全 文 ：微生物学通报 APR 20, 2008, 35(4): 529~532
Microbiology © 2008 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：广东省教育厅自然科学基金(No. 0409017); 广东省科技厅农业攻关项目(No. 2006B20301042)
* 通讯作者：Tel: 0759-2396186; : yul@gdou.edu.cn
收稿日期：2007-09-24; 接受日期: 2007-12-08
研究报告
富贵竹黑腐病拮抗菌 H5的抑菌机制及
相关特性研究
陈 曼 李 赤 邱逸斯 王建余 于 莉*
(广东海洋大学农学院 湛江 524088)


摘 要: 从湛江红树植物-红海榄筛选出 1株对引起富贵竹病害黑曲霉病菌(Aspergillus niger)有良
好抑制作用的菌株编号为 H5, 初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。该菌株采用平板
对峙、生长速率法及管碟法对黑曲霉均表现良好的抑制作用, 发酵原液对菌丝生长和孢子萌发的
抑制率分别为 91.9%和 100%, 抑菌带内菌丝扭曲畸形、表面产生大量囊状突起。其无菌滤液对酸
碱、热稳定性较好, 经 55%硫酸铵沉淀后经 121℃处理 25 min 仍能保持大部分活性, 初步推测该
物质为一种耐热的蛋白。
关键词: 地衣芽孢杆菌, 红树林细菌, 抑菌特性
Antagonistic Mechanisms and Related Properties of Strain
H5 Against Black-rot Disease of Dracaena sanderiana
CHEN Man LI Chi QIU Yi-Si WANG Jian-Yu YU Li*
(College of Agriculture, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088)
Abstract: A strain no. H5 isolated from Rhizophora stylosa Griff in Zhanjiang had a good antagonistic activ-
ity against Aspergillus niger, pathogen of Dracaena Sanderiana black-rot disease. It was identified as Ba-
cillus licheniformis. Dual culture, mycelium growth rate and inhibitory zones were used to test the effect.
Strong inhibition was shown against A. niger. Inhibitory ratios of H5 germ-free fermented filtrate on myce-
lium growth and conidial germination were 91.9% and 100% respectively. In addition, mycelia on the edge
of antagonistic band became abnormal and over-branching. Meanwhile, a lot of vesicles appeared on the
surface. When treated with heat, acid and alkali, the filtration of H5 was always with stable activity. Precipi-
tate in 55% saturated ammonium sulfate dissolved in phosphate buffer solution maintained most of the activ-
ity after high pressure steam sterilization for 25 minutes. It was preliminarily considered as a kind of heat re-
sistant protein.
Keywords: Bacillus licheniformis, Mangrove bacteria, Antagonistic mechanism
富贵竹黑腐病(Black-rot disease)是富贵竹采后
加工最主要病害之一, 该病主要造成富贵竹竹条腐
烂, 严重影响富贵竹竹条的加工和出口质量。目前
在加工和出口运输途中主要使用化学杀菌剂来控制
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2008.04.028
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病害, 其效果并不理想, 整批退货的情况时有发生。
湛江有着丰富的红树林资源, 红树林是介于陆地和
海洋之间的特殊生态系统, 存在着微生物的多样性[1],
近年很多学者开始从极端环境中筛选拮抗微生物 ,
并从海洋微生物的代谢产物中发现多种活性物
质[1−3], 应用于医药、工业和农业等领域。本文从红
树林植物分离微生物筛选对黑曲霉(Aspergillus niger
V. Tiegh)具有抑制作用的微生物。富贵竹黑腐病有
关生物防治的研究至今在国内外还未见报道。笔者
从湛江沿海红树林植物分离筛选具有抑制作用的菌
株, 其目的是寻找新的拮抗菌株或抗菌活性物质。
本文主要报道强拮抗菌株 H5抑菌机理及相关特性。
1 材料与方法
1.1 供试菌株及培养基
H5 菌株从红树林植物—— 红海榄(Rhizophora
stylosa Griff)根部分离得到 , 经 BiologTM 和 16S
rDNA 测序鉴定为地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheni-
formis)(文章待发表)。指示菌为 Aspergillus niger从
富贵竹上分离纯化得到, 并保存在本实验室。
细菌的培养使用改造的 NA [4]或 NB培养基, 拮
抗菌筛选培养基为：PDA+5 g/L蛋白胨+1 g/L酵母
膏。
1.2 拮抗菌株 H5的活性测定
对峙培养法：28℃对峙培养 3 d, 测量抑菌带
宽度。
生长速率法：取菌株 H5 发酵原液、稀释 10、
20、40倍液各 2 mL与 10 mL PDA混合倒平板, 培
养 3 d, 测量菌落直径 [5]。
管碟法[6]:测定：每个牛津杯加入 200 µL无菌滤
液, 60 h测量抑菌圈径。
1.3 拮抗菌株 H5的抑菌机制及相关特性
1.3.1 无菌滤液对菌丝生长和孢子萌发的抑制作
用：28℃恒温对峙培养 3 d, 显微观察指示菌形态;
将无菌滤液原液、稀释 20、40、60倍液与黑曲霉孢
子悬浮液等体积混合 , 测定孢子萌发率及抑制率 ,
镜检孢子萌发情况。
1.3.2 无菌滤液对温度及酸碱的稳定性测定[7]：无
菌滤液放入 40℃、60℃、80℃、100℃水浴和 1×105 Pa
高压灭菌各处理 30 min, 冷却至室温; 用 HCl 和
NaOH将无菌滤液的 pH值分别调至 3~10, 静置调回
原 pH 值, 以不做处理的无菌滤液作对照, 每处理 3
个重复, 采用杯碟法检测各处理抑菌活性。
1.3.3 无菌滤液对硫酸铵的稳定性测定[8]：无菌滤
液中加入硫酸铵固体粉末至饱和度 55%, 置 4℃冰
箱过夜, 次日离心分别收集沉淀和上清, 沉淀物用
pH 值 7.0 的磷酸盐缓冲液溶解, 分别测定沉淀和上
清的抑菌活性, 以磷酸盐缓冲液为对照。
2 结果与分析
2.1 拮抗菌株 H5的活性测定
采用平板对峙法、生长速率法和抑菌圈法都显
示 H5 菌株对黑曲霉病菌有明显的抑制作用。对峙
平板实验中, 抑菌带宽度达 10.1 mm, 拮抗菌菌落
边缘伴随有白色条带产生; 管碟法测定实验中, 在
牛津杯周围产生的抑菌圈清晰明显 , 平均直径达
24 mm。
生长速率法显示不同稀释倍数的发酵液(原液、
10 倍液、20 倍液、40 倍液)对黑曲霉菌丝生长具有
明显的抑制作用, 抑制率分别为 91.9% aA、88.2% bA、
71.8% cB、62.4% dC, 几个不同处理之间抑菌率存
在显著差异, 总的趋势是发酵液浓度与抑菌率成正
比。
2.2 拮抗菌株 H5的抑菌机制及相关特性
2.2.1 对菌丝生长的抑菌作用：显微观察对峙培养
抑菌带的黑曲霉菌丝原生质浓缩, 菌丝分支多而杂
乱, 菌丝肿胀表面产生大量颗粒状突出物, 菌丝顶
端膨大形成泡囊; 而对照菌丝均匀、生长旺盛,可见
拮抗细菌 H5对黑曲霉菌丝有明显的破坏作用。
2.2.2 H5无菌滤液对孢子萌发的影响：实验结果表
明：H5菌株无菌滤液对黑曲霉孢子萌发具有显著的
抑制作用 , 无菌滤液浓度越高 , 孢子萌发率越低 ,
当稀释倍数达 40倍时, 对孢子萌发抑制率仍在 50%
以上, 且萌发的孢子芽管长度明显短于对照, 无法
正常伸长 , 4 个不同处理之间存在极显著差异见
表 1。
2.2.3 无菌滤液对热的稳定性测定：菌株 H5 的无
菌滤液经不同温度处理结果(表 2)显示, 对照抑菌圈
直径为 21.0 mm, 无菌滤液在 40℃、60℃处理 30 min
后, 抑菌活性没有明显变化, 80℃、100℃、121℃处
理后抑菌活性有所降低, 是对照相抑制率的 42.9%。
方差分析显示不同温度处理之间差异不显著, 表明
此抑菌物质对热具有较好的稳定性。
陈 曼等: 富贵竹黑腐病拮抗菌 H5的抑菌机制及相关特性研究 531

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图 1 对峙培养黑曲霉菌丝变化情况
Fig. 1 Hypha changes of Aspergillus niger by dual cultural essay
1-3: 抑菌带内异常菌丝; 4: 正常菌丝
1-3: Abnormal hyphae in the inhibition band; 4. Normal hyphae

表 1 拮抗菌无菌滤液对黑曲霉(Aspergillus niger)
孢子萌发的抑制作用
Table 1 Inhibition of H5 germfree fermented filtrate on
conidiophores germination of Aspergillus niger
处理
Treatment
孢子萌发率
Germination rate(%)
孢子萌发抑制率
Inhibition rate(%)
原液(Fermentation
production)
0 100 a*A**
10倍稀释液(10 times
dilute treatment)
17.1 82.9bB
20倍稀释液(20 times
dilute treatment)
21.1 78.9cC
40倍稀释液(40 times
dilute treatment)
36.2 63.8dD
对照(CK) 100
−
*在 0.05水平上差异显著, **在 0.01水平上差异显著

2.2.4 无菌滤液对 pH 值的稳定性测定：菌株 H5
的无菌滤液经不同 pH处理结果(表 2), 对照 pH7抑
菌圈直径为 23 mm, 方差分析表明, pH3 与 pH7(对
照)相比达显著水平, 其余处理均与对照差异不显著,
在中性、碱性条件抑菌活性强于酸性条件, 菌株产
生的抑菌物质对酸、碱均具有较好的稳定性。

表 2 无菌滤液对热及酸碱的稳定性
Table 2 Stability of H5 germfree fermented filtrate after
treated with heat, acid and alkali respectively
温度处理
Tempera-
ture(℃)
抑菌圈直径
Diameter of inhi-
bition zone(mm)
pH处理
pH
抑菌圈直径
Diameter of inhi-
bition zone(mm)
30℃(CK) 21.0a 3 13c
40℃ 20.3a 4 18.3bc
60℃ 18.5ab 5 15bc
80℃ 18.1ab 6 21.3a
100℃ 15.0ab 7(CK) 23a
121℃ 12.6b 8 22.5a
− − 9 20ab
− − 10 21.7a

2.2.5 无菌滤液对硫酸铵的稳定性测定：菌株 H5
的无菌滤液经硫酸铵处理后, 沉淀经磷酸盐缓冲液
溶解后有较强的抑菌活性, 抑菌圈直径达 23 mm,
对照及上清均无抑菌活性, 说明饱和度 55%的硫酸
铵能沉淀大部分抑菌物质, 推测菌株 H5 产生的抑
菌物质可能是蛋白类物质, 并且抗菌物质经 1×105 Pa
高压灭菌后抑菌圈直径达 20 mm, 能保持约 87%的
抑菌活性, 可以根据此特性, 将无菌滤液经高温高
压处理除去无抑菌活性的杂蛋白, 从而达到对活性
蛋白提纯的目的。
3 讨论
地衣芽孢杆菌通过产生抗菌素来破坏病原菌 ,
从而抑制病原菌的生长, 同一菌种的不同菌株可以
产生不同抗菌素[9]。Johnson 等 1945 年发现地衣芽
孢杆菌能够产生肽类物质 , 并命名为杆菌肽
(Bacitracin), 杆菌肽具有强烈的抑菌作用 , 强烈抑
制 G+, 对部分 G−有作用[10]。此后, 许多学者对地衣
芽孢杆菌进行研究, Yoon Kim[11]从大豆的发酵物中
分离到的一株地衣芽孢杆菌 B65-1 的抑菌活性物质
为苯乙酸。刘莹[12]从土壤中筛选出的一株地衣芽孢
杆菌, 其滤液对真菌的灰霉孢菌(Botrytis cinerea)等
植物病原菌均有较强的抑制作用。目前从红树林植
物分离到地衣芽孢杆菌对富贵竹黑腐病进行防治的
研究至今未见报道。本研究得出如下结论：
(1) 拮抗菌 H5 对黑曲霉病菌菌丝生长和孢子
萌发具有明显的抑制作用, 该菌株无菌滤液可以显
著降低孢子萌发率, 抑制芽管伸长。推测拮抗菌的
抑菌机理为分泌抑菌物质直接破坏病原菌菌丝和孢
子, 且该菌株无菌滤液对热和酸碱均具有较好的稳
定性, 研究结果与刘莹的研究类似[11]。
(2) 无菌滤液经硫酸铵沉淀后 , 对照及上清均
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无抑菌活性, 沉淀经磷酸盐缓冲液溶解后有较强的
抑菌活性, 抑菌圈清晰明显推断抑菌活性物质为蛋
白类物质。Batrakov 等从地衣芽孢杆菌 603菌株获
得一种新型肽脂 , 对多变棒杆菌 (Corynebacterium
variabilis)有很强的抑制作用[13]; Martirani等从地衣
芽抱杆菌 490/5 的培养液中分离得到一种细菌素,
对 Bacillus 相近的种有拮抗作用, 对链霉蛋白酶 E
和蛋白酶 K 敏感[14]。这些抑菌成分与实验菌株 H5
所产生的蛋白类物质是否为同种物质, 有待进一步
实验验证。
参 考 文 献
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