全 文 ：2 () 0 7年 34 ( l ) 微 生 物 学 通 报
龙须菜体表附生细菌的几种分离方法比较 *
徐永健 乐观宗 张友平
( 宁波大学生命科学与生物 「程学院 宁波 315 21
摘要 :采用超声波粉碎法 、 涡旋振荡法 、 超声波清洗法 、 研磨匀浆法等 4 种不同的方法处理龙须菜 , 分离其体
表的附生细菌 , 并对分离细菌的数量 、 种类 、 形态结构 、 细胞壁特性等进行了观察和分析 。 通过对不同方法和
相同方法的不同处理所得结果比较显示 , 超声波清洗法和研磨匀浆法对分离细菌的数量和种类效果都较差 ; 超
声波粉碎法和涡旋振荡法效果较好 , 尤以超声波粉碎法的 30 W 30 s 处理效果最好 , 该方法分离到本项 目 4 个方法
13 个处理获得的 16 个菌株中的 12 个菌株 , 龙须菜的细菌数 1 . 75 / 10 “。 1 5 / g 。
关键词 : 海藻 , 龙须菜 , 附生细菌 , 分离方法
中图分类号 : 9Q 3 文献标识码 : A 文章编号 : 0 25 3 一26 54 《2 0 7) 01 一 12 3-04
C o m P a r i s o n 们 t h S e v e r a l M e t h o d s t o I s o l a t e E P IP h y t ie B a c t e r ia fr o m
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` . le lna , 如mr 氏
K e y w o dr
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, ` ar e i la o a le naz 、 必mr i , E p ip h y t i (、 l) a o t e ir a , Is o l a t i`, n m e t h `记
藻类在生长过程中向环境释放大量的有机物
质 , 使藻细胞周围形成一个独特的微环境 , 称为
藻际微环境 ( p h y e o s p h e r e ) 。 在藻际微环境 中 , 生
活着大量 的细菌 , 这些细菌具有 独特的结构与功
能 , 同藻细胞之间构成复杂的关系。 如对藻体的
附着和变态产生影响 [ ’ ; , 调控藻体分泌的物质 [ ’味
已发现的许多海洋活性物质是 由海藻附生菌产生
的 , 如抗生素 、 酶 、 色素等 {’ 川 , 藻际微环境 中的
微生物是一个潜在丰富的资源库 ! ’ { 。
尽管已分离和鉴定了许多藻类的附生菌 , 揭示
一
r 两者之间一定的关系 。 但对藻际细菌的很多生态
学意义仍然还没有研究清楚 , 在大多数情况下甚至
连起作用菌株都没有分离到 { 6 } 。 要研究这些附生细
菌的相关性质和作用以及细菌与海藻之间的复杂关
系 , 首先要找到一种能够有效的从海藻表面分离附
生微生物的方法 。 目前国内关于藻类表面附生细菌
的分离方法的报道还很少 , 在实验中涉及到附生微
生物分离的仪器和方法也不尽一致 。 本实验采用 4
种不同的仪器 , 设 置 了 系列 分 离 方 法 对 龙须菜
( aGr icl ar ia le aln ne ifo
r从is ) 体表附生细菌进行 了分离
和鉴定 , 试图寻找出一种有效的分离方法 , 为以后
类似研究提供一些参考和依据 。
1 材料与方法
1
.
1 试验材料
实验用龙须菜 ( .c le m a ne 如mr is ) 采自宁波象
’ `犷波市博十 基金项 日 ( N o . Z o 5 A 6l o 25 )
亏’ 波 l有科技 I正乙[ 1 ( N o . 2 0C “ 6 1X() 2 8 )
宁波市自然科学摹金项 口 ( No . Zo 6 A 6l o 87 )
通讯作者 1’ e l : 8 6 一 5 74 一 8 7 6州〕37 4 , E 一 m a i l : x u y 。, n周 i a n @ n卜u . e d u . 。 n
收稿 日期 : 2以拓习 3 一 ! O , 修回 日期 : 2创巧一 5 一 10
DOI : 10. 13344 /j . mi crobi ol . chi na . 2007. 01. 032
微 生 物 学 通 报 2伪7 年 3 4( l)
山港内的养殖筏架 , 带 回实验室后 , 冲洗干净 ,
去除杂藻 , 暂养在室用 l o L 塑料大桶中 , 暂养条
件为 : 60 W 荧光灯作光源 , 光周期 12 L : 12 D , 添
加营养盐 2 0 林m o l ( N ) / L 、 2林m o l ( p ) / L , 每天早
晚搅拌 2 次 。
实验中 , 用 于分离微生 物的培养基为 z ob el
2 2 16 E 海水培养基 。
实验采用的主要分离仪器有 : 超声波粉碎机
JY 9 6
一
n 型 ( 宁波科生仪器厂 ) , 旋涡振荡仪 QL -
86 1 (江苏海门市麒麟医用仪器厂 ) , 超声波清洗
C Q25
一
12 D (宁波新艺生物科技股份有限公司 ) , 石
英砂和匀浆研钵 。
1
.
2 分离方法
取暂养龙须菜约 0 . 2 9 , 用灭菌纱布吸干藻体
表面水分 , 电子天平准确定量 , 记录各处理的藻
体重量 。 把海藻分别放人到已经灭菌的装有 10 m L
海水的大试管中 , 用棉塞塞紧 , 整个过程无菌操
作 。 然后再进行下一步的处理 。 各处理设 2 个重
复 , 各处理的鲜藻量及编号见表 1 。
表 1 不同处理的龙须菜用 t 及技术指标
分离方法 各处理技术指标 龙须菜质量 ( g )
超声波
粉碎法
研磨法
旋涡振荡法
超声波
清洗法
5 1 ( 3 0W 3 0 5 )
52 ( 30 W l
.
s m i n )
53 ( 30 W 3 m i n )
弘 ( 5 0W 3 0 5 )
5S ( 5 0W l
.
s m i n )
泌 ( 50 W 3 m i n )
Y (匀浆 )
W l ( 3 m in )
W Z ( 6 m in )
W 3 ( 10 m i n )
C I ( 3 m i n )
C Z ( 6 m i n )
C 3 ( 10 m i n )
0
.
2 1 17 士 0
.
(又)2 4
0
.
2 0 3 7 土 0
. 以 ) 18
0
.
2 12 5 士 0
. 〕 〕3 1
0
.
2 09 0
土 0
.
X() 14
0
.
2 0 3 4 士 0
.
(X )2 7
0
.
2 0 18 土 0
.
(刃 1 1
0
.
19 4 2 土 0
.
(刃 17
0
.
2 0 2 6 士 0
.
(X〕2 9
0
.
2 0 7 8 t o
. 〔洲〕19
0
.
2嘴又 3 士 0 . (幻 12
0
.
2 0 3 7 士 0
.
X() 2 5
0
.
2 10 3 士 0
. 《M〕3 5
0
.
2 0 8 2 士 0
. 《犯2 2
1
.
2
.
1 超声波粉碎法 : 设 6 个组别 , 第 l 组 : 把超
声波粉碎机的探头插人到装有龙须菜的大试管底部
附近 , 开动仪器 , 功率 30 W , 作用时间 30 5 , 处理
液为 lS ; 第 2 组 : 与第 l 组功率相同 , 时间增加到
1
.
s m in
, 处理液为 2S ; 第 3 组 : 功率 30 W , 时间
3 m in
, 处理液为 5;3 第 4 组 : 处理方法同第 l 组 ,
功率设为 50 W , 作用时间为 305 , 处理液为 弘 ; 第 5
组 : 与第 4 组同 , 时间 1 . 5而 n , 处理液为 5S ; 第 6
组 : 与第 4 、 5 组同 , 时间 3m in , 处理液为 6S 。
1
.
2
.
2 旋涡振荡法 : 设 3 个组别 , 第 1 组 : 手持
大试管 , 使其在旋涡振荡仪上振荡 , 试管的角度
与旋涡振荡仪成 9 0 度 , 作用时间为 3 m in , 处理液
为 W ;I 第 2 组 : 方法与上 述 相 同 , 处理 时间
6 m i n
, 处理液为 W Z ; 第 3 组 : 处理时 l司 I Om i n ,
处理液为 w 3 。
1
.
2
.
3 超声波清洗法 : 也设 3 个组别 , 第 l 组 :
把大试管放人 到超声波清洗仪处理液面 以下 , 作
用时间 3m in , 处理液为 lC ; 第 2 组 : 方法同前 ,
作用时间 6 m in , 处理液为 C;2 第 3 组 : 处理时间
10 m i n
, 处理液为 C 3 。
1
.
2
.
4 研磨匀浆法 : 在研钵中加入适量的石英沙 ,
4℃ 环境下加 人 10 m L 生理 盐水充分研磨 , 静置 ,
处理液为 Y 。
1
.
3 菌株分离 、 纯化和观察
对以上各处 理的处理液 , 用灭菌移液枪吸取
上清液 10 林L , 分别注人到盛有 90 卜 L 无菌海水
的离心管中 , 吹吸多次 , 使充分混匀 , 制成 10 一 ` 、
or
一
, 、 10
一
, 稀释度的菌悬液 , 用灭 菌移液枪吸取
10 林L 菌悬液在平板上均匀涂布 , 放人恒温培养箱
2 8℃培养 ; 分别于 3 6 h 、 4 8 h 、 7 2 h 进行菌落计数 ,
根据下述公式进行换算得每 g鲜重海藻所得的细菌
密度 ( B N , e e l ls/ g ) :
B N = y
· 「10 x 10 一 , c fu + l o x 一。 ” C fu 」/ ( 6 x 『 )
其中 : B N 为单位海藻重 量所分离的菌落数
(
e e ll s / g )
,
V 为处理液 的体积 ( m L ) , 10 一 , e fu 、
10
一
, C fu 分别 为 10 一 , 、 10 一 稀释梯度平板上 3 6 h 、
4 8 h
、
7 2 h 3 次计数最多一 次的菌落个数 , w 为龙
须菜鲜重 ( g ) 。
及时挑取形态不同的菌落 , 进行纯化培养 ,
直到没有新的菌落长出 , 该过程约持续 1 周 。 对
于纯化培养的细菌 , 对其菌落进行形状 、 大小 、
颜色 、 革兰氏染色观察和描述 。
1
.
4 数据分析
用 SPS S 统计软件进行方差分析及多重比较 。
2 结果与分析
2
.
1 各处理分离的菌落数 , 比较
各处理所分离的菌落数量见图 1。 从图中可以
看出 : Y组即匀浆处理所得的菌落数最少 , 平均仅
为 1 . 9 6 x or , c le ls/ g 龙须菜 ; 超声波清洗仪的 C
组 , 以 c Z 处理 6 m in 的作用时间为最佳 , 低于和
20 7 年 34 ( l ) 微 生 物 学 通 报
高于此处理时间所得的结果都不好 ; 相似的涡旋
振荡仪的 W组也是如此 , 作用时间 6 m in 以上效
果才比较好 , 经比较分析 6 m i n 和 10 m i n 处理所得
的结果差异不显著 (尸 > 0 . 05 ) ; 使用超声波粉碎
仪的 S 组 , 图中显示 , 不管其作用功率为 30 W 或
50 W
, 所分离到的菌落数都随着作用时间的延长而
减少 , 其中低功率处理要好于高功率处 理 , 分离
到最多菌落数的处理是 5 1 , 为 1 . 7 5 / l o 6 e e l l s / g ,
也是在所有 13 种处理中所得菌落数最多的 。
2 0
「
5 1 5 2 5 3 5 4 5 5 S 6 W 】W Z W 3 C 1 C Z C 3 Y
分离方法
2
.
2 各处理分离菌株数 i 比较
根据各纯化平板 上菌株的菌落形状特征 ( 见
表 2 ) , 各处理所分离到的菌株种类数量 , 如表 3 。
其中用超声波粉碎法 , 处理龙须菜所获得 的菌落
种类数量相对要 比其他几种方法所得 的种类数要
多些 , 尤以 lS 处理 ( 30 W 3 0 5 ) 效果最好 , 初步分
离到 12 株附生细菌 ; 涡旋振荡法也获得了较多的
菌落种类 , 且随着处理时间的延长 , 获得的菌落
数也在增多 , 但本试验中 6 m in 处理和 10 m in 处理
尽管在所 得菌落种类数量土有一些差异 , 不过两
处理间在所得的单位藻体细菌细胞密度上没有显
著的差异 (尸 > 0 . 0 5 ) ; 采用超声波清洗法进行海
藻附生菌的处理 , 以 6 m in 处理所得的效果最好 ,
得到的菌落种类数量也最 多 ; 通过对海藻匀浆化
处理仅获得 7 株附生菌的菌落特征 。 在获得 的所
有 16 株菌落中 , 以 I 、 1 、 VI 、 竹 、 姐 、 XI 这 6
个菌株出现的机率较高 , 尤其是菌株 I 在每 一个
处理中都能分离到 , 而 1 、 V 、 以 、 X 、 xI 、 X
V
、
X VI 这 7 个菌株出现的机率较低
0了04,`自U86,
ǎ严。一51。百燕穆佃
图 1 不同处理所得菌落数量比较
表 2 16 株细菌的菌落特征
菌株 菌落形状 菌落大小 色泽 隆起 边缘
光滑
光滑
光滑
光淞
光汾
光滑
光滑
光滑
( ;
+
/ 《二
圆形
圆形
圆形
圆形
圆攀
圆形
圆形
圆形
不规则
圆形
圆形
圆形
圆形
圆形
圆形
圆形
中
中
小
呼1
J/
、
细小
小
中
中
小
小
件,
大
中
大
中
内部透明 , 外部有白色环
中心淡黄色
深黄色
乳白色一透明一乳自色
黄色
淡黄色
乳自色
中心黄色 , 边缘淡黄色
中心乳自 , 边缘透明
粉红色
自色
黄色
透明
中心浅棕色 , 边缘乳自
深 黄色
乳自色
平
平
平
平
平
平
凸面
平
低凸
平
低凸
平
平
凸面
平
低凸
( ;
《二
(二
( ;
1num
GC
较粗糙
光滑
光滑
光滑
粗糙
较粗糙
光滑
粗糙
WvVI姗xIxlX切
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表 3 不同分离方法所得到的菌株种类
菌 落 种 类处理 株数
1 n 1 VI V VI 珊 姗 xI X 习 姗 X l X八, X V X切
微 生 物学 通 报 2 (X) 7 年 34 ( l )
续表 3
,ù今」
W
-
,`JC
Y 7 + + + + + + +
3 结论与讨论
本次实验采用的不同方法从龙须菜藻体表面
分离到的菌株数为 5 一 12 株不等 , 总共获得了 16
株细菌 。 徐 涤等川 采用研磨匀浆法在海带表面
分到 1 株附生菌 , 马悦新等 〔8 ,0] 采用 10 im 。 涡旋
振荡法从绿藻 、 红藻 、 褐藻体表分离到 6 一 13 株
不等的附生菌 , 这与本试验所得结果相似 。 这些
资料没有对藻体表面的附生细菌数量进行定量分
析 , 而获得的附生细菌群落结构的差异 , 可能与
不同海藻表层细胞结构不 同有关 , 还有可能是与
采用的处理方法不同有关 , 如本试验中同一方法
的不同处理间所得的结果也不一样 , 因此 , 为了
更好地进行菌藻间 的研究和数据的横向 比较 , 非
常有必要在处理技术和方法等方面进行进一步地
探讨 。
本实验采用了 4 种不 同的方法分离龙须菜附
生菌群落 , 从所得的单位藻体附生菌的数量上来
看 , 超声波清洗法和匀浆法相对较差 , 这 可能与
超声波清洗仪的工作原理有关 , 其主要用 于物体
表面的清洗 , 而我们把海藻放到玻璃管中再放人
仪器 , 这样的作用效果不佳 ; 匀浆法效果 最差 ,
可能是研磨破坏 了细菌的细胞结构造成了不可培
养 , 导致得 到的细菌数量和种类较少 。 涡旋振荡
法的效果较好 , 且随着处理时间的延长 , 所得的
细菌密度有所增加 , 但 6 m in 以上 处理 , 增加 不
多 ; 超声波粉碎法 的效果 最好 , 但不是作用 时间
越长越好 , 在相同功率下 , 分离效果 305 > 1 . 5 m in
> 3而 n , 而低功率作用效果要好于高功率 , 超声
波处理时间过长 , 会对 细菌产生很大的破坏 〔’ 。〕 ,
超声波粉碎仪有粉碎细胞及分离物体表面附着物
的作用 , 功率太高和作用时间太长可能是把分离
下来的细菌都粉碎了 , 因此 , 本试验 中时间短
( 3 0
5
) 能量低 ( 3 0 W ) 处理效果最好 。
从分离的附生菌的菌株数量来看 , 超声波粉
碎法分离到的菌落最多 , 并且得到了其它分离方
法没有分离下来的菌落 , 尤其是能分离到出现机
率较低的菌株 , 这应与该方法超声波直接作用 于
藻体表面有关 , 这样可分离出藻体表面深层附生
的细菌种类 。
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