全 文 ：收稿日期:2006-08-21
基金项目:成都市科技局项目(62171296-7)
作者简介:陈静鸿(1982-),女,四川泸定人 ,硕士研究生 ,主要从事微生物学方面的研究.E-mail :ivy -123@163.com
通讯作者:葛绍荣.E-mail:arry.li@163.com
文章编号:　0490-6756(2007)03-0687-05
山葵黑根病拮抗菌的筛选和应用
陈静鸿1 ,向晶晶1 ,丁成翔1 ,张　斌2 ,葛绍荣1
(1.四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都 610064;
2.四川大学科技处 , 成都 610065)
摘　要:从山葵种植土壤中分离到一株对山葵墨入菌(Phoma wasabiae Yokogi)有强拮抗作用
的菌株 SA2.通过形态观察 、生理生化实验及 16S rDNA同源性序列分析 ,鉴定 SA2为一株苏
云金芽孢杆菌.盆栽和田间小区实验表明 ,SA2对山葵黑根病有较好的防治效果 ,田间防效最
高达 78.98%.
关键词:山葵黑根病;拮抗菌;鉴定;生物防治
中图分类号:Q93　　　文献标识码:A
Dentif ication of antagonistic strains against Phoma wasabiae Yokogi
and their biocontrol efficiency
CHEN J ing-heng1 , XIANG Jing-jing1 , DING Cheng-xiang1 , ZHANG Bin2 , GE Shao-rong1
(1.Key Labra tory of Bio-Resources and Eco-environment o f M inistry of Education ,
College of Life Science , Sichuan University , Chengdu 610064 , China;
2.Research &Development O ffice , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:Bacillus SA2 w as isolated f rom the soil of plantt ing w asabi in Sichuan Province w hich could inhibit
Phoma wasabiae Yokogi.It w as identif ied as Baci llus thuringiensis by phy siological , biochemical test and
molecular systematic analysis.The texts exhibited that SA2 could control the disease by P .wasabiae and
cortrol efficaey on the diseace in the pot ted plant and the field test reached 85.57% and 78.98% respectively.
The result indicated that the antifungal strain in the study well worth developing and applying for the biocon-
trol of the disease.
Key words:phoma wasabiae yokogi , antagonism , identification , biocontrol
1　引　言
山葵(wasabi)原产于日本富士山和台湾的阿
里山 ,是生产芥末的主要原料 ,被日本人民称为生
活必需品.近年的研究发现:山葵还具有杀菌防病 、
防腐利尿 、发汗 、清血 、增进食欲 、减脂和软化血管
的功能 ,从而更增加了山葵的市场需求[ 1-3] .目前
山葵已在大陆大量种植 , 但其植株被一种黑根
病[ 4 , 5]感染 ,凡感染黑根病的山葵块根变黑 ,叶子
出现黑斑 ,或者烂叶极大地影响了产品质量 ,其产
值下降 50%以上 ,给山葵种植者造成极大损失.国
内已有单位对其采用化学药物防治 ,但防效不理
想 ,产品出口时商检发现有残留药物 ,质量同样受
到影响 ,而对黑根病的生物防治 ,还未见有报道.本
试验采用筛选拮抗微生物来防治山葵黑根病 ,即采
用以菌治菌的原理 ,使得防治后的山葵无化学残留
2007年 6月　
第 44卷第 3期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
　 Jun.2007
Vol.44　No.3
物 ,无黑斑和烂叶现象 ,既可以增加产品出口换汇 ,
又保证了食用安全.本实验从山葵种植土中分离筛
选得到一株对山葵墨入菌(山葵黑根病原菌)有强
拮抗作用的菌株 SA2 ,对其进行了形态特征 、生理
生化鉴定的研究以及基于 16Sr DNA 序列的系统
发育分析 ,并进行盆栽及田间防治试验 ,取得了较
好的防治效果.
2　材料与方法
2.1　材　料
2.1.1　供试菌种　菌株 SA2系土壤中分离得到.
山葵墨入菌供试菌株由本实验室分离保存.
2.1.2　培养基　通用培养基:清蛋白培养基(蛋清
蛋白 0.25 g ,葡萄糖 1.0 g ,磷酸氢二钾 0.5 g ,Fe2
(SO4)3微量 , MgSO4·7H2O 0.2 g , 琼脂 20 g , pH
6.8 ～ 7.0 ,定容至 1 L).放线菌分离培养基:甘油
精氨酸培养基(甘油 20 g ,氯化钠 1 g ,碳酸钙 0.1
g ,L-精氨酸 2.5 g , FeSO4·7H2O 0.1 g , MgSO4·
7H2O 0.1 g ,琼脂20 g ,pH 6.8 ～ 7.0 ,定容至 1 L),
高氏 1号培养基(可溶性淀粉 20 g ,氯化钠 1 g ,硝
酸钾 1 g ,磷酸氢二钾 0.5 g ,硫酸铁 0.01 g ,MgSO4
·7H2O 0.5 g ,琼脂 20 g ,pH 7.2 ～ 7.4).细菌分离
培养基:NA培养基(牛肉浸膏 5 g ,蛋白胨 10 g ,蔗
糖10 g ,琼脂 20 g ,pH 7.2 ～ 7.4 ,定容至 1 L).病
原真菌生长培养基:PDA 培养基(马铃薯 200 g ,葡
萄糖 20 g ,琼脂 20 g ,pH 自然 ,定容至 1 L).
2.2　方　法
2.2.1　拮抗菌株的分离　从成都青城后山的山葵
种植地采集土样 20 个 ,用梯度稀释涂布法分别涂
布于上述培养基中 30 ℃恒温培养 ,24 h ～ 28 h挑
取细菌 ,培养 3 ～ 4 d挑取放线菌[ 6] .
2.2.2　病原拮抗菌的筛选　取 28 ℃恒温培养 5
～ 7 d的病原真菌培养液 ,用无菌推棒均匀涂布接
种在 PDA 平板上 ,同时在半径 3.0 cm 的圆周上 ,
等距离接种 6 ～ 8点带适宜琼脂培养基的分离放线
菌 ,28 ℃恒温培养 ,逐日观察记录.
对于筛选拮抗细菌 ,则在病原真菌生长 4 d
后 ,在半径 3.0 cm 的圆周上 ,分点接种带适宜培养
基的分离细菌 , 28 ℃恒温培养 ,逐日观察记录[ 6] .
再将初筛得到的菌株进行液体摇瓶发酵后 ,用
打孔法复筛 ,即:用无菌的打孔器在直径 9 cm 的
PDA 平板上打孔 ,每板八孔.然后用无菌推棒将墨
入菌菌悬液均匀涂布于打孔的 PDA平板上 ,孔中
滴加初筛菌株的发酵液 , 30 ℃培养4 d后观察抑菌
圈.根据抑菌圈大小筛选出山葵墨入菌的强拮抗菌
株.
2.2.3　形态特征和生理生化特性　在光学显微镜
下观察个体形态并测量菌体大小;参照文献[ 7] 进
行 Gram 染色 、芽孢染色 、鞭毛染色.参照文献
[ 7 , 8]对 SA2进行生理生化鉴定.
2.2.4　16S rDNA 的序列分析和系统发育分析　
按照文献 [ 9] 的方法提取基因组总 DNA , 用
PrimerA (5′-ATGGATCCGAGAGT TTGA TCCT-
GGTCAG-3′)和 PrimerB (5′-TATCTGCAGTG-
GTGTGACGGGCGGTGT-3′)作为引物进行扩增.
扩增产物经纯化后 ,送由上海英骏生物技术有
限公司测序.测序得到 1377 bp的16S rDNA序列.
结果输入核酸数据库(RDP Ⅱ)进行序列比较 ,将
与之同源性最高的 15株细菌模式株的 16S rDNA
序列 , 采用 DNAMAN 5.2 软件的 Multiple Se-
quence Alignment进行 16S rDNA 同源性分析 ,并
构建系统发育树[ 10] .
2.2.5　室内盆栽防病试验　参照文献[ 11] 的方
法 ,用拮抗菌菌液对山葵进行浸种及移栽时蘸根处
理.移载 41 d后统计发病率和病情指数 ,计算防治
效果 ,计算方法见文献[ 12] .
2.2.6　拮抗菌对山葵黑根病的田间防效试验　抗
菌制剂由富集培养基(菜饼 10%;钙镁磷肥 10%;
石灰 2%;肥土 78%)与 5 L 菌液(浓度 5×109个/
mL)混匀后 ,25 ℃～ 30 ℃富集培养 7 d ,总量达到
2.5 T .参照文献[ 13]的方法 ,试验地选在成都市都
江堰龙池镇的山葵种植场 ,选择山葵黑根病发病率
在 50%以上的场地.分别在 1 , 3 , 5个月后调查发
病率及病情指数.
3　结果与分析
3.1　拮抗菌的分离筛选
土壤样品富集培养后分别涂布于 NA平板 、精
氨酸平板和高氏平板 , 分离得到的 158 株菌.从
158株菌筛选出对病原真菌有拮抗作用的放线菌
38株 ,细菌 10株(见表 1).将这 48株菌用打孔法
进行复筛 ,得到产生抑菌圈最大的菌株 ,即 SA2(图
1), 8次重复.
3.2　形态特征和生理生化特性
SA2菌体短杆状 ,长 1.9 ～ 2.8 μm ,宽 0.6 ～
1.1 μm ,周身鞭毛 ,具有运动性;产牙孢 , 芽胞中
生 ,椭圆形.LB培养基斜面 30 ℃培养 72 h后 ,菌
落呈乳白色 ,产生折皱.生理生化特征见表 2.
688 四川大学学报(自然科学版) 第 44卷
3.3　16S rDNA的序列分析和系统发育分析
SA2的 16S rDNA 序列测定结果表明 ,扩增的
DNA 序列全长 1377 bp(图 2),该序列在 GenBank
中的登录号为 DQ864491.
图 1　SA2 对山葵墨入菌产生的抑菌圈
Fig.1　The inhibition zone of SA2 against
Phoma w asabiae Yokogi(8 repeated)
图 2　PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig.2　Gel electrophoresis of the PCR product
1:marker Ⅳ;2:the PCR product of SA2
表 1　48 种拮抗菌的抑菌圈直径
Tab.1　Inhibition diameter of 48 antag onistic bacterias
S t rain
hibit ion zone
(mm) St rain
hibi tion zone
(mm) St rain
hibition zone
(mm) St rain
hibition zone
(mm)
S4 12 S30 14 SA16 22 SF48 16
10 S32 12 SA19 14 SR1 20
S8 12 S34 16 SA21 16 SR4 12
S11 22 S37 18 SA24 12 SR5 16
S13 22 S40 20 SA31 20 SR7 14
S15 12 S45 14 SA37 16 SR12 10
S18 16 S46 16 SA38 12 SR14 20
S20 12 SA2 26 SF4 18 SR15 12
S22 10 SA5 12 SF18 12 SR20 10
S25 10 SA6 14 SF31 14 SR21 12
S26 14 SA7 12 SF34 18 SR34 12
S27 20 SA14 12 SF44 12 SR37 14
表 2　SA2 菌的主要生理学特性
Tab.2　Physiological characteristics of strain SA2
Characterist ics SA2 Characteris tics SA2
Gram-negative rod-shaped + Gas from glucose -
Oxidase + Acid f rom glucose +
anaerobic + Utilization of Cit rate +
V-P + Grow ing in NaCl:2% +
pH in V.P:<6 + 　　　　　　　 7% +
　　　　　　>7 　　　　　　　 10% -
Indole - Xylose -
Gelat in hydrolysis + Arabinose -
Starch hydrolysis + Fructose -
Leci th in hydrolysis + Sucrse -
Nit ric acid reduct ion + D-Mannos -
+:Positi ve;-:Negative.
689第 3期 陈静鸿等:山葵黑根病拮抗菌的筛选和应用 　
　　根据测序结果用 Ribosomal Database Project
(RDP-Ⅱ)核酸数据库进行序列比对 ,从 RDP 数据
库中选择 15 个同源性最高的模式菌与 SA2进行
进化树分析(图 3).结果表明该分离株的系统发育
地位与苏云金芽胞杆菌(Baci llus thuringiensis)十
分接近 ,序列相似性值为 98.3%,因此鉴定该分离
株为苏云金牙孢杆菌.
3.4　盆栽防病试验
盆栽试验结果表明:SA2拮抗细菌菌株对山葵
黑根病有良好的防治效果 ,对山葵黑根病的防效为
85.57%(见表 3).
图 3　以 16S rDNA 序列为基础的系统发育树状图
Fig.3　The phy logenetic tree based on SA5 16S rDNA sequence
Numbers in parentheses represent the sequencesp accession number inGenBank.Bootst rap values , expressed as percentages of 100
replications , are given at branch poin ts.Bar , 5 % sequence divergence
表 3　拮抗菌 SA2对山葵黑根病的室内防治效果
Tab.3　Control of Phoma washabiae Yokogi by antagon bacterium SA5
Treatmets S um
Grade
0 1 3 5 7 9
Rate of the
diseased(%)
Disease
index
Cont rol
ef fects(%)
SA2 84 71 1 3 4 2 3 15.48 9.44 85.57
CK 87 25 4 1 1 2 54 71.26 65.40 —
表 4　拮抗菌 SA2对山葵黑根病的田间防治效果
Tab.4　Control of Phoma washabiae Yokogi by antagon bacterium SA5
T reatmets S um
Grade
0 1 3 5 7 9
Rate of the
diseased(%)
Disease
index
Cont rol
ef fect s(%)
1m SA2 174 140 4 5 3 5 18 20.11 14.75 74.12
CK 178 71 2 2 3 5 95 60.11 56.99 —
3m SA2 170 129 3 3 5 4 26 24.12 19.54 76.57
CK 176 25 0 2 4 5 140 85.80 83.40 —
5m SA2 172 132 2 1 4 4 29 26.74 20.28 78.98
CK 171 2 0 2 4 4 159 95.91 96.49 —
690 四川大学学报(自然科学版) 第 44卷
3.5　田间防病试验
山葵种植 1 , 3 ,5个月后 ,SA5对黑根病防效分
别为 74.12%, 76.57%和 78.98%,有较好的防治
效果 ,且随时间的延长而增加.
4　讨　论
从分子水平进行分类与鉴定的方法 ,如质粒图
谱分析(PPA)、染色体 DNA限制性片段长度多态
性分析(RELP)、核算杂交 、16sRNA或 16sDNA测
序等.这些技术使细菌的分类越来越科学和精确.
特别是 16sRNA 或 16sDNA 序列分析方法的出现
使细菌进化可以通过试验研究来证实.通过对其序
列的分析 ,可以判定不同菌属 、菌种间遗传关系的
远近.本实验采用了 16sDNA分子鉴定方法 ,通过
同源性比对 ,系统发育树的建立 ,最终鉴定拮抗菌
SA2为苏云金芽胞杆菌.
在本实验室与都江堰龙池镇山葵种植场合作
进行的试验中发现 ,田间自然发病率较低时 ,所统
计的生防菌株田间试验结果不明显 ,难以说明生防
效果.而在较高的对照发病区更能取得较有代表性
的结果.从研究结果可见 ,较高的对照发病更能显
示出生防菌的防病效果.
由墨入菌引起的黑根病是危害山葵的重要病
害 ,严重影响了产品质量 ,给山葵种植者造成极大
损失.由于山葵属食用和药用原料不宜施用化学农
药 ,而国内尚未见生物防治山葵黑根病的报道.本
实验采用以菌治菌的原理 ,使得防治后的山葵无化
学残留物 ,无黑斑和烂叶现象 ,既可以保证产品出
口 ,又保证了食用安全.室内外试验表明:拮抗芽孢
杆菌 SA2对山葵黑根病有较好的防治效果 ,田间
最高防效可达 78.98%,达到理想的结果 ,因此是
一种很有应用前景的生防菌.本研究为山葵黑根病
的生物防治提供了理论依据 ,对山葵的大面积种植
有很好的促进作用.
参考文献:
[ 1] 　罗朝村 , 胡敏夫.台湾山葵栽培与病害管理[ J] .农药
世界 , 1991 , 1(89):82.
[ 2] 　何万兴 , 吴志平 ,宁红.四川山葵病虫害调查[ J] .西南
农业学报 , 2005 , 18(1):63.
[ 3] 　Shik Shina , Hideki Masuda , Kinae.Naohide.Bacterici-
dal activity of w asabi(Wasabia japonica)against Heli-
cobacter py lori [ J] .International Journal of Food M i-
crobiolog y , 2004(94):255.
[ 4] 　胡敏夫 , 罗朝村.山葵主要病虫害及防治方法[ J] .兴
农杂志 , 1991(271):45.
[ 5] 　张富丽 , 宁洪 , 张敏.山葵墨入病菌生物学特性研究
[ J] .植物保护 , 2004 , 30(4):45.
[ 6] 　方中达.植病研究方法[ M] .北京:农业出版社 , 1979.
[ 7] 　东秀珠 , 蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[ M] .北京:
科学出版社 , 2001.
[ 8] 　周德庆.微生物实验手册[ M] .上海:上海科技出版
社 , 1983.
[ 9] 　Weisbnrg W G , Bams S M , Pelletier D A , et al.16S
rDNA amplification for phylog enetic study [ J] .J Bacte-
riol , 1991 , 173(2):696.
[ 10] 　金虹 ,葛绍荣 , 陶勇.一株蝗虫病原菌的鉴定及其毒
力和病理研究[ J] .微生物学报 , 2005 , 45(2):172.
[ 11] 　李本金 ,童川拉 , 谢世勇.荸荠枯萎病拮抗菌的筛选
和利用[ J] .江西农业大学学报 , 2003 , 25:61.
[ 12] 　杜荣骞.生物统计学[ M] .北京:高等教育出版社 ,
1999.
[ 13] 　纪明山 ,王英姿 , 程根武.西瓜枯萎病拮抗菌株筛选
及田间防效试验[ J] .中国生物防治 , 2002 , 18(2):
71.
691第 3期 陈静鸿等:山葵黑根病拮抗菌的筛选和应用