全 文 ：黄瓜根结线虫拮抗菌筛选及作用机理初探
李洪涛 ,张翠绵 ,沈江卫 ,王占武＊
(河北省农林科学院 遗传生理研究所 ,河北 石家庄　050051)
　　摘　要:采用击倒 、驱避 、温室盆栽和田间小区试验相结合的方法 ,对已获得的多株拮抗菌株进行了防治
黄瓜根结线虫(Meloidogyne incognita)的筛选实验 ,并对优势菌株的作用机理进行了初步研究.结果表明 ,在
室内共同培养条件下 ,S506 ,Cm05和 M s2菌株表现优秀 ,对线虫的校正死亡率均在 30%以上 ,其中 S506最
高 ,达 48.8%;对线虫的驱避实验 ,以 Cm05+S506组合最好;在连茬 4 ,8 ,11 a 的温室土壤上进行的盆栽和
田间小区实验表明 ,S506的防效最高 、最稳定 ,田间校正防效最高达 85.29%,显著优于阿维菌素14.89%的
防效.S506的抗线虫物质主要是胞外代谢产物.
关键词:黄瓜;根结线虫;生物防治;拮抗菌
中图分类号:Q 939　　　文献标识码:A 　　　文章编号:1000-1565(2006)01-0091-06
The Bio_control of Meloidogyne incognita
by Antagonistic Microorganism in Cucumber
LI Hong_tao ,ZHANGCui_mian ,SHEN Jiang_wei ,WANGZhan_wu
(Institute of Genetics and Phy siology , Hebei Academy of Agricultural and
Forest ry Sciences , Shijiazhuang 050051 , China)
Abstract:The st rains of Antagonistic M icroo rganism in cucumber gained by st riking down , preventing ,
pott ing culture in greenhouse and block experiment on the field w ere selected and tested their cont rol fo r the root
kno t nematode (Meloidogyne incognita)and the bio_control mechanism for the bet ter st rains among them was
studied.The result was show ed:in vit ro condition , S506 , Cm05 and M s2 are the bet ter st rains for control root
kno t nematode and the correct ion death rates of nematode by 3 strains were over 30%, the best one , S506
reached to 48.8%.The strain including S506 and Cm05 w as the best combination for preventing nematode.
The S506 controlling the nematode under the po tting culture in g reenhouse or block planting on the f ield w as in
the highest effect af ter continuous cropping fo r 4 , 8 , and 11 years respectively .The correction death rates of
cont rol nematode reached to 85.29 and it is the higher than Avermmectin(only 14.89%).The main bio_control
substance of.S506 was produced from metabolism of cell outside.
Key words:cucumber ;root knot nematodes(Meloidogyne incognita);biological cont rol;antagonism
　收稿日期:2005-08-26
　基金项目:河北省农林科学院重点项目(A03_1_08_11);河北省科技攻关项目(04220105D)
　作者简介:李洪涛(1976-), 男 ,河北新河人 , 河北省农林科学院助理研究员 ,主要从事植物病理学和微生物资源利用研究.
＊通讯联系人
第 26卷　第 1期
2006年　1月
河北大学学报(自然科学版)
Journal of Hebei University (Natural Science Edition)
Vol.26 No.1
Jan.2006
近年来 ,随着农业产业结构的调整 ,设施蔬菜种植面积越来越大.由于倒茬困难 ,且复种指数逐渐提高 ,
根结线虫的危害日渐严重 ,发生区域不断扩大 ,是设施蔬菜持续发展的主要限制因素之一.根结线虫
(Meloidogyne spp.)在全世界广泛分布 ,寄主范围广.茄科 、豆科 、葫芦科蔬菜受根结线虫的危害最重 ,造成的
减产损失一般在 10%左右 ,重达 75%[ 1-2] .据调查 ,在我国发现的蔬菜根结线虫 ,主要有南方根结线虫
(Meloidogyne incogni ta)、花生根结线虫(M .arenaria)、北方根结线虫(M .hapla)和爪哇根结线虫(M.
javanica)4个种.在南方 4种根结线虫都有发生 ,在北方温室大棚主要是南方根结线虫[ 3-4] .
对根结线虫的防治 ,目前国内主要采用化学杀线虫剂 ,如氯化苦 、溴甲烷 、滴滴混剂 、二溴乙烷 、二溴丙烷
和吸剂呋喃丹 、灭线磷 、涕灭威和威百亩等.化学药剂虽然杀虫快 ,效果好 ,但用量大 ,成本高 ,且对人畜剧毒 ,
破坏土壤微生态环境[ 5] .近年来 ,随着科技的进步和人们环保意识的加强 ,生物防治方法引起了人们的高度
重视 ,将逐渐成为综合防治的重要手段之一.资料报道 ,线虫天敌主要有真菌 、细菌 、病毒 、立克氏体 、放线菌 、
捕食性线虫 、涡虫和原生动物等 ,将真菌和细菌作为生防因子的报道较多[ 6] ,采用放线菌的较少.本研究以
河北省发生较严重的黄瓜根结线虫为实验材料 ,对已获得的包括细菌 、真菌和放线菌在内的多株拮抗菌株进
行了复筛实验 ,对优势菌株的作用机理进行了初步研究.
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　菌种
供试拮抗菌菌株由本实验室从设施蔬菜根际分离 ,保存.黄瓜根结线虫从发病黄瓜根部分离.
1.1.2　药剂
对照药剂为 0.2%(质量分数)阿维菌素乳油(河北威远集团化工厂).
1.1.3　培养基
采用 PDA培养基 、含锰营养琼脂培养基 、高氏一号培养基和麸皮固体培养基等.
1.2　方法
1.2.1　根结线虫卵的分离及二龄幼虫的培养
采用振荡法分离.在黄瓜生长后期 ,挖取发病重 、根结多的黄瓜根 ,用清水洗去根部泥土 ,剪成长 1 cm的
根段 ,放入 500 mL 三角瓶中 ,倒入 200 mL 0.5%NaClO溶液 ,用力摇 3 min.混合溶液过 100目筛 ,用无菌
水冲洗筛上碎片 5次 ,溶液再过 500目筛 ,用无菌水冲洗筛上物 ,液体收集到容器中 ,获得卵悬浮液.用移液
管移取 0.5 mL 卵悬浮液于培养皿中 ,用光学显微镜记录卵数 ,以 40倍(目镜 10×物镜 4)下每视野100个为
宜.将收集到的卵块或卵粒置于中性滤纸上 ,置于 200目网筛上 ,网筛置于盛有清水的盆中 ,水位高度以刚好
浸湿滤纸为宜 ,然后置于 28 ℃恒温箱中孵化 ,每隔 24 h ,将盆中水过 500网筛 ,将孵化的二龄幼虫收集于三
角瓶中 ,置 4 ℃冰箱中备用[ 5 ,7] .
1.2.2　不同拮抗菌株对根结线虫二龄幼虫存活的影响
吸取 3 mL 线虫液于培养皿中 ,然后分别加入 1 mL 拮抗菌培养液 ,对照加无菌水 ,每处理 3 次重复.混
合液放入 28 ℃恒温箱中培养 , 24 h后 ,每皿中加 2滴 0.05%亚甲基蓝水溶液 , 5 ～ 10 min镜检线虫死亡率.
虫体蓝色为死虫 ,不着色为活虫[ 8-9] .
1.2.3　线虫驱避实验
取直径16 cm 、厚 3 cm 的培养皿15个 ,灭菌.分别称取待测菌株的麸皮固体培养物各1.5 g ,与高压灭菌
的黏土与沙子(体积比为 1∶4)混合物混合均匀.将无菌和混有生防菌的砂土混合物分别填充于培养皿中 ,各
占培养皿一半.中央交接处接入线虫液 25 mL.每处理重复 3次.每皿喷等量的无菌水 ,保持湿润.盖好皿盖 ,
置于 28 ℃恒温箱中.30 d后 ,将不同处理中的砂土分别移到 1 000 mL 烧杯中 ,加水至 1 000 mL 刻度线.用
玻璃棒充分搅拌 ,澄清后 ,上清液重复过 500目筛 ,将线虫收集到培养皿中.取相同体积线虫液于显微镜下计
·92· 河北大学学报(自然科学版) 2006 年
数.用亚甲基蓝染色法计线虫死亡数.
1.2.4　温室盆栽实验
分别取连茬4 ,8 ,11 a线虫危害较重的黄瓜大棚土壤 ,装入高 14 cm ,直径 16 cm 的花盆中 ,共60盆 ,其中
拮抗菌处理 、阿维菌素处理和空白对照各 20盆.添加物用量:拮抗菌麸皮培养物 ,5 g/盆;0.2%(质量分数)
阿维菌素乳油稀释 1 000倍 ,于定植后浇灌 ,200 mL/盆.将 2片真叶的黄瓜幼苗(津绿 3号)移入 ,每盆 1棵.
定植后 ,除阿维菌素处理外 ,每盆浇清水 200 mL .3 个月后调查病情指数 ,分级并记录结果.采用的分级标
准[ 10]如下:
0级 ,无根结;1级 ,有少数根结 ,占全根系的 1%～ 25%;2 级 ,根系根结数量中等 ,占全根系的 26%～
50%;3级 ,根系根结数量很多 ,占全根系的 51%～ 75%;4级 ,根系根结数量很多 ,占全根系的 76%～ 100%.
病情指数(%)=∑(级数×同级株数)/(总株数×4)×100.
注:严重度的百分数是指根瘤长度之和占总根系长度的百分比.
1.2.5　田间实验
分别在连茬 4 ,8 ,11 a ,线虫危害较重的黄瓜大棚内进行.拮抗菌菌剂于定植时穴施 ,用前将麸皮培养物
与适量干燥细田土混匀 ,菌剂用量为每棵 0.3 g;对照为 0.2%(质量分数)阿维菌素乳油稀释 1 000倍 ,定植
后灌根 ,每棵 100 mL.菌剂处理 、对照药剂和空白处理的各小区面积为 20 m2 ,随机区组排列 ,每处理 3 次重
复 ,小区周围设保护行.分别在黄瓜定植后 1 ,3 ,5个月调查发病率及病情指数.分级标准同 1.2.4.
1.2.6　防病机理
参照 1.2.2共同培养法 ,对拮抗菌体培养液 、培养液无菌滤出液和斜面培养菌体悬液进行抗虫击倒实
验 ,各重复 3次.分别在 10 , 20 ,30 h 时取 1 mL 混合液镜检线虫击倒率.
2　结果与分析
2.1　不同拮抗菌株对黄瓜根结线虫二龄幼虫的击倒效果
从表 1结果可见 , 24 h 后 , 12 株拮抗菌对黄瓜根结线虫二龄幼虫均有一定的杀伤作用 ,其中 S506 ,
Cm05 ,Ms2对线虫的致死效果最好 ,校正死亡率分别为 48.8%,36.9%和 33.6%, 0.2%(质量分数)阿维菌
素的校正死亡率为 50.9%.
表 1　不同拮抗菌株培养液对黄瓜根结线虫的致死效果
Tab.1　Death rates of Meloidogyne incognit by treatmentes of dif ferent strains
菌株 属别 线虫总数/个 死亡线虫数/个 死亡率/ % 校正死亡率/ %
S506 链霉菌属 127 68 53.5 48.8
S517 链霉菌属 162 47 29.0 21.9
S564 链霉菌属 105 17 16.2 7.8
S579 链霉菌属 109 18 25.7 18.3
Cm05 芽孢杆菌属 148 63 42.6 36.9
Cm11 芽孢杆菌属 126 26 20.6 12.7
Cm32 芽孢杆菌属 99 15 15.2 1.8
L22 芽孢杆菌属 192 49 25.5 18.0
L23 芽孢杆菌属 181 23 12.7 3.96
L34 芽孢杆菌属 152 18 11.8 3.0
Ms1 木霉属 136 46 33.8 27.2
Ms2 木霉属 159 63 39.6 33.6
阿维菌素 121 67 55.4 50.9
清水 CK 175 16 9.1 —
　　　　校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100
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2.2　驱避实验结果
实验发现 ,所有测试菌株对线虫都有一定的驱避作用(表 2),其中 Cm05+S506处理的驱避效果最显
著 ,S506次之 ,再次是 Cm05.对线虫的致死效果以菌株 S506最佳 ,死亡率达到了 52.0%,其次为 Cm05+
S506 ,死亡率为 36.3%,Cm05处理的死亡率仅为 25.0%.Cm05和 S506结合的击倒效果不及单一 S506 ,但
驱避效果优于任何单一菌株 ,是否为 2个菌株相互作用的结果 ,有待进一步研究.
表 2　不同拮抗菌株培养物对黄瓜根结线虫的驱避效果
Tab.2　Dispersing ef fect of different strains no Meloidogyne incognita
处理 位置 线虫总数/个 虫量差别/ % 死亡线虫数/个 死亡率/ %
清水 CK 无菌区 89 11 12.4无菌区 96 7.29 13 13.5
Cm05
无菌区 106 13 12.3
加菌区 95 10.4 24 25.2
S506
无菌区 127 14 11.0
加菌区 102 19.7 53 52.0
Cm05+S506 无菌区 148 15 10.1加菌区 108 27.0 27 36.3
2.3　温室盆栽实验结果
将S506直接用于不同连茬年限的土壤中 ,进行了黄瓜盆栽实验.结果见表 3 ～ 5.
表 3　拮抗菌 S506 在连作 4 a 黄瓜大棚上防治根结线虫效果
Tab.3　Control efficacy of S506 on Meloidogyne incognita in greenhouse with monoculture cucumber for 4 years
处理 发病率/ % 病情指数/ % 防治效果/ %
S506 0 0 100
阿维菌素 35.24 5.47 67.28
空白对照 33.56 16.72 —
表 4　拮抗菌 S506 在连作 8 a 黄瓜大棚上防治根结线虫效果
Tab.4　Control efficacy of S506 on Meloidogyne incognita in greenhouse with monoculture cucumber for 8 years
处理 发病率/ % 病情指数% 防治效果/ %
S506 18.60 8.30 88.74
阿维菌素 38.22 27.21 63.07
空白对照 80.51 73.68 —
表 5　拮抗菌 S506 在连作 12 a黄瓜大棚上防治根结线虫效果
Tab.5　Control efficacy of S506 on Meloidogyne incognita in greenhouse with monoculture cucumber for 12 years
处理 发病率/ % 病情指数/ % 防治效果/ %
S506 22.4 10.03 87.5
阿维菌素 61.82 42.1 48.8
空白对照 94.0 82.47 —
·94· 河北大学学报(自然科学版) 2006 年
与阿维菌素比较 , S506 对根结线虫的防效较高 ,且表现稳定 ,在不同年限土壤中的防效分别达到了
100%,88.7%和 87.5%.而阿维菌素处理随连作年限的增加 ,防效逐渐下降.
2.4　拮抗菌在田间小区的应用效果
以 S506麸皮固体培养物为试材 ,在连作 12 a温室大棚小区进行了应用实验 ,分别于定植后 1个月 ,3个
月和 5个月进行防效调查 ,结果见表 6 ～ 8.
表 6　定植 1 个月后 S506 的防治效果
Tab.6　Control ef ficacy of S506 in greenhouse af ter planting one month
处理 发病率/ % 病情指数/ % 防治效果/ %
S506 14.10 2.57 75.96
阿维菌素 34.53 5.43 49.20
空白对照 47.26 10.69 —
表 7　定植 3 个月后 S506 的防治效果
Tab.7　Control ef ficacy of S506 in greenhouse after planting three month
处理 发病率/ % 病情指数/ % 防治效果/ %
S506 31.48 11.46 82.44
阿维菌素 95.32 47.52 27.21
空白对照 100 65.28 —
表 8　定植 5 个月后 S506 的防治效果
Tab.8　Control efficacy of S506 in greenhouse after planting five month
处理 发病率/ % 病情指数/ % 防治效果/ %
S506处理 56.23 12.54 85.29
阿维菌素 100 72.51 14.98
空白对照 100 85.29 —
黄瓜定植 1 ,3 ,5个月后 ,S506对根结线虫的防效分别为 75.96%,82.44%和 85.29%,防效随时间的延
长而增加 ,而阿维菌素分别为 49.20%,27.21%和 14.98%,且防效随黄瓜生长期的延后逐渐降低 ,这可能与
阿维菌素在土壤中的降解有关.
2.5　拮抗菌 S506防病机理实验
分别用 S506的培养液 、培养液无菌过滤液和活菌体与二龄幼虫混合培养 ,于 10 , 20 , 30 h 后检测击倒
率.比较实验结果发现(表 9),培养液对二龄幼虫的击倒效果最为显著 ,培养液的无菌过滤液次之 ,活菌体最
差.在 3个时间段 ,菌体培养液的击倒率分别为 33.3%, 36.5%和 42.3%,均达到 30%以上;培养液无菌过
滤液分别为 26.7%,32.1%,32.4%;活菌体仅为 6.7%,14.4%和 21.6%.结果说明 ,S506 对根结线虫的杀
伤作用主要是胞外代谢产物 ,活菌体的作用较小.
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表 9　S506 不同培养物对二龄幼虫的致死率
Tab.9　Death rates of second larva of Meloidogyne incognita by different culture material of S506
时间 10 h 20 h 30 h
处理 线虫总数/个
死亡线虫数/
个
死亡率/
%
线虫总数/
个
死亡线虫数/
个
死亡率/
%
线虫总数/
个
死亡线虫数/
个
死亡率/
%
培养液 　　57 　　19 　 33.3 　　63 　　23 　 36.5 　　78 　　33 　42.3
培养液无菌
过滤液 60 16 26.7 78 25 32.1 68 22 32.4
活菌体 119 8 6.7 104 15 14.4 88 19 21.6
清水 CK 118 2 1.7 129 10 7.8 169 12 7.1
3　讨论
3.1　目的菌株的筛选
目的菌株的筛选有多种方法 ,但要在短时间内获得具有应用前景的优势菌株 ,实验方法很重要[ 5] .本实
验采用了室内培养 、盆栽生测和田间表达验证相结合的方法 ,获得了具有较好应用前景的优势菌株 S506.
3.2　关于分级方法
对根结线虫危害度的分级有多种方法 ,常见的有百分比法 、根结记数法和根结形态法[ 5 , 8] .根结记数法
和植株根系的发达程度有关 ,不能如实反映病情.根结形态法在根结线虫病发病严重时适用.因此本研究采
用常用的百分比法 ,减少了根量不一致的影响 ,能更好地反映实际防效.
3.3　防病机理
目前对拮抗菌防治线虫机理还不是很清楚 ,但认为与拮抗菌产生杀线虫物质 、改变根分泌物与线虫的作
用方式 、营养和空间位点竞争以及诱导植物产生抗病性等因素有关.本研究初步确定了 S506对线虫的杀伤
作用主要是胞外代谢产物 ,具体代谢物的种类 、分子结构等还有待进一步深入研究.
3.4　拮抗菌剂型及应用方法改进
如何能充分发挥拮抗菌的生防功能 、提高防效稳定性是当前需要解决的关键问题.本实验采用麦麸固体
培养物直接施入田间 ,由于施用量较小 ,容易造成施用不均现象 ,尽管采用与细田土混合的方法 ,但在实际应
用时不是很方便 ,需要进行适当改进.随后实验表明 ,将发酵物与有机肥料结合制成生物有机肥 ,可有效解决
上述问题 ,而且防效较好 ,有关结果将另文报道.
参　考　文　献:
[ 1] DICKLOW W B , ACOSTA N , ZUCKERMAN B M.A novel Streptomyces species for controlling plant_parasitic nematodes[ J] .
Journal of Chemical Ecolog y , 1993 , 19(2):159-173.
[ 2] I KA IBRAHIM , WAFAA T SHAHDA , OMAIMA I DAWOOD.Reaction of eg gplant and pepper cultivars to Meloidogyne are-
naria and its bio logical control on eggplant [ J] .Alex J Ag ric Res , 1998 , 43(3):151-157.
[ 3] 彭德良.蔬菜病虫害的综合治理～ 蔬菜线虫病的发生和防治[ J] .中国蔬菜 , 1998(4):57-58.
[ 4] 彭德良 , 唐文华.番茄抗根结线虫 Mi基因研究进展[ J] .沈阳农业大学学报 , 2001 , 32(3):220-223.
[ 5] 杨文香 , 袁胜亮 ,刘大群.蔬菜根结线虫在我国发生及防治现状[ J] .河北省植物病理学研究 , 2003(1):391-397.
[ 6] 汪来发 , 杨宝君 ,李传道.根结线虫生物防治研究进展[ J] .南京林业大学学报(自然科学版), 2002 , 26(1):64-67.
[ 7] 张克勤 , 高恩 S , 芭芭拉 T.根结线虫天敌真菌及其高效菌株筛选[ J] .真菌学报 , 1993 , 12(3):240-245.
[ 8] 方中达.植病研究法[ M] .3 版.北京:中国农业出版社 , 1998.
[ 9] 万树青 , 周青春 ,庄浓波 , 等.杀线虫剂活性测定线虫死活染色鉴别的研究[ J] .农药 , 1993 , 32(1):18-19.
[ 10] 肖炎农 ,王明祖 , 付艳平 ,等.蔬菜根结线虫病情分级方法比较[ J] .华中农业大学学报 , 2000 , 19(4):336-338.
(责任编辑:李洪建)
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