全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测
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2013年 第38卷 第08期
收稿日期：2013-02-01 *通讯作者
基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻1123003-6，桂科攻1000008-6)。
作者简介：张劲(1986—)，男，硕士，研究方向为农产品加工与贮藏。
张 劲，李洪艳，白先进，张 平，张 瑛，曾 伟，李 玮，文仁德*
(广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，南宁 530007)
摘要：通过平板涂布分离、致病性试验、菌落形态观察、光学显微镜下分生孢子及分生孢子梗
形态观察及ITS序列分析，对广西葡萄一年两收栽培技术主栽品种巨峰冬葡萄贮藏保鲜过程中致
病致腐菌进行分离鉴定，结果表明，引起葡萄腐烂的病原菌主要是灰霉、交链孢霉、芽枝霉、
大毛霉、茁芽丝孢酵母、黑曲霉、拟茎点霉等7个种属。其中灰霉、交链孢霉、芽枝霉和大毛霉
分别占检出微生物的34.3%、15.7%、12.6%和9.8%，是冷藏保鲜过程中的主要致病微生物。引入
罗伦隐球酵母作为生物防治拮抗菌，以灰霉菌作为典型致病微生物开展生物防治初步研究。试
验结果表明，对数生长期的罗伦隐球酵母对灰霉菌抑制效果最佳，且抑制效果与拮抗菌的使用
浓度成正比。
关键词：巨峰冬葡萄；贮藏保鲜；病原菌；生物防治；拮抗菌
中图分类号：TS 207.4 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)08-0310-05
Identifi cation of pathogens from postharvest grape (winter fruit) and
biological control
ZHANG Jin, LI Hong-yan, BAI Xian-jin, ZHANG Ping, ZHANG Ying, ZENG Wei, LI Wei, WEN Ren-de*
(Viticulture and Vine Research institute, Guangxi Academy of Agriculture Science, Nanning
530007)
Abstract: Isolation and identification of pathogens from Guangxi cultivars Kyoho grapes (winter fruit)
harvested biannually after cold storage through plate screening, pathogenidity test, colonial morphology,
conidia and conidiophore morphology and ITS sequence analysis. Results showed that these pathogens
including Botrytis cinerea, Alternaria sp, Blastocladia pringsheimii, Mucor mucedo, Trichosporon
pullulans, Aspergillus niger and Phomopsis sp. Botrytis cinerea, Alternaria sp, Blastocladia pringsheimii
and Mucor mucedo are mainly pathogens, occupying 34.3%, 15.7%, 12.6% and 9.8% of examined
strains, respectively. To Botrytis cinerea as the typical pathogen, developing an effective biological control
method by introducing an antagonistic microbe. Results showed that Cryptococcus laurentii obtained from
the exponential phase has optimal antagonism, and the concentration of cell was directly proportional to
the antagonism.
广西冬葡萄贮藏中致腐微生物
鉴定及生物防治
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2013.08.014
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随着葡萄“三避”技术与一年两收栽培技术
的实践推广，广西已由传统葡萄种植次适宜区
转变为特殊优势种植区，产量从1990年的0.18
万t发展到2011年的25万t，近5年年均增长率为
10%，列南方11省区第一位，成为全国重要的早
熟葡萄产区和一年两熟葡萄产区[1-2]。产量大幅度
的提升给葡萄贮藏保鲜技术和相关病害防治提出
了更高的要求和挑战。因此，研究广西冬葡萄贮
藏保鲜过程中的腐烂病害问题具有很大的实际
应用价值。
近年来葡萄采后保鲜大量使用化学杀菌剂，
给环境和人身健康带来了严重危害，但随着病原
菌抗药性的逐渐增加以及人们对果品质量要求的
不断提高和环保意识的加强，生物防治技术在
葡萄冷藏保鲜上的应用逐渐被人们所重视并逐
步成为研究热点[3]。罗伦隐球酵母(Cryptococcus
laurentii)，是近年来被发现的一种拮抗酵母菌，
具有广谱抗菌性，对多种水果采后病害都有一定
的抑制作用[4-6]。该酵母菌的抑菌机理是通过与
病原菌竞争营养和空间，从而对病原菌产生抑制
作用。
目前，国内关于葡萄主要病原菌种类、发病
规律及生物防治方法的报道主要集中在新疆、湖
南、天津等地区[7-9]，而关于广西葡萄的相关研究
则鲜有报道。笔者以广西地区葡萄一年两收栽培
技术主栽品种巨峰冬葡萄为试验样品，对葡萄贮
藏保鲜过程中主要致病菌种类和发病规律进行了
系统研究，并在此基础上引入拮抗菌罗伦隐球酵
母，尝试采用生物防治方法来控制广西产巨峰冬
葡萄贮藏保鲜过程中微生物病害的发生。
1 材料与方法
1.1 材料
样品来源：巨峰(冬葡萄)，采摘于广西大新
县岜隆屯葡萄一年两收基地，果粒饱满，果粉均
匀，果穗大小均匀，无机械伤和病虫害；冷库贮
藏保鲜条件：-1~1 ℃；拮抗菌：罗伦隐球酵母
(Cryptococcus laurentii)：中国普通微生物菌种保藏
管理中心。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基 致病菌分离培养基(孟加拉红琼脂
培养基)：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，K2HPO4 1 g，
MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂15 g，孟加拉红0.03
g，氯霉素0.1 g，水1000 mL，pH(7.2±0.2)，121
℃灭菌20 min；致病菌纯化、保藏培养基(PDA培
养基)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水
1000 mL，121 ℃灭菌20 min；拮抗菌培养基：牛
肉膏8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，水1000 mL，
121 ℃灭菌20 min。
1.2.2 病原菌分离 采用平板涂布分离法。从冷
库中随机抽取果穗样本进行致病致腐菌分离。对
健康果实和腐烂果实的果粒或果梗的表面进行消
毒，然后放入无菌研钵中研磨，果梗部分研磨时
加入少量无菌水，采用10倍稀释法在孟加拉红琼
脂培养基上涂布，置于28 ℃恒温培养箱培养2~3
d，待平板上出现直径0.5 cm单菌落时，用接种针
挑取菌落边缘少量菌丝于PDA平板上进行纯化，
纯化2~3次后即可得到纯化菌株，4 ℃、PDA斜面
保存备用。
1.2.3 致病性试验 待返接果粒及果梗准备：选
取健康无病果实及果梗，用清水洗净后再用1%
次氯酸钠浸泡2 min，用无菌水冲洗后，在超净
工作台上吹干备用。
接种用病原菌制备：取在PDA平板上培养4~5
d的新鲜菌落，用打孔器取直径0.5 cm的菌体用于
接种。
返接试验：采用已纯化菌株回接被测果实及
果梗的方法，分有伤和无伤2种接种方式，通过接
种观察病斑发展速度与发病程度，判断被接菌株
致病能力大小。有伤接种方式为在每个果粒上分
别用接种针刺5个孔(3 mm深)，孔眼集中在一起使
直径约为0.5 cm，用打孔器取制备好的病原菌株，
菌饼直径为0.5 cm，接种至伤口处；无伤接种方式
为同穗另取完好果粒直接接种。每果穗接种1个菌
株，每菌株分别接种6个有伤和无伤果粒、及6处
有伤和无伤果梗，并设立空白对照。
返接后培养：返接后的果粒及果梗置于加
湿干燥器内培养，盖口用透气薄膜隔离，起到保
湿、密封、透气、防止污染的作用。
1.2.4 病原菌鉴定 将各分离纯化的菌株回接于
Key words: Kyoho winter grape; cold storage and refreshment; pathogens; biological control; antagonistic
microbe
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果实或果梗上，如果发病症状与冷藏保鲜中腐败
症状相符合，即作为致病致腐病原菌做进一步鉴
定。根据病原菌在PDA平板上菌落特征、光学显
微镜下分生孢子及分生孢子梗形态特征进行形态
学鉴定，方法参照真菌鉴定手册[10]。病原菌ITS
序列分析采用试剂盒进行(Universal Genomic DNA
Extraction Kit、TaKaRa Fungi Identification PCR Kit
和TaKaRa DNA Fragment purification Kit，TaKaRa
大连宝生物工程有限公司)，测序工作由生工生物
工程(上海)股份有限公司完成。
1.2.5 生物防治方法研究 引入罗伦隐球酵母作为
生物防治拮抗菌，针对广西地区一年两收栽培技
术主栽品种巨峰冬葡萄的主要致病菌灰霉开展生
物防治初步研究。
1.2.5.1 拮抗菌菌悬液制备 用接种环从斜面上挑
取长度约1.0 cm的罗伦隐球酵母菌苔接入装有30
mL拮抗菌液体培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、
160 r/min振荡培养12 h，作为种子发酵液。按3%
接种量将种子液接入装有50 mL拮抗菌液体培养基
的250 mL三角瓶中，28 ℃、160 r/min振荡培养24
h，5000 r/min离心10 min收集菌体，无菌生理盐水
洗涤菌体2次，血球计数板计数，用无菌生理盐水
制备成所需浓度菌悬液，备用。
1.2.5.2 致病菌灰霉菌孢子悬液制备 灰霉菌斜面
在28 ℃下培养至孢子成熟，用无菌生理盐水将孢
子从斜面上洗出，血球计数板计数，制备成所需
浓度的孢子悬液，备用。
1.2.5.3 不同培养时间的拮抗菌抑菌效果对比 拮
抗菌培养方法同(1.2.5.1)，采用血球计数板计数
法，每间隔2 h取样测定发酵液中罗伦隐球酵母
浓度，绘制出罗伦隐球酵母的生长曲线。分别选
取延迟期(6 h)、对数期(16 h)、稳定期(24 h)和衰
亡期(36 h)发酵液制备成相同浓度菌悬液(108 cfu/
mL)。选择新鲜饱满果实作为试验材料(每组用果
50粒)，表面消毒、风干，每粒用接种针刺5个孔
(3 mm深)，在上述培养时间的菌悬液中振荡浸泡1
min后，取出风干，再将果粒置于灰霉菌孢子悬液
(108 cfu/mL)中浸泡1 min，捞出风干，冷藏条件下
贮藏(-1~1 ℃)，定期观测葡萄的腐烂率(果粒表面
出现水渍状斑块时即认定为腐烂)。每个试验设3
个重复，每次试验重复2次。
1.2.5.4 不同拮抗菌浓度抑菌效果对比 将培养至
对数生长期的拮抗菌菌体制备成106、107、108 cfu/
mL的菌悬液。拮抗试验同(1.2.5.3)。
图1 病原菌PDA平板菌落形态
2 结果与分析
2.1 病原菌分离纯化和形态学鉴定
通过对果穗样本微生物进行分离纯化和菌
株返接致病性试验，共获得213株致病菌株。根
据病原菌在PDA平板上菌落特征(图1)、光学显微
镜下分生孢子及分生孢子梗形态特征进行初步鉴
定，结果表明，广西一年两收栽培技术主栽品种
巨峰冬葡萄冷藏保鲜期主要致病致腐菌有灰霉
(Botrytis cinerea)、交链孢霉(Alternaria sp.)、芽枝霉
(Blastocladia pringsheimii)、大毛霉(Mucor mucedo)、
茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、黑曲霉
(Aspergillus niger)、拟茎点霉(Phomopsis sp.)。
2.2 病原菌分子生物学鉴定(ITS序列分析)
根据病原菌分离纯化、形态学初步鉴定和菌
株返接致病性试验结果，从分离纯化获得的213
株致病菌株中抽取20株样本进行ITS分子生物学
测序鉴定，准确获取病原菌种属信息(图2)。进
化树分析结合NCBI的Blast结果显示，这20株样
本菌株分属7个病原菌种类，其中菌株06、11、
12、13、15、16、17属于灰霉，菌株04、14、
18属于芽枝霉，菌株10属于黑曲霉，菌株02属于
拟茎点霉，菌株01、03、05、07、09属于交链孢
霉，菌株19属于茁芽丝孢酵母，菌株08、20属于
大毛霉。分子生物学鉴定结果与形态学鉴定结果
具有良好的一致性。
通过与塔里木大学宋开艳和西北农林科技
大学李宁的研究对比发现[7,9]，灰霉、交链孢霉、
黑曲霉和拟茎点霉不仅是新疆、天津地区巨峰葡
萄采后的主要致病菌，也是广西一年两收栽培技
术主栽品种巨峰冬葡萄冷藏保鲜期主要致病致腐
菌。有趣的是，新疆、天津地区巨峰葡萄中检出
的青霉和根霉在广西巨峰冬葡萄冷藏保鲜期中没
有被检出；而芽枝霉、大毛霉和茁芽丝孢酵母被
检出为广西巨峰冬葡萄冷藏保鲜期独有的致病致
腐菌。
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2.3 主要病原菌检出率和侵入途径
将分离纯化获得的各病原菌进行致病性试验
发现，不同病原菌侵入途径差异很大(表1)。灰霉
和交链孢霉在冷藏(0 ℃)条件下，对果粒和果梗的
有伤和无伤组织均可侵入，表现出很强的致病致
腐特性，分别占检出微生物的34.3%和15.7%，是
广西一年两收栽培技术主栽品种巨峰冬葡萄冷藏
保鲜过程中的主要致病致腐菌。芽枝霉和大毛霉
可侵入有伤和无伤果粒及有伤果梗，对果实表现
出很强的致病致腐性，分别占检出微生物的12.6%
和9.8%。茁芽丝孢酵母仅对有伤果粒果梗具有侵
染性，但侵染非常迅速，占检出微生物的5.4%。
黑曲霉和拟茎点霉表现出较弱的致病性，仅对有
伤果粒具有侵染性。
表1 各病原菌返接致病性试验
菌名
果粒(0 ℃) 果梗(0 ℃)
有伤 无伤 有伤 无伤
灰霉 ＋ ＋ ＋ ＋
交链孢霉 ＋ ＋ ＋ ＋
芽枝霉 ＋ ＋ ＋ －
大毛霉 ＋ ＋ ＋ －
茁芽丝孢酵母 ＋ － ＋ －
黑曲霉 ＋ － － －
拟茎点霉 ＋ － － －
注：＋表示侵入；－表示不侵入。
李宁等的研究表明[9]，灰霉和交链孢霉对果
粒和果梗的有伤和无伤组织均可侵入，分别占果
粒检出微生物的22%和14%，是最主要的致腐病
原菌，这和我们对广西巨峰冬葡萄冷藏保鲜期致
病致腐菌检出结果是一致的。不同的是，李宁等
的结果表明根霉、黑曲霉和青霉占果粒检出微生
物的12%、11%和8%，而我们的研究结果表明根
霉和青霉不是广西巨峰葡萄(冬季果)冷藏保鲜期
主要的致病致腐菌，黑曲霉也只表现出较弱的致
病性。
以上结果说明，不同地区巨峰葡萄主要致病
致腐菌种类和检出率存在较大差异，尤其表现在
南北地域差异上。但值得注意的是，灰霉作为植
物常见灰霉病的病原菌，在各地区葡萄上均为最
主要的致病致腐菌，因此以灰霉菌作为典型致病
微生物开展生物防治研究对广西巨峰冬葡萄冷藏
保鲜具有很好的指导意义。
2.4 不同培养时间的拮抗菌抑菌效果对比
图3 罗伦隐球酵母生长曲线
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为了对比不同培养时间的罗伦隐球酵母抑菌
效果，我们绘制了罗伦隐球酵母在液体培养基中
的生长曲线(图3)。该菌株延滞期较短，培养6 h即
进入对数生长期，20 h到达稳定期，随后菌体浓
度保持稳定至28 h，然后进入衰亡期。
图2 病原菌ITS序列分析构建系统进化树
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30个属的真菌及一些细菌[10]。本试验通过对广西
巨峰葡萄冬季果冷藏保鲜过程中主要致病致腐菌
分离鉴定和致病性试验，结果表明：致病微生物
主要是真菌类和少数酵母菌，包括灰霉、交链孢
霉、芽枝霉、大毛霉、茁芽丝孢酵母、黑曲霉、
拟茎点霉共7个种属，其中灰霉、交链孢霉、芽枝
霉、拟茎点霉是广西巨峰葡萄冬季果冷藏保鲜过
程中的主要致病致腐菌，在冷藏条件下，上述7种
病原菌均可对葡萄造成不同程度的病害。
采用生物防治技术降低葡萄采后冷藏保鲜过
程中病害的发生是近年来国外发展起来的极具前
途的“绿色防腐”技术，其原理是利用微生物之
间的拮抗作用，通过改变果实表面微生态环境，
促进病原微生物拮抗菌的繁殖，达到抑制病原微
生物生长、减少腐败的目的。国内相关高校和单
位的研究人员也陆续进行了相关研究工作[12-14]。
在本试验中，我们引入拮抗菌罗伦隐球酵母来控
制葡萄冷藏保持过程中主要致病菌灰霉引发的病
害。试验结果表明，对数生长期的罗伦隐球酵母
其抑制效果最佳，且抑制效果与拮抗菌的使用浓
度成正比。虽然罗伦隐球酵母对由灰霉引发的病
害表现出很好的抑制效果，但还需扩大试验规
模、延长贮藏期，进行冷库保鲜中试验，在葡萄
实际冷藏保鲜过程中进一步验证该拮抗菌的抑菌
效果。
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图5 不同拮抗菌浓度抑菌效果对比
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4个不同培养时期的拮抗菌悬液对灰霉菌引发
的腐烂都有一定的抑制作用(图4)。在处理2 d后，
对数期、稳定期和衰亡期的菌悬液可完全抑制腐
烂的发生，而对照组和延滞期菌悬液处理的葡萄
有一定程度腐烂；4 d后，各培养时期菌悬液均不
能完全抑制腐烂的发生；6 d后，各培养时期菌悬
液处理的葡萄，腐烂程度急剧增加，对照组腐烂
率接近100%，而对数期菌悬液可控制腐烂率低于
50%。分析原因可能是对数期菌体相对于其他时
期菌体，具有更强的繁殖活力和更旺盛的新陈代
谢，在葡萄表面更加快速的生长，从而有效地抑
制灰霉菌的生长。
2.5 不同拮抗菌浓度抑菌效果对比
3种浓度的拮抗菌菌悬液对灰霉菌生长都有显
著抑制作用，其抑制效果与拮抗菌菌悬液浓度呈
正相关(图5)。2 d后，108、107 cfu/mL的菌悬液可
完全抑制腐烂的发生；4 d后，在对照组腐烂率接
近80%的情况下，108 cfu/mL菌悬液将腐烂率控制
在5%以下，6 d后，腐烂率也未超过50%。上述结
果说明，该拮抗菌对灰霉菌引起的腐烂现象具有
显著的抑制效果。
3 结论
引起葡萄果粒田间和采后腐烂的病原菌有
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收稿日期：2013-04-02
基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(桂科转1222017-22)。
作者简介：刘功德(1970—)，男，广西荔浦人，研究员，高级工程师，研究方向为农产品贮藏与加工。
刘功德，苏艳兰，黎新荣，韦茂新
(广西壮族自治区亚热带作物研究所，南宁 530001)
摘要：为了确保番木瓜果粒加工的质量，对各加工工序进行危害性分析，依据各工序对产品质
量(形状、口感、色泽、产品产率等)的影响程度，确定番木瓜果粒加工过程中木瓜原料选择、切
粒、联合护色、浸糖、烘干5道工序为番木瓜果粒加工质量关键控制点，并对如何有效控制关键
控制点进行了探讨。
关键词：番木瓜果粒；加工；质量；关键控制点
中图分类号：TS 255.41 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)08-0315-03
Determination and control of key quality control points in papaya pellet
LIU Gong-de, SU Yan-lan, LI Xin-rong, WEI Mao-xin
(Guangxi Sub-tropical Crops Research Institute, Nanning 530001)
Abstract: To ensure the quality of papaya pellet, after the hazard analysis of each process, according to
the infl uence of each working procedure on the product quality (shape, taste, color, product yield, etc), the
paper determined 5 processes: papaya materials choosing, pellet cutting, the combined of color protecting,
sugar dipping and drying in the course of papaya pellet as key quality control points, and discussed how to
effectively control the key control points.
Key words: papaya pellet; processing; quality; key control point
番木瓜果粒加工质量关键控制点的
确定与控制