全 文 ：第３２卷第６期
２０１４年１２月
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版）
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＨＡＮＧＨＡＩ　ＪＩＡＯＴＯＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．６
　 Ｄｅｃ．２０１４
文章编号：１６７１－９９６４（２０１４）０６－００１４－０９　 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－９９６４．２０１４．０６．００３
收稿日期：２０１３－１１－２７
基金项目：国家自然科学基金（３１１７０６５５、３１３７０６９５和３１３００５８０）
作者简介：何广深（１９８７－），男，硕士生，研究方向：园林植物与观赏园艺，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｇｓ．ｈｅｒｉｎｃｅ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ；
申晓辉（１９６２－）为本文通讯作者，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：园林植物种质资源保存与创新，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｘｈ６２＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
百子莲胚性愈伤组织在玻璃化法超低温保存４个
关键步骤中Ｃａ２＋的分布变化
何广深，张　荻，申晓辉
（上海交通大学 农业与生物学院，上海２００２４０）
摘　要：利用电镜细胞化学焦锑酸钾沉淀法及Ｃａ２＋荧光探针Ｆｌｕｏ－３ＡＭ染色法，研究了玻璃化法
超低温保存过程中预培养、装载、脱水和洗涤４个关键步骤对百子莲胚性愈伤组织细胞内Ｃａ２＋分
布情况及浓度变化的影响。结果表明，在预培养后细胞液泡内Ｃａ２＋数量多于细胞质基质，Ｃａ２＋主
要贴膜分布，且细胞内的Ｃａ２＋荧光强度降到最低值。经装载处理后，细胞内出现较多囊泡和淀粉
粒，在线粒体和囊泡中观察到Ｃａ２＋数量增多，淀粉粒周围有较多的Ｃａ２＋分布，细胞内的荧光强度
增加。经脱水处理后，细胞内的Ｃａ２＋荧光强度升高到最大值呈梯度分布，含有Ｃａ２＋的囊泡增多，
细胞内淀粉粒周围的Ｃａ２＋数量较多。经洗涤处理后，随着细胞内玻璃化溶液的减少，细胞内Ｃａ２＋
数量减少并且荧光强度降低，细胞质中Ｃａ２＋浓度回落到与对照相近的正常水平，淀粉粒数量增加
但周围Ｃａ２＋分布较少。在超低温保存处理过程中，细胞经受包含低温、渗透、氧化等复合胁迫，
Ｃａ２＋分布和浓度的变化可能对提高细胞低温抗性及抗氧化能力起到了一定作用。推测Ｃａ２＋的变
化决定了植物细胞在超低温保存过程中对复合胁迫的不同适应能力，为优化百子莲胚性愈伤组织
超低温保存体系提供了理论依据，为超低温保存过程中植物的细胞信号转导及生理调控机制提供
一定的理论基础。
关键词：百子莲；玻璃化法；超低温保存；钙离子分布
中图分类号：Ｓ６８２．１９　　　　文献标识码：Ａ
Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　Ｃａ２＋ｉｎ　Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　Ｃａｌｕｓ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ
ｐｒａｅｃｏｘ　Ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　４Ｋｅｙ　Ｓｔｅｐｓ　ｏｆ　Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ＨＥＧｕａｎｇｓｈｅｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｄｉ，ＳＨＥＮ　Ｘｉａｏ－ｈｕｉ
（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｙｒｏａｎｔｉｍｏｎａｔｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　Ｆｌｕｏ－３ＡＭ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　Ｃａ２＋ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ（ＥＣ）ｏｆ
Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｃａ２＋ｍａｉｎｌｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ａｎｄ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌ．
Ｔｈｅ　ｍｏｕｎｔ　ｏｆ　Ｃａ２＋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｂｙ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｙｒｏａｎｔｉｍｏｎａｔｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ
ｌｏａｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｗｈｉｌｅ　ｉｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｍｏｕｎｔ　ｏｆ　Ｃａ２＋ ｗａｓ
ｈｉｇｈｅｒ　ｉｎ　ｖａｃｕｏｌｅ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ　ｇａｔｈｅｒｅｄ　ｒｏｕｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔａｒｃｈ　ｇｒａｉｎ．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ２＋ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　Ｃａ２＋ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ａｆｔｅｒ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，
ｗｈｉｌｅ　ｂｒｏｕｇｈｔ　ｄｏｗｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｅｖｅｌ（ＣＫ）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ａｆｔｅｒ
第６期 何广深，等：百子莲胚性愈伤组织在玻璃化法超低温保存４个关键步骤中Ｃａ２＋的分布变化
ｄｉｌｕｔｉｏｎ．Ｉｔ　ｉｓ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　Ｃａ２＋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｍａｙ　ｂｅ　ｈｅｌｐｆｕｌ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ
ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＣ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ
ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｂａｓｉｓ　ｏｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｄｕｒｉｎｇ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＣ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ；ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；Ｃａ２＋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
　　百子莲（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘｓｕｂｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
Ｆ．Ｍ．Ｌｅｉｇｈｔ．）是起源于非洲南部的多年生根茎类
花卉［１］。２００２年，上海率先在国内引种百子莲后，
因受积温条件的影响种子繁殖率大幅度下降，我们
前期以花梗、叶片为外植体建立了体细胞胚胎培养
快速繁殖技术，且初步实现了胚性 愈 伤 组 织
（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ，ＥＣ）的玻璃化法超低温保存
（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）［２］。但由于百子莲
为热带植物，抗寒能力差，加之细胞内的含水量高达
９０％以上，对超低温保存处理过程中的低温、渗透胁
迫等更为敏感，冻后的恢复生长率仅为５０％左右，
由于长期的继代培养，百子莲ＥＣ逐渐出现了胚性
丧失现象，超低温保存技术可避免植物材料在长期
继代培养中的损失［３］。随着超低温保存技术的发
展，许多不同植物材料类型的保存，如种子、花粉、体
细胞胚、胚发生组织等已成功实现超低温保存［４］。
种质资源超低温保存也发展成多种类型的技术方
法，如玻璃化法、微滴玻璃化法、封装脱水法等［５］。
植物材料在超低温保存处理过程中经受多种逆
境胁迫，包括低温胁迫、渗透胁迫、氧化胁迫等，但是
这些逆境胁迫信号是如何被感知，进而在细胞内如
何进行传递，从而诱导了植物的生理调节机制仍不
清楚。在模式植物拟南芥的玻璃化法超低温保存研
究中发现，拟南芥幼苗经玻璃化溶液处理后主要经
受氧化胁迫，减少氧化损伤是超低温保存成功的一
个关键因素［６］。在百子莲玻璃化法超低温保存的研
究中发现，脱水处理的条件对植物材料的恢复生长
率影响最大［７］。目前关于热带植物的超低温保存的
报道较少，百子莲作为一种热带的观赏植物，对热带
植物超低温保存研究有着一定的代表性和较高的研
究价值。
Ｃａ２＋是植物体内重要的第２信使，在植物体内
的分布及浓度变化调节许多代谢过程［８］。Ｃａ２＋在
调节植物细胞对低温胁迫、水分胁迫和盐胁迫等逆
境胁迫信号转导过程中起着重要作用，最初反应几
乎都是通过细胞质中的Ｃａ２＋浓度变化起作用的，从
而调控生理代谢及基因表达［９］。张亚利研究了不同
品种梅花花粉超低温保存前后胞内钙离子变化，发
现超低温胁迫伴随着花粉钙离子浓度的升高，但国
内外对植物超低温保存处理过程植物材料细胞内
Ｃａ２＋浓度分布影响的报道较少［１０］。本研究利用电
镜细胞化学方法，观察 Ｃａ２＋ 亚细胞分布变化，用
Ｃａ２＋探针Ｆｌｕｏ－３ＡＭ染色法，通过激光共聚焦显微
镜观察Ｃａ２＋荧光强度变化，研究超低温保存过程中
预培养、装载、脱水和洗涤４个关键步骤处理对百子
莲胚性愈伤组织细胞内Ｃａ２＋分布情况及浓度变化
的影响，为进一步揭示植物超低温保存过程中生理
调控机制及信号通路转导提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　百子莲ＥＣ玻璃化法超低温保存４个关键步
骤样品的采集
本试验以百子莲胚性愈伤组织为供试材料，由
上海交通大学农业与生物学院园林植物种质工程实
验室提供。百子莲胚性愈伤组织在含１．０ｍｇ／Ｌ毒
莠定（ＰＩＣ）、３０ｇ／Ｌ蔗糖和１０ｇ／Ｌ琼脂粉的 ＭＳ培
养基上每隔３０ｄ继代１次，取继代培养２０ｄ后的胚
性愈伤组织作为对照和后续试验的材料。
预培养：将继代培养２０ｄ的ＥＣ（对照样品ＣＫ）
放在含有０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的 ＭＳ固体培养基上低温
（４℃）预培养２ｄ。
装载：将预培养后的ＥＣ置于装载液（２ｍｏｌ／Ｌ
丙三醇＋０．４ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３＋
ＭＳ液体培养基）中在室温下处理６０ｍｉｎ。
脱水：将装载后的ＥＣ移入ＰＶＳ２玻璃化溶液
（３０％丙三醇＋１５％二甲基亚砜＋１５％乙二醇＋０．４
ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋ＭＳ液体培养基）中在０℃下脱水处
理４０ｍｉｎ，脱水后立即将装有ＥＣ的ＰＶＳ２冷冻管
浸入液氮中冻存。
洗涤：液氮冻存１ｈ后，将冻存管置于４０℃水
浴中快速解冻９０ｓ，再转到室温下用去装载液（１．２
ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３＋ＭＳ液体培养
基）洗涤３次，每次间隔１０ｍｉｎ。
５１
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
１．２　Ｃａ２＋的亚细胞定位
Ｃａ２＋的电镜细胞化学研究采用焦锑酸钾钙沉
淀法，参照刘猛［１１］的方法略有改动。分别取上述４
个步骤处理后的愈伤组织０．１ｇ，用４℃预冷的０．１
ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ　７．４）配制的含２％焦锑酸钾
与３％戊二醛固定液固定２４ｈ。用含２％焦锑酸钾
的０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ　７．４）冲洗、丙酮梯度
脱水，Ｅｐｏｎ８１２树脂包埋，超薄切片，铀铅染色，１２０
ｋＶ透射电镜（ＦＥＩ，美国）观察细胞形态和焦锑酸钙
沉淀颗粒。
１．３　焦锑酸钙沉淀的能谱分析
参照葛丽丽［１２］的能谱分析方法。用装有能量
色散 Ｘ 射 线 分 析 仪 的 ＪＥＭ－２０１０ 型 透 射 电 镜
（ＪＥＯＬ，日本）检测观察到的黑色沉淀颗粒，分析其
组成成分。
１．４　Ｃａ２＋相对荧光值测定
１．４．１　原生质体制备及Ｃａ２＋荧光探针装载
百子莲 ＥＣ 的原生质体制备方法参照文峰
等［１３］稍有改动，其中酶液组成修改为纤维素酶Ｒ－１０
（２％，Ｙａｋｕｌｔ，日本）、纤维素酶ＲＳ（１％，Ｙａｋｕｌｔ，日
本）、离析酶Ｒ－１０（１％，Ｙａｋｕｌｔ，日本）、果胶酶Ｙ－２３
（０．５％，Ｙａｋｕｌｔ，日本）。选用Ｆｌｕｏ－３ＡＭ 型Ｃａ２＋荧
光探针，其装载方法参照刘刚等［１４］的方法，其中原
生质体与探针孵育时间修改为１ｈ。
１．４．２　Ｃａ２＋分布观察及相对荧光值测定
取Ｃａ２＋荧光探针孵育后的原生质体经超低温
保存４个关键步骤处理后制片，用Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ　ＳＰ５
型激光共聚焦显微镜（Ｌｅｉｃａ，德国）扫描观察，以波
长为４８８ｎｍ的激发光对原生质体进行扫描，并用
配套的ＬＡＳ　ＡＦ　Ｌｉｔｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．６．０）软件对观测
获得的图片进行分析。
２　结果与分析
２．１　百子莲ＥＣ超低温保存４个关键步骤处理的
细胞Ｃａ２＋亚细胞定位观察
２．１．１　正常继代培养（对照）
电镜观察结果见图１所示：正常继代培养的百
子莲ＥＣ（ＣＫ）细胞质膜结构完整、清晰，各细胞器
完好，标志Ｃａ２＋分布的焦锑酸钙沉淀颗粒主要分布
在细胞质基质中，液泡内只有少量的焦锑酸钙沉淀
颗粒（图１，ａ１）。在细胞质基质中，细胞器富集区域
焦锑酸钙沉淀颗粒分布较多（图１，ａ２）。线粒体是
细胞中最突出的细胞器，数量较多，在线粒体中可以
看到焦锑酸钙沉淀颗粒（图１，ａ３、ａ４）。表明在细胞
器富集、代谢活动旺盛区域，Ｃａ２＋分布数量较多。
图１　百子莲ＥＣ正常继代２０ｄ的细胞（对照）内Ｃａ２＋的分布情况
ＥＲ：内质网；ＬＢ：脂质体；Ｍ：线粒体；Ｖ：液泡。
Ｆｉｇ．１　Ｃａ２＋ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ＥＣ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ　ＥＣ　ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２０ｄ（ＣＫ）
ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ；ＬＢ：ｌｉｐｉｄ　ｂｏｄｙ；Ｍ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ；Ｖ：ｖａｃｕｏｌｅ．
６１
第６期 何广深，等：百子莲胚性愈伤组织在玻璃化法超低温保存４个关键步骤中Ｃａ２＋的分布变化
２．１．２　低温－高渗预处理
与对照处理相比，百子莲ＥＣ经低温高渗预培
养后发生了明显的质壁分离现象（图２，ｂ１），细胞
器紧贴细胞膜内侧排列分布，焦锑酸钙沉淀颗粒
在细胞器富集区域数量较多且贴膜分布，胞内细
胞核明显，核内也观察到少量的焦锑酸钙沉淀颗
粒（图２，ｂ３、ｂ４）。液泡内焦锑酸钙沉淀颗粒数量
增加，且分布不均匀，集中分布在液泡膜内侧（图
２，ｂ２）。表明这液泡膜上Ｃａ２＋跨膜运输系统调节
胞内Ｃａ２＋分布。
图２　百子莲ＥＣ预培养处理后细胞内Ｃａ２＋的分布情况
ＣＷ：细胞壁；ＥＲ：内质网；Ｍ：线粒体；Ｎ：细胞核；Ｖ：液泡。
Ｆｉｇ．２　Ｃａ２＋ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ＥＣ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ　ＥＣ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ
ＣＷ：ｃｅｌ　ｗａｌ；ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ；Ｍ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ；Ｎ：ｎｕｃｌｅｕｓ；Ｖ：ｖａｃｕｏｌｅ．
２．１．３　装载处理
百子莲ＥＣ细胞经装载溶液处理后，在电镜下
可见细胞质壁分离十分明显，细胞内的大液泡消失，
呈现出少量的小液泡（图３，ｃ１）。胞内及细胞核内
焦锑酸钙沉淀颗粒数量较对照和预培养明显增多
（图３，ｃ１）。细胞质基质内淀粉粒和脂质体的数量
明显增多，并且周围分布了较多细小的焦锑酸钙沉
淀颗粒（图３，ｃ２）。可见，在装载处理过程中胞内淀
粉粒的水解活动增强。在细胞内同时也出现了大量
的囊泡结构，在线粒体和囊泡中可以观察到焦锑酸
钙沉淀颗粒（图３，ｃ３、ｃ４）。
２．１．４　脱水处理
与装载处理相比，在电镜下观察发现百子莲ＥＣ
细胞质壁分离现象消失，说明经过装载和脱水处理，
渗透保护剂进入细胞内，细胞液浓度升高使细胞质
壁复原（图４，ｄ１）。细胞内的囊泡和焦锑酸钙沉淀
颗粒数量增多，多数囊泡贴膜分布（图４，ｄ１、ｄ２）。
贴细胞膜内侧分布的焦锑酸钙沉淀颗粒数量增多
（图４，ｄ３）。焦锑酸钙沉淀颗粒主要分布在脂质体
和囊泡分布集中区域，含有焦锑酸钙沉淀颗粒的囊
泡数量增多（图４，ｄ４）。并且在细胞内发现了焦锑
酸钙聚集沉淀（图４，ｄ３、ｄ４）。在脱水过程中可能由
于细胞器的降解导致胞内囊泡数量的增加，受损的
细胞器中的Ｃａ２＋转移到囊泡中。
２．１．５　洗涤处理
电镜下观察发现液氮冻存后细胞壁和质膜结
构完整；经洗涤溶液处理的百子莲ＥＣ细胞质壁分
离现象再一次出现，说明洗涤处理后细胞内渗透
保护剂排出胞外。与脱水处理比，胞内焦锑酸钙
沉淀颗粒的数量明显减少（图５，ｅ１）。细胞内细胞
器数量大幅减少，胞内淀粉粒和脂质体数量有所
增加（图５，ｅ２）。细胞核内焦锑酸钙沉淀颗粒的数
量与对照相比稍有增加，细胞质基质内有数量较
多的囊泡，部分焦锑酸钙沉淀颗粒包含在囊泡中，
同时发现了焦锑酸钙的聚集沉淀（图５，ｅ３）。在淀
粉粒密集区域分布着细小的焦锑酸钙沉淀颗粒
（图５，ｅ４）。
７１
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
图３　百子莲ＥＣ装载处理后细胞内Ｃａ２＋的分布情况
ＣＷ：细胞壁；ＥＲ：内质网；Ｇ：高尔基体；ＬＢ：脂质体；Ｍ：线粒体；Ｎ：细胞核；ＳＧ：淀粉粒。
Ｆｉｇ．３　Ｃａ２＋ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｅｌｓ　ｉｎ　ＥＣ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘａｆｔｅｒ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＣＷ：ｃｅｌ　ｗａｌ；ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ；Ｇ：ｇｏｌｇｉ　ａｐｐａｒａｔｕｓ；ＬＢ：ｌｉｐｉｄ　ｂｏｄｙ；Ｍ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ；Ｎ：ｎｕｃｌｅｕｓ；ＳＧ：ｓｔａｒｃｈ　ｇｒａｉｎｓ．
图４　百子莲ＥＣ脱水处理后的细胞内Ｃａ２＋的分布情况。
ＣＷ：细胞壁；ＬＢ：脂质体；Ｎ：细胞核；ＳＧ：淀粉粒；ＶＥＳ：囊泡。
Ｆｉｇ．４　Ｃａ２＋ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ＥＣ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘａｆｔｅｒ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＣＷ：ｃｅｌ　ｗａｌ；ＬＢ：ｌｉｐｉｄ　ｂｏｄｙ；Ｎ：ｎｕｃｌｅｕｓ；ＳＧ：ｓｔａｒｃｈ　ｇｒａｉｎｓ；ＶＥＳ：ｖｅｓｉｃｌｅｓ．
２．２　焦锑酸钙沉淀颗粒组分的能谱分析
利用Ｘ射线能谱仪对观察到的焦锑酸钙黑色
沉淀颗粒进行组分分析（图６）。沉淀颗粒的主要元
素包括Ｃｌ、Ｃ、Ｃａ、Ｏ、Ｃｕ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ及Ｓｂ，并且在３．１
～４．６ｋｅＶ可以看到钙和锑的重合峰，此结果证明
该沉淀颗粒为焦锑酸钙，即细胞中的钙离子与焦锑
酸钾结合形成的沉淀。
２．３　百子莲ＥＣ超低温保存过程４个关键步骤中
Ｃａ２＋荧光变化测定
利用激光共聚焦显微镜对对照及超低温保存４
个关键步骤样品进行观察，结果如图７所示。与电
镜观察结果相同，对照处理的细胞内Ｃａ２＋分布较
８１
第６期 何广深，等：百子莲胚性愈伤组织在玻璃化法超低温保存４个关键步骤中Ｃａ２＋的分布变化
图５　洗涤处理后的百子莲胚性愈伤组织细胞内Ｃａ２＋的分布情况
ＣＷ：细胞壁；ＬＢ：脂质体；Ｎ：细胞核；ＳＧ：淀粉粒；ＶＥＳ：囊泡。
Ｆｉｇ．５　Ｃａ２＋ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ＥＣ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘａｆｔｅｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＣＷ：ｃｅｌ　ｗａｌ；ＬＢ：ｌｉｐｉｄ　ｂｏｄｙ；Ｎ：ｎｕｃｌｅｕｓ；ＳＧ：ｓｔａｒｃｈ　ｇｒａｉｎｓ；ＶＥＳ：ｖｅｓｉｃｌｅｓ．
图６　百子莲ＥＣ细胞内沉淀颗粒的Ｘ射线
能谱分析结果
Ｘ轴是发射的Ｘ射线的能量，单位为ｋｅＶ；Ｙ轴是Ｘ射线从０
到满标的刻度。
Ｆｉｇ．６　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ＥＣ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ
ｂｙ　ｅｎｅｒｇｙ－ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ　Ｘ－ｒａｙ
Ｘ－ａｘｉｓ　ｉｓ　ｔｈｅ　Ｘ－ｒａｙ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ，ｕｎｉｔｓ　ｉｓ　ｋｉｌｏｖｏｌｔ；Ｙ－ａｘｉｓ　ｉｓ
ｔｈｅ　Ｘ－ｒａｙ　ｆｒｏｍ　０ｔｏ　ｆｕｌ　ｓｃａｌｅ．
均匀，细胞内细胞器分布密集的区域Ｃａ２＋信号较强
（图７，ａ１～ａ３）。与对照相比，预培养后的Ｃａ２＋荧光
强度稍有降低，但细胞膜和液泡膜Ｃａ２＋荧光强度增
加，说明 Ｃａ２＋ 贴细胞膜和液泡膜分布，细胞膜上
Ｃａ２＋浓度较高，这与透射电镜观察的Ｃａ２＋分布情况
相同（图７，ｂ１～ｂ３）。装载处理后的细胞内Ｃａ２＋分
布趋势与对照相似，但荧光信号强度与预培养比有
所降低（图７，ｃ１～ｃ３）。而脱水处理后的细胞内
Ｃａ２＋荧光信号强度明显升高且分布不均匀，呈现外
高内低的梯度分布，细胞形态经玻璃化溶液处理后
稍有变形。细胞膜上Ｃａ２＋荧光强度增加，并且在细
胞内观察到较多信号较强的荧光点，这与透射电镜
观察到焦锑酸钙的聚集沉淀结果一致（图７，ｄ１～
ｄ３）。冻存后洗涤处理的细胞Ｃａ２＋荧光信号强度下
降明显，并未发现Ｃａ２＋明显的分布特征，细胞中的
Ｃａ２＋分布正在逐渐恢复静息态水平（图７，ｅ１～ｅ３）。
实验同时观察了阴性对照，确定观察到的荧光信号
是Ｆｌｕｏ－３ＡＭ与胞内Ｃａ２＋结合后产生的，而非细胞
自发荧光信号（图７，ｆ１～ｆ２）。
２．４　超低温保存过程４个关键步骤对百子莲ＥＣ
细胞内Ｃａ２＋荧光强度变化的影响
在超低温保存过程４个关键步骤中，Ｃａ２＋荧光
强度总体变化幅度不大，结果如图８所示。低温－
高渗预培养后Ｃａ２＋荧光强度降到最低，说明Ｃａ２＋
对预培养产生的信号反应敏感。装载处理后稍有升
高，脱水处理后Ｃａ２＋荧光强度最高，经洗涤处理后
Ｃａ２＋荧光强度恢复到与对照相当的水平。其中预
培养与脱水处理的细胞Ｃａ２＋浓度具有显著差异荧
光强度变化趋势与电镜观察的结果相符。荧光信号
的强弱可反映Ｃａ２＋浓度的大小，表明在预培养过程
中，细胞生理活动由于低温受到抑制，在脱水处理过
程中，玻璃化溶液对细胞影响较大，细胞生理调控的
活动较多。
９１
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
图７　超低温保存关键步骤处理后Ｃａ２＋荧光分布变化的伪彩图
ａ１～ａ３：对照；ｂ１～ｂ３：预培养；ｃ１～ｃ３：装载；ｄ１～ｄ３：脱水；ｅ１～ｅ３：洗涤；ｆ１～ｆ２：阴性对照。
Ｆｉｇ．７　Ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒ　ｉｍａｇｅ　ｏｆ　Ｃａ２＋ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ａ１～ａ３：ｃｋ；ｂ１～ｂ３：ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ；ｃ１～ｃ３：ｌｏａｄｉｎｇ；ｄ１～ｄ３：ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ；ｅ１～ｅ３：ｄｉｌｕｔｉｏｎ；ｆ１～ｆ２：ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ．
０２
第６期 何广深，等：百子莲胚性愈伤组织在玻璃化法超低温保存４个关键步骤中Ｃａ２＋的分布变化
图８　超低温保存４个关键步骤处理对百子莲ＥＣ细胞内
Ｃａ２＋荧光强度变化的影响
（数据差异性多重比较Ｆ＝０．０５）
Ｆｉｇ．８　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　Ｃａ２＋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
ａｆｔｅｒ　４ｋｅｙ　ｓｔｅｐ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　Ｆ＝０．０５）
３　讨论
本实验发现正常状态下的百子莲 ＥＣ细胞内
Ｃａ２＋主要分布于液泡、细胞质和细胞核，而线粒体
中 Ｃａ２＋ 含 量 少，此 结 果 与 王 凤 茹 等 对 小 麦
（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｖｕｍ Ｌ．）细胞内Ｃａ２＋分布研究结果
一致［１５］。在细胞器聚集、代谢活动旺盛的区域
Ｃａ２＋分布较多，说明Ｃａ２＋分布情况与植物细胞生理
活动强弱有关。为进一步证实实验中所观察到的沉
淀颗粒确实为焦锑酸钙沉淀，用能谱分析了黑色沉
淀颗粒的成分，获得的结果中含有钙元素和锑元素
的重合峰，这与曹一博等对枣（Ｚｉｚｙｐｈｕｓ　ｊｕｊｕｂａ
Ｍｉｌ．）果实内Ｃａ２＋沉淀颗粒组分能谱分析的结果
相符［１６］。利用Ｃａ２＋荧光探针染色结合激光共聚焦
显微镜扫描观察到的结果进一步印证了透射电镜观
察的结果。关于低温胁迫对植物细胞内Ｃａ２＋变化
影响的研究已有报道，刘炜等对冬小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）的研究发现低温胁迫短时间内能提高
植物细胞内Ｃａ２＋含量，曾爱松等研究甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｏｌｅｒａｃａ　Ｌ．）幼苗经－２℃低温处理４８ｈ后细胞内
Ｃａ２＋分布变化发现，液泡内和细胞间隙中的Ｃａ２＋数
量显著减少，细胞基质和细胞膜上Ｃａ２＋分布数量较
多［１７－１８］。百子莲ＥＣ细胞经４℃的预培养处理４８ｈ
后，细胞内 Ｃａ２＋ 含量降低，细胞膜上 Ｃａ２＋ 数量较
多，这与曾爱松等的研究结果相符［１８］。Ｃａ２＋贴膜分
布的原因可能是在低温条件下Ｃａ２＋通过细胞膜及
液泡膜上的通道进入细胞质中的结果。简令成等在
对玉米低温条件下细胞Ｃａ２＋动态变化的研究中发
现：冷敏感的玉米细胞在４℃低温处理１２ｈ后，其
质膜Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ活性显著降低甚至失活［１９］。百
子莲ＥＣ胞内Ｃａ２＋浓度降低可能是由于低温胁迫
和渗透胁迫下细胞生理代谢受到抑制，质膜Ｃａ２＋－
ＡＴＰａｓｅ活性降低导致的。预培养时间过长导致细
胞Ｃａ２＋的调节能力下降，适当的缩短预培养的时间
可能提高超低温保存的恢复生长率。
植物对逆境胁迫感受和适应过程中Ｃａ２＋起着
感受和传递胁迫信号的作用，在超低温保存过程中
装载处理和脱水处理２个关键步骤对植物材料细胞
内Ｃａ２＋的分布情况和浓度的影响尚未见报道，任丽
等研究拟南芥玻璃化法超低温保存中发现植物材料
在冷冻保护剂的处理中主要经受着一系列活性氧簇
（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）产生的氧化胁迫，活
性氧簇包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等，导
致细胞膜脂过氧化，损坏细胞膜结构和功能［６］。杜
俊变等报道过氧化胁迫及缺氧均可引起Ｃａ２＋浓度
增加，诱发植物细胞产生钙信号，活性氧的产生与清
除与Ｃａ２＋－ＣａＭ 信号系统密切相关［２０］。龚伟等研
究发现Ｃａ２＋浓度能影响细胞质膜的稳定性，Ｃａ２＋浓
度的增加能够提高超氧化物岐化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ
ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）、过氧化物酶（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ）、
过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）等保护酶的活性，抵御
活性氧簇对细胞的伤害［２３］。经过装载处理和脱水
处理，百子莲胚性愈伤组织细胞内Ｃａ２＋逐渐增多，
变化趋势与上述研究结果相符，说明Ｃａ２＋在细胞抗
氧化过程中起到了一定的作用。由于装载温度为室
温，脱水处理为０℃，处理温度的降低导致脱水处理
后细胞内Ｃａ２＋继续增高。装载、脱水及洗涤处理过
程中，淀粉粒的数量逐渐增多，可能由于淀粉水解为
可溶性糖提高细胞内的渗透压，降低自由水含量，减
少冻存中冰晶形成的机械损伤。淀粉粒周围分布着
较多Ｃａ２＋，推测Ｃａ２＋浓度升高产生的信号与细胞
内淀粉的水解关系密切。脱水处理后细胞内细胞器
的消失及大量囊泡的出现，可能是复合胁迫引起的
内质网和高尔基体空泡化，以及同心圆内质网的聚
集。植物材料经洗涤处理后，细胞内玻璃化溶液含
量迅速减少，洗涤后细胞内Ｃａ２＋浓度恢复到对照处
理水平，说明脱水处理中玻璃化溶液是影响植物细
胞内Ｃａ２＋浓度和分布情况的主要原因，脱水处理也
是超低温保存处理步骤中最重要的一步，在脱水处
理中添加抗氧化的物质降低氧化胁迫对细胞的伤害
是提高超低温保存成功率的关键。
１２
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
本研究结果初步表明了超低温保存过程中４个
关键处理步骤预培养、装载、脱水和洗涤对百子莲胚
性愈伤组织细胞内Ｃａ２＋分布情况及浓度变化的影
响，为优化百子莲ＥＣ超低温保存体系提供了理论
依据，同时也可为超低温保存过程中植物的生理调
控机制提供一定的理论基础。
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