1］。毛郁
金含有挥发油和类姜黄素等类型化合物［2-3］，具有行气
破血、通经止痛之功效，主治胸闷胁痛、胃腹胀痛、黄
疸、吐血与月经不调等症。除了有抗肿瘤、抗氧化和心
肌缺血性损伤等保护作用，还有降低血脂、抗抑郁、抗
炎镇痛等药理活性［4-11］。姜科姜黄属植物除具有药用
价值外，还可作为调味品、染料、杀虫剂等［12］。毛郁金
在广西民间应用于治疗高血压、冠心病，具有良好的药
用开发前景，但目前对其毒性研究资料较少，本文主要
从急性毒性和遗传毒性两方面研究毛郁金的毒理作
用，以评价其安全性，为后续的药理研究提供实验依
据，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 受试药物:毛郁金 70%乙醇提取物，其制备方
法:取 1 kg 毛郁金干燥原生药粉末，70% 乙醇浸泡
12 h，回流提取 4 次，每次 2. 5 h，过滤，合并滤液，减压
回收有机溶剂，真空冷冻干燥得到毛郁金提取物，4 ℃
冰箱中密封保存备用。
1. 1. 2 动物:SPF级昆明小鼠，体重 18 ～ 22 g(急性毒
性试验，雌雄各半) ;体重 25 ～ 35 g(小鼠骨髓细胞微
核试验，雌雄各半) ;体重 25 ～ 35g(小鼠精子畸形试
验，雄性) ，实验动物生产许可证号 SCXK(桂)2009-
0002，实验动物使用许可证号 SYXK(桂)2009-0004，
均由广西医科大学实验动物中心提供。
1. 1. 3 仪器:7100 型全自动生化分析仪(日本日立公
司) ;WJ-2 型-160 恒温培养箱(上海跃进医疗器械
厂) ;1450 型洁净净化工作台(苏州净化设备总厂) ;高
速离心机(Thermo Fisher) ，立式压力蒸汽灭菌器(上海
博迅实业有限公司医疗设备厂) ，LD-Y400A 型高速万
能粉碎机(上海顶帅有限公司) ，CX31 型显微镜(日本
OLYMPUS公司)。
1. 1. 4 试剂:曙红 Y染色液(天津市科密欧化学制剂
有限公司，批号 2013 年 1 月 10 日) ;吉姆萨(Giemsa)
染色液(北京索莱宝科技有限公司，批号 20140312) ;
胎牛血清(FBS，浙江杭天生物科技有限公司，批号
130906) ;二甲基亚砜(DMSO，美国 AMＲESCO 公司，
批号 302A0315) ;环磷酰胺注射液(Cyclophosphamide，
PC，山 西 普 德 药 业 股 份 有 限 公 司 公 司，批 号
04130505) ，注射用丝裂霉素 C 注射液(mitomycin C，
MMC，浙江海正药业股份有限公司，批号 121113) ;
POST MITOCHONDＲIAL SUPEＲNATANT(S9，购自美
国 MOLTOX MOLECULAＲ TOXICOLOGY 公司，批号
3218) ，2-氨基芴(2-AF，美国 Aladdin Chemistry 公司，
批号 35005) ，1，8-二羟基蒽醌(1，8-dihydroxyan-
thrapuinone(DHA)Aladdin Chemistry，批号 15975E) ，
叠氮钠(NaN3，批号 20131102)、葡萄糖-6-磷酸二钠
(G-6-P，批号 20131225)、L-盐酸组 氨 酸 (批 号
20131014)、D生物素(批号 20131225)、琼脂粉(Agar，
批号 20140301)均购自北京博奥拓达科技有限公司
(Biotopped) ;敌克松(Dexon，青岛孚润德植保科技有
限公司，批准证号 HNP13037-57) ，营养肉汤(Nutrient
Broth，杭州百思生物科技有限公司，批号 20140302001)。
1. 1. 5 菌株:鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型 TA97，
TA98，TA100 和 TA102 系列菌株(购自美国 MOLTOX
MOLECULAＲ TOXICOLOGY 公司，产品批号分别为
4842D，4850D，4847D和 4838D)。
1. 2 方法
1. 2. 1 急性毒性实验［13］:取体重 18 ～ 22g 健康小鼠
10 只，雌雄各半，以最大浓度(640 mg /ml)、最大灌胃
体积(40 ml /kg) ，24 h 内一次性给，观察小鼠 1 周，未
·832· 毒理学杂志 2015 年 6 月第 29 卷第 3 期 J Toxicol June 2015 Vol. 29 No. 3
DOI:10.16421/j.cnki.1002-3127.2015.03.020
见受试小鼠死亡，由于实验中无法计算出半数致死量
(LD50) ，因此进行最大耐受量实验(MTD)。选取体重
18 ～ 22g健康小鼠 20 只，随机分为实验组和对照组，
每组 10 只，雌雄各半。适应性喂养 3 d，灌胃前禁食不
禁水 12 h，以最大浓度(640 mg /ml)、最大灌胃体积
(40 ml /kg) ，24 h 内一次性给药，对照组给予等体积
0. 5%羧甲基纤维素钠(0. 5% CMC-Na) ，给药后 3 h
内每 30 min观察 1 次小鼠行为活动，后每天观察小鼠
行为 1 次，正常喂养 14 d，观察记录中毒症状和死亡
情况。14 d后采血测肝功能和肾功能生化指标;解剖
动物取心脏、肝脏、肾脏，观察大体变化并称重，计算脏
体比，同时进行组织病理学检查。
1. 2. 2 遗传毒性实验
(1)Ames试验:采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙
门菌组氨酸缺陷型 TA97、TA98、TA100、TA102 菌株进
行试验。受试物及阳性对照药均用 DMSO 溶解，配制
成所需浓度，采用平板掺入法进行试验。设定 5、2. 5、
1. 25、0. 625 和 0. 3125 mg /皿 5 个剂量组(每皿给药量
为 0. 1 ml) ，同时设阴性对照(DMSO)和阳性诱变剂
(2-AF，NaN3，DHA，Dexon)对照组，每组均设 3 个平
行皿，并在相同条件下做加 S-9 和不加 S-9 的平行试
验，37 ℃培养 48 h，计数培养液上的回变菌落数，重复
进行 2 次试验。如果受试药物回变菌落数等于或大于
溶剂对照组回变菌落数的 2 倍，并有剂量 －反应关系，
或至少某一测试点有重复的并具有统计学意义的阳性
反应，即可认为受试药物具有致突变毒性，阳性诱变剂
使用情况见于正文 2. 2 内容。
(2)小鼠骨髓细胞微核实验:选用 50 只体重为
25 ～ 35 g健康小鼠，随机分成 5 组，每组 10 只，雌雄各
半。设定高(25. 6 g /kg)、中(12. 8 g /kg)、低(6. 4 g /kg)
3个剂量组，同时另设阴性对照组(给予等体积 0. 5%
CMC-Na)和阳性对照组(环磷酰胺 50 mg /kg)。采用
间隔 24 h 2 次给药法给药，末次给药后 6 h 颈椎脱臼
法处死小鼠，取双侧股骨，去除肌肉，擦净血液，剪开两
端关节面，用注射器吸 1 ml 磷酸盐缓冲液(PBS)冲出
骨髓于 1. 5 ml 离心管中，以 1000 r /min 离心 10 min，
弃上清液，取沉淀做骨髓常规涂片，自然风干，甲醇
(分析纯)固定5 min，10%吉姆萨染色 20 min，显微镜
下观察。每只小鼠计数 1000 个骨髓嗜多染红细胞
(polychromatic erythrocyte，PCE) ，计算微核数和微核
发生率，其中微核率以含微核的 PCE 千分率计算。
(3)小鼠精子畸形试验:选用 25 只体重为 25 ～
35 g 健康雄性小鼠，随机分成 5 组，每组 5 只。设高
(12. 8 g /kg)、中(6. 4 g /kg)、低(3. 2 g /kg)3 个剂量
组，另设阴性对照组(给予等体积生理盐水)和阳性对
照组(丝裂霉素 C，1. 5 mg /kg，ip) ，给药 1 次 /d，连续
给药 5 d。第 35 天颈椎脱臼法处死小鼠，取双侧附睾，
放入盛有 3 ml生理盐水的小平皿中，用眼科剪纵行切
开附睾并剪成小碎块，用吸管轻轻吹打悬浮液 5 ～ 6 次，
静置 10 min，四层擦镜纸过滤，1 000 r /min离心 10 min，
弃上清，加入 200 μl 生理盐水重悬精子，取精子重悬
液推片，自然晾干后甲醇(分析纯)固定15 min，2%苏
木素 －伊红(HE)液染色 1 h，显微镜下观察精子形态，
每只动物计数形态结构完整的精子 1000 个，记录畸形
精子数，精子畸形率 =总畸形精子数 /总受检精子数。
1. 3 统计学方法 所有数据均采用 SPSS 16. 0 统计
学软件进行统计学分析。各组组间差异采用单因素方
差分析 (One way ANOVA) ，采用 StudentNewman Keuls
(SNK)进行组间的两两比较，结果用均数 ±标准差(珋x
± s)表示，P ＜ 0. 05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 急性毒性实验 在无法计算半数致死量(LD50)
改而进行最大耐受量(MTD)实验中，以 25. 6 g /kg 剂
量的毛郁金 70%乙醇提取物灌胃给药，给药后 30 min
内，给药组中除个别小鼠出现行动怠倦，对外反应迟顿
外，其余小鼠外观、体征、行为活动、精神状态和饮食等
均无明显异常，24 h 后所有小鼠活动恢复正常，对照
组小鼠无异常行为活动出现。实验组小鼠体重增长与
对照组小鼠体重增长比较，采用单因素方差分析结果
显示差异无统计学意义。处死动物后观察各脏器，肉
眼未观察到病变。取重要脏器称重计算各脏器系数，
结果采用单因素方差分析，实验组与对照组比较，差异
无统计学意义(F = 0. 931，P = 0. 357) ，结果见表 1。
小鼠急性毒性实验后，取心、肝、肾三脏器做病理切片
HE染色，未见病理学形态变化;取血检测血清肝肾功
能生化指标，未见毛郁金 70%乙醇提取物对小鼠肝、
肾功能有影响，结果见表 2。
表 1 毛郁金 70%乙醇提取物对急性毒性实验
小鼠脏器系数的影响 (珋x ± s，n = 10，%)
组别 心脏 肝脏 脾脏 肺
对照组 0. 47 ± 0. 087 4. 62 ± 0. 528 0. 54 ± 0. 092 0. 59 ± 0. 067
实验组 0. 44 ± 0. 038 4. 23 ± 0. 485 0. 47 ± 0. 057 0. 62 ± 0. 061
组别 左肾 右肾 脑 胃
对照组 0. 68 ± 0. 132 0. 71 ± 0. 110 1. 38 ± 0. 202 1. 13 ± 0. 288
实验组 0. 68 ± 0. 102 0. 70 ± 0. 110 1. 41 ± 0. 176 1. 09 ± 0. 192
·932·毒理学杂志 2015 年 6 月第 29 卷第 3 期 J Toxicol June 2015 Vol. 29 No. 3
表 2 毛郁金 70%乙醇提取物对急性毒性实验小鼠
肝肾功能的影响 (珋x ± s)
组别
动物
数
ALT
(U /L)
AST
(U /L)
BUN
(mmol /L)
CＲE
(μmol /L)
对照组 10 55. 6 ± 12. 42 114. 1 ± 18. 44 7. 7 ± 0. 89 6. 6 ± 3. 32
实验组 10 54. 9 ± 7. 84 112. 5 ± 20. 16 7. 7 ± 0. 96 7. 9 ± 1. 97
2. 2 Ames试验 在有或无代谢活化系统(S9)存在
下，不同浓度的毛郁金醇提物诱导 TA97、TA98、TA100
和 TA102 这 4 种菌株回复突变菌落数均未超过阴性
对照组自发回复突变菌落数的 2 倍，且无剂量 －反应
相关关系，表明 Ames试验结果为阴性;而阳性对照组
各菌株回复突变菌落数与阴性对照组的回复突变菌落
数比较，结果差异有统计学意义(P ＜0. 01)。结果表明，
毛郁金 70%乙醇提物对鼠伤寒沙门菌无致突变作用
(表 3)。
表 3 毛郁金 70%乙醇提取物的 Ames试验结果 (－ S9，+ S9)
组别
回复突变菌落数(个 /皿)
TA97 TA98 TA100 TA102
－ S9 + S9 － S9 + S9 － S9 + S9 － S9 + S9
5 mg /皿1 115. 3 ± 11. 2 124. 7 ± 15. 0 41. 7 ± 4. 0 53. 7 ± 4. 7 147. 3 ± 4. 6 143. 7 ± 12. 2 217. 3 ± 19. 9 226. 0 ± 16. 5
2. 5 mg /皿2 116. 7 ± 3. 0 132. 3 ± 9. 6 39. 7 ± 7. 2 40. 7 ± 4. 7 118. 3 ± 5. 5 132. 7 ± 7. 0 158. 0 ± 3. 0 172. 0 ± 4. 4
1. 25 mg /皿3 115. 6 ± 2. 3 149. 0 ± 5. 6 30. 3 ± 6. 8 29. 3 ± 4. 0 144. 0 ± 6. 8 144. 3 ± 7. 0 152. 7 ± 6. 7 164. 3 ± 8. 0
0. 625 mg /皿4 121. 3 ± 4. 1 137. 3 ± 3. 1 17. 0 ± 3. 0 21. 0 ± 4. 4 100. 0 ± 6. 0 103. 0 ± 8. 9 171. 7 ± 8. 6 185. 0 ± 7. 0
0. 3125 mg /皿5 129. 7 ± 8. 7 133. 0 ± 3. 6 14. 0 ± 4. 4 16. 3 ± 4. 5 86. 7 ± 7. 1 91. 7 ± 7. 6 180. 0 ± 8. 9 191. 0 ± 9. 5
阴性对照组 78. 3 ± 5. 1 91. 7 ± 10. 4 31. 3 ± 8. 1 42. 0 ± 4. 6 110. 3 ± 5. 1 121. 7 ± 5. 0 270. 7 ± 10. 5 293. 3 ± 9. 1
阳性对照组 Dexon(50)a 2-AF(10)a Dexon(50)a 2-AF(10)a NaN3(10)a 2-AF(10)a Dexon(50)a DHA(50)a
2 135 ± 221 1 264 ± 143. 8 1 172 ± 190 1 328 ± 156. 2 1 593 ± 116. 5 1 507 ± 34. 3 732 ± 87. 2 918 ± 58. 2
F值(1) 295. 766 255. 852 80. 687 198. 034 485. 01 5 051. 33 90. 21 347. 58
P值(1) 8. 668E-5 8. 950E-5 8. 501 E-4 1. 479 E-4 2. 516E-5 2. 345E-7 6. 857 E-4 4. 871 E-5
注:1，2，3，4 和 5 均为受试物各剂量;a:括号内为所加阳性物剂量，单位为 mg /皿; (1) :F值和 P值为阳性对照组与阴性对照组比较统计值，
E － n = 10 － n。
2. 3 小鼠骨髓细胞微核试验 毛郁金 70%乙醇提物
各剂量组小鼠骨髓微核率均低于阴性组微核率;阳性
对照组小鼠骨髓微核率与阴性组比较明显升高，差异
具有统计学意义(F = 819. 12，P = 0. 000) ，表明毛郁
金 70%乙醇提物无致突变作用(表 4)。
表 4 毛郁金 70%乙醇提取物的小鼠骨髓细胞微核实验结果
组别 检查细胞数 微核细胞数
微核率
(%)
阴性对照 1 000 × 10 17 1. 7
受试物 (g /kg)
25. 6 1 000 × 10 8 0. 8
12. 8 1 000 × 10 13 1. 3
6. 4 1 000 × 10 14 1. 4
环磷酰胺(50 mg /kg) 1 000 × 10 213 21. 3*
注:与阴性对照比较，* P ＜ 0. 05。
2. 4 小鼠精子畸形试验 由表 5 可见，丝裂霉素阳性
对照组的小鼠精子畸形率显著高于阴性对照组(F =
623. 32，P = 0. 000) ，而毛郁金对小鼠精子致畸率与阴
性对照组比较，差异无统计学意义，说明在检测剂量范
围内，毛郁金 70%乙醇提物对小鼠无精子致畸作用。
3 讨论
急性毒性实验结果显示，毛郁金 70%乙醇提取物
表 5 毛郁金 70%乙醇提取物的小鼠精子畸形实验结果
组别
剂量
(g /kg)
受检
精子数
畸形
精子数
精子畸形率
(%)
阴性对照 － 1 000 × 5 21 0. 42
12. 8 1 000 × 5 27 0. 54
毛郁金提取物 6. 4 1 000 × 5 18 0. 36
3. 2 1 000 × 5 20 0. 40
丝裂霉素 C 0. 001 5 1 000 × 5 258 5. 16
注:与阴性对照比较，* P ＜ 0. 05;n = 5。
以口服灌胃给药，其 MTD为 25. 6 g /kg，相当于毛郁金
干燥原生药 197 g /kg。《中国药典》一部中，临床推荐
中药材口服量为 3 ～ 10 g /d［14］，以小鼠平均体重 20 g、
成人体重 60 kg计算，小鼠口服灌胃 MTD 约为成人临
床口服用药量的 300 倍。按急性毒性剂量分级标准，
毛郁金醇提物属于安全药用范围。
遗传毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内
容，与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研
究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重
要环节。本文参考《食品安全性毒理学评价程序和方
法》(GB15193. 1—2003)［15］，采用 Ames 试验、骨髓微
核实验和小鼠精子致畸实验研究毛郁金醇提取的遗传
毒性。Ames试验是 20 世纪 80 年代由 Bruce Ames 提
出的评价遗传毒性的初筛方法，是一种快速、敏感的遗
·042· 毒理学杂志 2015 年 6 月第 29 卷第 3 期 J Toxicol June 2015 Vol. 29 No. 3
传毒性评价方法［16-17］。Ames 试验属于体外遗传毒性
试验，遗传学终点是基因突变，用于检测受试物是否可
以引起鼠伤寒沙门菌基因组碱基置换型或者移码型突
变。鼠伤寒沙门菌营养缺陷型菌株 TA97、TA98 可检
测移码型突变，TA100 可检测碱基置换型突变，TA100
除了可以检测碱基置换型和者移码型突变外，还可以
检测 DNA交联［18］。骨髓微核是目前最常用的哺乳动
物体内遗传毒理学试验，检测的遗传学终点是染色体
畸变 /非整倍体［19］。微核的产生与染色体断裂及纺锤
体受损有关，微核率的大小可间接反映染色体受损情
况。小鼠精子畸形试验是检测环境化学物质对生殖细
胞不同时期诱变性的一种体内实验，由于其对已知的
诱变剂高度敏感和对已知的致癌原因有高度的特异性
而在国内外毒理学研究工作中广泛应用［20］。小鼠精
子致畸实验可以检测受试物对精子生成、发育的影响，
而且对已知的生殖细胞致突变物有高度敏感性。本次
实验结果提示，在受试剂量范围内毛郁金 70%乙醇提
取物在体外 Ames 试验结果为阴性;未发现受试物对
实验小鼠骨髓细胞有致突变作用;对实验小鼠的精子
致畸作用与阴性对照组比较，差异无统计学意义。在
本实验条件下，通过体内、体外 2 种不同途径的遗传毒
性研究，结果表明毛郁金醇提物无明显遗传毒性作用，
临床口服用药具有较好的安全性。
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(收稿日期:2014 － 09 － 15)
·142·毒理学杂志 2015 年 6 月第 29 卷第 3 期 J Toxicol June 2015 Vol. 29 No. 3