全 文 ：中国农业科学 2004,37(12):2023-2027
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2003-08-25
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30270925）
作者简介： 艾鹏飞(1974-)，男，湖北浠水人，博士研究生，主要从事柿属植物种质保存研究。罗正荣为通讯作者, Tel: 027-87282677; Fax: 027-87282095;
E-mail: luozhr@mail.hzau.edu.cn


柿和君迁子试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及
再生植株遗传稳定性研究
艾鹏飞，罗正荣
(华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室, 武汉 430070)

摘要：对柿（Diospyros kaki Thunb.）和君迁子（D. lotus L.）试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及再生植
株遗传稳定性进行了研究。结果表明，试管苗在添加有蔗糖0.3 mol·L-1的改良 MS培养基 （KNO3和NH4NO3减半）
上，于低温6±1℃下锻炼6周后，切取侧芽茎尖1.5～2.0 mm在含蔗糖0.7 mol·L-1的改良MS培养基上预培养2 d，
室温（20℃）下装载液（2.0 mol·L-1甘油＋0.4 mol·L-1蔗糖）过渡20 min，0℃下玻璃化液PVS2(30%甘油＋15%乙
二醇＋15%二甲基亚砜＋0.4 mol·L-1蔗糖)处理80 min，换成新鲜的PVS2后投入液氮保存1 d，40℃水浴化冻1 min，
含蔗糖1.2 mol·L-1的改良MS培养基洗涤20 min，接种于含0.2 mg·L－1 CPPU、1.0 mg·L－1 BA、0.05 mg·L－1 IAA、
500 mg·L－1 可溶性PVP、30 g·L－1蔗糖和7 g·L－1琼脂的改良MS培养基（再生培养基）的滤纸上，暗处理1 d后转
移到新鲜的上述再生培养基中，暗培养1周后转到正常光下，再生率超过30%；再生植株通过细胞学和AFLP标记
检测，没有发现核DNA含量、染色体数目和AFLP谱带的改变。该结果为柿属植物种质资源的长期保存提供了理论
依据。
关键词: 柿；君迁子；玻璃化法；超低温保存；遗传稳定性

Cryopreservation of in vitro Shoot-Tips of Persimmon and Date Plum
by Vitrification and Genetic Stability of Regenerated Plantlets
AI Peng-fei, LUO Zheng-rong
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education / College of Horticulture and Forestry,
Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

Abstract: Shoot-tips, 1.5–2.0 mm in size, excised from axillary buds of in vitro shoots of persimmon (Diospyros kaki Thunb.)
and date plum (D. lotus L.) cold-hardened on the modified MS medium with nitrates reduced to half strength [MS(1/2N)]added with
0.3 mol·L-1 sucrose at 6±1℃, that were precultured on MS(1/2N) medium supplemented with 0.7mol·L-1 sucrose for 2 days, were
loaded with MS（1/2N）medium supplemented with 2 mol·L-1 glycerol and 0.4 mol·L-1 sucrose for 20 min at 20℃, and incubated in
PVS2 for 80 min at 0℃ prior to direct plunge into liquid nitrogen. After rapid thawing for 1 min in water at 40℃, the shoot-tips were
rinsed in MS（1/2N）medium supplemented with 1.2 mol·L-1 sucrose for 20 min，plated on the filter paper sustained by the MS（1/2N）
regeneration medium supplemented with 0.2 mg·L－1 CPPU，1.0 mg·L－1 BA, 0.05 mg·L－1IAA , 500 mg·L－1soluble PVP, 30
g·L-1sucrose and 7 g·L－1agar for 1 day in dark and subcultured on the above regeneration medium for one week in dark prior to
exposure to the light. The shoots formation was over 30% after 6 weeks. And the genetic stability of regenerated plantlets examined
on cytological and AFLP-based molecular levels. As a result, there were no variations in DNA content, chromosome number and
AFLP patterns. The result provided a feasible proof of conservation Diospyros spp. through cryopreservation of in vitro shoot-tips by
vitrification for long term.
Key words: Persimmon; Date plum; Vitrification; Cryopreservation; Genetic stability
2024 中 国 农 业 科 学 37卷
植物种质资源，圃地活体保存易遭受病虫害的侵
袭和极端环境的威胁。试管保存，长期离体培养需定
期继代，且可能会引起遗传变异。超低温保存可克服
以上弊端，已日益受到人们的重视[1]。其中，近几年
发展起来的玻璃化法（vitrification）具有设备简单、
易操作、保存后再生率高和重演性好等优点而倍受青
睐，国内外已有很多的成功报道[2～6]。最近，Matsumoto
等[7]和艾鹏飞等[8]对柿休眠芽茎尖玻璃化超低温保存
进行过尝试。但其取材受季节和距离限制，保存过程
中材料需灭菌，易引起污染（尤其是带有内生菌的芽
体）。另外，对保存后再生植株的遗传稳定性尚未进
行评价。本试验以柿和君迁子试管苗茎尖为试材，对
其玻璃化法超低温保存条件和保存后再生植株遗传变
异进行了探讨，以期为柿属植物种质资源的离体保存
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
柿品种次郎（D. kaki Thunb. cv. Jirou）、罗田甜
柿（D. kaki Thunb. cv. Luotiantianshi）和君迁子（D.lotus
L., Date plum），以休眠芽茎尖为外植体，按文献[8]
建立起试管苗无性系。
1.2 方法
1.2.1 预处理与保存 4周龄的试管苗嫩梢(0.8～1.0
cm)继代到不同蔗糖浓度的改良 MS 培养基[KNO3和
NH4NO3减半，MS（1/2N）]，低温 6±1℃和弱光照
800 lx（12 h·d-1）条件下锻炼 1～12周，切取 1.5～2.0
mm茎尖，直接在含不同蔗糖浓度的MS（1/2N）培养
基上预培养 2 d，转移到 1.8 ml冻存管中（每管不少
于10个茎尖），加入装载液（2 mol·L-1甘油＋0.4 mol·L-1
蔗糖）1.0 ml，室温 20℃过渡 20 min，玻璃化液
PVS2(30%甘油＋15%乙二醇＋15%二甲基亚砜＋0.4
mol·L-1蔗糖) 0℃下处理不同时间后，换成新鲜的 PVS2
后迅速投入液氮保存。每处理 2管，重复 3次。
1.2.2 解冻与再培养 液氮保存 1 d后，从液氮中取
出冻存管，40℃水浴解冻（1 min 左右）后吸除保护
液，1.2 mol·L-1蔗糖的MS(1/2N)培养液洗涤 2次，每
次 10 min。取出茎尖，无菌滤纸吸去残留在其表面的
洗 涤 液 ， 接 种 到 恢 复 培 养 基 [MS(1/2N)＋ 0.2
mg·L-1CPPU＋1.0 mg·L-1BA＋0.05 mg·L-1 IAA＋500
mg·L-1PVP]的滤纸上暗处理 1 d，转接到新鲜的恢复培
养基中，暗培养 1周后转入光下（25±2℃，1 500 lx）。
6周后统计再生率（再生成嫩梢的茎尖数/总茎尖数×
100%）。
1.2.3 遗传稳定性检测 参照 Hao 等[1]分别建立起
各材料单芽姊妹系，对保存后各姊妹系的再生植株进
行了遗传稳定性检测。以保存前的单芽姊妹系为对照，
参照张俊娥等[9]检测核 DNA 含量；参照唐仙英等[10]
观测细胞染色体数；CTAB法[11]提取次郎和罗田甜柿
叶片 DNA，参照 Vos等[11]进行 AFLP分析。
2 结果与分析
2.1 低温锻炼对茎尖超低温保存后再生率的影响
表 1表明，在低温 6±1℃条件下，随着低温锻炼
时间延长，3 种基因型茎尖超低温后再生率增加，到
一定时间后保持在 21%～25%间不变。其中，蔗糖 0.1
mol·L-1时需要 9 周，0.3 mol·L-1时需要 6 周。因此，
低温锻炼效果以添加 0.3 mol·L-1蔗糖为佳。

表1 低温锻炼时间对柿和君迁子试管苗茎尖超低温保存
后再生率的影响
Table 1 Effect of duration of cold-hardening on shoots
formation of in vitro shoot-tips of persimmon and
date plum cryopreserved by vitrification
种或品种 Species or cultivars 蔗糖浓度
Sucrocse
concentration
低温培养时间
Cold-hardening
time(weeks)
次郎 罗田甜柿 君迁子
Jirou Luotiantianshi Date plum
0.1 mol·L-1 0 0.0 e 0.0 e 0.0 d
1 3.6 e 3.3 de 2.1d
3 9.8 cd 11.4 bc 9.6 c
6 14.7 bc 16.1 b 14.6 b
9 24.6 a 23.7 a 21.4 a
12 23.9 a 23.8 a 23.5 a
0.3 mol·L-1 0 0.0 e 0.0 e 0.0 d
1 8.2 de 7.8 cd 8.7 c
3 15.7 b 16.2 b 10.4 bc
6 23.3 a 23.1 a 22.1 a
9 24.1 a 22.7 a 21.9 a
12 24.7 a 23.2 a 22.3 a
同列内相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在 P＜0.05 水平上差异
不显著。下同
Means within same columns followed by the same letter are not
significantly different at 0.05 level by Duncan’s new multiple test. The
same as below

2.2 预培养蔗糖浓度对茎尖超低温保存后再生率的影
响
不同预培养处理的试管苗茎尖超低温保存结果见
表 2。0.5 mol·L-1和 0.7 mol·L-1蔗糖各 1 d（处理 3）或
0.7 mol·L-1蔗糖 2 d（处理 4）的培养，超低温保存后
再生率最高，其余次之（处理 2、5、6），没有经过
预培养时最低（处理 1）。其原因可能与蔗糖浓度过
12期 艾鹏飞等：柿和君迁子试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性研究 2025
低时细胞脱水不彻底，过高时又引起渗透胁迫有关。
2.3 PVS2处理时间对茎尖超低温保存后再生率的影
响
本试验观察到，室温（20℃）时 PVS2中的 DMSO
对材料的毒害作用较大，故采用 0℃下处理。由图 1
可知，3种基因型茎尖，未经 PVS2处理时不能成活，
随处理时间的延长再生率先增高然后降低，至 80 min
时均达最大值。

表2 预培养蔗糖浓度对柿和君迁子试管苗茎尖超低温保
存后再生率的影响
Table 2 Effect of concentration of sucrose in preculture on
shoots formation of in vitro shoot-tips of persimmon
and date plum cryopreserved by vitrification
种或品种 Species or cultivars 处理编号
No. of
treatment
蔗糖浓度 1)
Concentration of
sucrose(mol·L-1)
次郎 罗田甜柿 君迁子
Jirou Luotiantianshi Date plum
1 CK 5.4 c 5.7c 6.2 c
2 0.5 (2 d) 16.1 b 14.9 b 11.5 b
3 0.5 (1 d)＋0.7 (1 d) 23.5 a 24.3 a 21.7 a
4 0.7 (2 d) 24.1 a 23.8 a 20.4 a
5 0.7 (1 d)＋1.0 (1 d) 16.7 b 16.1 b 13.4 b
6 1.0 (2 d) 17.1 b 15.3 b 13.1 b
1)括号内为处理时间 The date in bracket was treatment time




图1 PVS2 处理时间对柿和君迁子茎尖超低温保存后再生
率的影响
Fig.1 Effect of duration of exposure to PVS2 on shoot
formation of in vitro shoot-tips of persimmon and date
plum cryopreserved by vitrification

2.4 取芽部位对茎尖超低温保存后再生率的影响
本试验发现，试管苗不同部位芽的茎尖超低温保
存后再生率也不相同（表 4）。顶芽茎尖保存后不易
成活，腋芽茎尖保存后再生率较高，次郎和罗田甜柿
都在 30%以上，君迁子也达到 26.2%。其原因可能与
芽的着生位置不同，其茎尖细胞生理状态也不尽相同
有关。
表4 芽的着生位置对柿和君迁子试管苗茎尖超低温保存
后再生率的影响
Table 4 Effect of bud location on the shoots formation of
cryopreserved in vitro shoot-tips of persimmon and
date plum by vitrification
种或品种 Species or cultivars 芽着生位置
Location of buds 次郎
Jirou
罗田甜柿
Luotiantianshi
君迁子
Date plum
顶芽 Apical buds 9.8 b 11.9 b 8.7 b
腋芽 Axillary buds 32.7 a 31.9 a 26.2 a

2.5 植株再生及其遗传稳定性检测
保存后的茎尖转移到再生培养基上，经过一段时
间的停滞期后直接萌发、生长（图 2 a，b）；再生植
株诱导生根容易，根条数多（图 2 c）。根尖细胞的染
色体没有出现缺失或增加：君迁子（2n＝2x=30）、
次郎（2n＝6x=90）和罗田甜柿（2n=6x=90）（图 3）；
分别取 3 种基因型超低温保存后再生的单芽姊妹系各
10 株进行遗传稳定性检测，叶片细胞的核 DNA含量
也没有发生改变（图 4）；次郎和罗田甜柿的 AFLP
分析结果（表 5）表明，21 对选择性引物在次郎 10

表5 超低温保存后再生植株AFLP分析
Table 5 AFLP profile of regenerated plantlets after
cryopreservation by vitrification
带数 Sum of bands
次郎 Jirou 罗田甜柿 Luotiantianshi
保存前
Before cryopreservation
1 102/1 1 067/1
保存后
After cryopreservation
11 020/10 10 670/10
多态性带
Sum of polymorphic bands
0 0
多态性
Polymorphism (%)
0.0 0.0
次郎和罗田甜柿分别用 21对和 20对选择性引物扩增。“/”前为总带数，
后为单芽姊妹系株数
‘Jirou’ and ‘Luotiantiansi’ were selectively amplified with 21 and 20
primer combinations respectively. The number before “/” was total bands，
and after was total plantlets


a、b. 次郎试管苗茎尖超低温保存后恢复培养 2周、6周; c. 再生植株生
根
a, b. The shoot-tips of ‘Jirou’ regenerated two weeks and six weeks,
respectively

图2 超低温保存后次郎植株再生
Fig. 2 Regeneration of ‘Jirou’ after its shoot-tips in vitro
cryopreserved by vitrification
2026 中 国 农 业 科 学 37卷


图 3 君迁子(d)、次郎(e)和罗田甜柿(f)再生植株染色体
Fig. 3 Chromosome number of root-tip cells of regenerated
plantlets of date plum(d), Jirou(e) and Luotiantianshi (f),
respectively

个单芽姊妹系上共扩增出 11 020条带，平均每个单芽
姊妹系 1 102 条带，与保存前的对照相比，没有发现
多态性带（图 5-a）。同样，罗田甜柿的 20对选择性
引物扩增带中，也没有发现变异带（图 5-b）。该结
果说明柿试管苗茎尖在玻璃化法超低温保存过程中可
能没有发生遗传物质的改变。
3 讨论
前人[7, 8]已报道了柿休眠芽茎尖超低温保存，但未


图 4 超低温保存前、后君迁子（a）和次郎(b)核 DNA含量
Fig.4 Contents of cell nuclear DNA of regenerated plantlets cryopreserved and non-cryopreserved in Date plum (a) and in Jirou (b)
respectively



M．DNA分子量标准, a. 保存前的 1个单芽姊妹系, a1～a10。保存后的 10个单芽姊妹系
M. Marker:pBR322 DNA/MspⅠ; a. 1 noncryopreserved single-bud line; a1－a10。10 cryopreserved single-bud lines

图 5 超低温保存前、后次郎（a）和罗田甜柿(b)AFLP 图谱
Fig.5 AFLP pattern of regenerated plantlets of Jirou(a) and Luotiantianshi(b) respectively, detected by M-CAA/E-ACG primer
12期 艾鹏飞等：柿和君迁子试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性研究 2027
涉及试管苗茎尖。相对于休眠芽茎尖，试管苗茎尖没
有经过自然的抗寒锻炼过程中已发生的保护性脱水及
其它提高抗寒力的变化，故超低温保存难度较大。但
其取材方便，操作简便，特别是避免了内生菌污染的
干扰，因此具有更大的实用价值。
超低温保存成功与否，除了与材料的基因型有较
大关系外，还与材料的生理状态相关。低温锻炼和预
培养是改变保存材料生理状态的重要步骤[2]。低温锻
炼可以激活植物体内的抗寒机制，如提高脯氨酸、多
胺的含量及胞液的渗透势等，从而提高抗寒力。预培
养增强细胞分裂与分化的同步化，降低冰点从而阻止
冻存过程中冰晶生长对细胞膜的伤害。本试验中，以
试管苗茎尖为试材、6±1℃低温锻炼、高浓度蔗糖预
培养和 PVS2 保护性脱水都是为了改变试材的细胞生
理状态，有利于超低温保存后成活和再生。同一试管
苗上不同位置芽的茎尖超低温保存难易程度也不一
样，这在葡萄的超低温保存上已有报道[6]，本试验也
得出与此一致的结论。但其确切原因有待进一步研究。
影响超低温保存材料遗传稳定性的因素很多，除
基因型外，主要是试材和保存方法。本试验应用玻璃
化法对柿和君迁子试管苗茎尖进行超低温保存后，由
于再生培养时茎尖直接萌发成株，没有经过愈伤组织
阶段，减少了引起遗传变易的机率，在一定程度上保
证了再生植株的遗传稳定性。应该指出的是，再生培
养时，发现部分再生苗直接在再生培养基上生根，不
需要生根培养基的诱导。这说明超低温保存过程中的
非常态（特别是急剧升、降温和渗透胁迫）可能引起
了再生植株生理状态的某些改变，具体原因有待探讨。
但是，对以种质资源保存为根本目的的遗传稳定性分
析，应该把期望性状的遗传稳定性为最终标准，进行
多种方法的综合评价。
综上所述，玻璃化法超低温保存柿和君迁子试管
苗茎尖安全、简便、实用，在柿属植物种质资源的保
存中值得推广和应用。

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（责任编辑 曲来娥）