全 文 ：doi:10.3969 /j.issn.1001-1994.2010.06.001
一株斜生栅藻的筛选及生长条件的优化
　收稿日期:2010-06-07
　作者简介:季祥(1978-),男 ,硕士 ,副教授 ,从事生物质能 、生物制浆研究。　通讯作者:蔡禄(1964-),男 ,博士 ,教授 ,内蒙古科技大学生物工程与技术研究所所长 、数理与生物工程学院院长 ,从事生物质能 、生
　物信息 、分子生物学研究。
　基金项目:教育部春晖计划(Z2009-1-01057)、内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJzy08233)、包头市科技攻关项目(2008y1002
　-2)、内蒙古科技大学创新基金项目 ,项目批准号(2009NC061)。
季祥　　王金荣　　丁潇　　蔡禄
(内蒙古科技大学生物工程与技术研究所 ,包头　014010)
摘　要:从内蒙古本地淡水湖泊中筛选得到一株含油相对较高 、长势较好的藻种 ,经初步确定为斜生栅藻
(Scenedesmusobliquus), 以 BG11为基础培养基对其生长条件进行了优化。斜生栅藻的最适生长条件为:接
种量为 20%;培养基初始 pH值为 6.5;N、P、Fe、Mg四种营养盐的质量浓度分别为 NaNO3 0.5 g/L,
K2HPO4· 3H2O0.10 g/L, FeCl3· 6H2O0.008 g/L, MgSO4· 7H2O0.10 g/L, 富油斜生栅藻在优化后的培
养基中生长状况良好 ,稳定期最大生物量(A68 0)可达 1.905。
关键词:斜生栅藻;筛选;生长条件优化
　　随着人类社会资源短缺和环境问题的日益突
出 ,全世界正面临着能源匮乏和生态环境破坏的
危机 ,因此 ,寻求一种绿色的可再生的新能源成为
世界各国科学家普遍关注的科学问题 [ 1] 。生物
柴油是清洁的环境友好型可再生能源 ,但由于其
原材料成本较高 ,目前价格仍高于传统柴油。在
众多的生物中 ,微藻具有种类繁多 、光合利用度
高 、自身合成油脂的能力强等优点 [ 2] 。利用藻类
油脂生产生物柴油具有缓解温室效应 ,不与人争
粮 、不与粮争地的独特优势 ,通过微藻油转化生产
生物柴油 ,具有广阔的开发利用前景 。笔者筛选
了内蒙古中西部地区湖泊中大量的优势藻种 ,对
其中一株含油量较高的绿藻进行了初步研究 ,探
索优化的生长条件 ,最大限度地提高其生物量的
技术 ,旨在为利用它进行微藻油的大规模生产应
用提供理论依据 。
1材料与方法
1.1藻种来源
试验用斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)为从
内蒙古包头市南海湖中分离得到的一株绿藻。
1.2藻种的筛选
在含微藻类植物的水体中取 50 mL水样 ,先
用滤纸过滤去除大型颗粒物 ,然后将滤液放入经
高温高压灭菌的 BG11培养基中 ,在光照培养箱
中进行富集培养。待培养液改变颜色后 ,取样进
行镜检 ,鉴定藻类的组成 ,之后进行分离纯化。将
藻液置于离心管内 ,以 4 000 r/min离心 20 min。
倒净上清液 ,加入 10 mLBG11培养基 ,振荡使藻
细胞悬浮 、均匀分布 ,然后采用平板划线法和涂布
法进行转接 。涂布时须先稀释 ,边稀释边镜检 ,使
藻细胞浓度控制在每滴藻液中含十几个到几十
个 ,将培养皿放在适宜条件下培养。大约两周后 ,
在培养皿上可看见一个个藻落 ,选取中等大小长
势良好的藻落转接到试管中。在试管中培养一周
后 ,取培养液制片放于显微镜下观察 ,筛选出藻种
后转接扩培并参考 Bligh＆Dyer的方法[ 3]进行油
脂含量的测定。
1.3藻生物量测定
藻生物量的测定采用浊度比色法 [ 4] 。本试
验用 752紫外可见分光光度计在波长 680 nm处
测定培养液的吸光值 Absorbance(A6 8 0),试验数
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据采用 EXCEL2003 结合 SPSS17.0(General
LinearModel)软件进行统计分析 。
1.4斜生栅藻生长条件的优化
1.4.1初始培养条件的确定　　本试验以 BG11
培养基作为基础培养基 ,培养斜生栅藻的光照强
度和温度参照采样点的环境确定 ,在光强 3 000
lx、光暗周期 14 h∶10 h、温度 25±1 ℃下静置培
养 ,培养期间每天充分振荡 3次 ,并随机交换位置
以减少光照差异 。
1.4.2培养基初始 pH值和接种量的优化　　培
养基初始 pH值和接种量是影响微藻生长的重要
因素 ,本试验对培养基初始 pH值为 5.5、6、6.5、
7、7.5时斜生栅藻的生长情况进行测定 ,并按体
积比为 5%、10%、20%、25%、30%的接种量进
行接种 , 静置培养 , 每天定时取样测其吸光值
(A6 8 0),优化其最适生长的 pH值和接种量。
1.4.3培养基中 4种营养盐的优化　　斜生栅藻
在接种前一天分别换上不加 N、P、Fe、Mg营养盐
的 BG11培养基 , 培养 24 h后 , 按 0、 0.5、1.0、
1.5、2.0和 2.5 g/L的质量浓度加入 NaNO3;按
0、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14g/L的质量浓度加
入 K2HPO4 · 3H2O;按 0、 0.002、 0.004、 0.006、
0.008和 0.01g/L的质量浓度加入 FeCl3· 6H2O;
按 0、0.025、0.05、0.075、0.10和 0.125 g/L的质
量浓度加入 MgSO4 · 7H2O。每组试验设置 3个
平行 ,每天定时取样测其吸光值(A6 8 0),分别检测
不同水平的 N、P、Fe、Mg营养盐对斜生栅藻生长
的影响 。
2结果与讨论
2.1藻种的筛选结果
笔者对大量长势较好的藻落进行扩培并测定
其干燥藻粉的油脂含量 ,取其中一株含油量为
31.5 %的藻种在显微镜下进行分类鉴定 (图
1)[ 5] , 初 步 确 定 为 斜 生 栅 藻 (Scenedesmus
obliquus)。
2.2pH值对斜生栅藻生长的影响
pH值作为藻类生长环境的重要理化指标 ,在
微藻自养培养时不仅影响光合作用中 CO2的可
用性 ,并对微藻细胞吸收和利用培养基中的营养
盐起着重要作用 。
　　培养基的 pH值对微藻的生长有极显著的影
响(图 2),当 pH值在 6 ～ 7时 ,斜生栅藻生长状况
较好 ,生物量较高。当培养基的 pH值为 5.5或
7.5时 ,该藻的生长受到抑制 ,生物量较低并很快
进入衰亡期。最适合该藻生长的培养基的初始
pH值为 6.5。
2.3初始浓度对斜生栅藻生长的影响
图 1　显微镜下筛选的斜生栅藻细胞形态
图 2　初始 pH对斜生栅藻生长的影响
图 3　初始浓度对斜生栅藻生长的影响
　　当接种量为 5 %和 10 %时 ,藻细胞密度太
小 ,斜生栅藻生长缓慢 ,生物量很低;接种量为
25%和 30%时 ,观察其生长曲线可知 ,斜生栅藻
直接进入指数增长期 ,生长较快 ,但初始接种密度
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过大 ,生长后期因营养供给不足而导致生长受限;
当接种量为 20%时 ,该藻的生长状况良好 ,最高
生物量(A6 8 0)可达 1.122(图 3)。因此 ,接种量
为 20%时对斜生栅藻的生长最为有利 。
2.4氮对斜生栅藻生长的影响
氮是影响斜生栅藻细胞生长和繁殖的重要因
素 ,是形成氨基酸 、嘌呤 、氨基糖和胺类化合物的
基本元素[ 6] 。微藻只能对溶解于水体的氮源加
以利用 ,因此 ,本试验以 NaNO3为氮源 ,研究了不
同质量浓度的 NaNO3对斜生栅藻生长的影响(图
4)。
图 4　不同质量浓度的 NaNO3对斜生栅藻生长的影响
　　培养基中不加氮源 ,藻细胞只能消耗自身物
质以满足生长对氮源的需求 ,斜生栅藻的生物量
很低并很快死亡;当 NaNO3的质量浓度在 0.5 ～
1.0g/L范围内时 ,对斜生栅藻的生长具有明显
的促进作用(P<0.05);当 NaNO3的质量浓度大
于 1.5g/L时 ,该藻的生物量几乎无增长趋势;培
养斜生栅藻的最适 NaNO3质量浓度为 0.5 g/L。
2.5K2HPO4· 3H2O对斜生栅藻生长的影响
磷在生物体内是合成 ATP、GTP、核酸 、磷脂 、
辅酶等化合物的基本元素[ 6] 。本试验以 K2HPO4
· 3H2O为磷源 ,分析了不同浓度的 K2HPO4 ·
3H2O对斜生栅藻生长的影响(图 5)。
　　当 K2HPO4· 3H2O的质量浓度在 0 ～ 0.06g/
L范围内时 ,对斜生栅藻的生长具有明显的促进
作用(P<0.05);当质量浓度在 0.06 ～ 0.08 g/L
范围内时 ,对该藻的生长影响不大;当质量浓度大
于 0.10 g/L时 ,该藻的生长呈现下降趋势;最适
K2HPO4· 3H2O的质量浓度为 0.10 g/L。
2.6Fe3 +对斜生栅藻生长的影响
铁是浮游植物生长过程中电子传递 、氮的吸
收利用 、光合作用的必要元素 ,铁缺乏将对浮游植
物的生长和光合作用产生重要影响[ 7] 。本试验
以 FeCl3· 6H2O为铁盐 ,分析了不同浓度的 Fe3 +
对斜生栅藻生长的影响(图 6)。
图 5　不同质量浓度的 K
2
HPO
4
· 3H
2
O
对斜生栅藻生长的影响
图 6　不同质量浓度的 FeCl3· 6H2O对斜生栅藻生长的影响
　　结果显示 ,铁是限制斜生栅藻生长的重要微
量元素之一 ,当 FeCl3· 6H2O的质量浓度在 0.002
～ 0.008g/L范围内时 , 能够触发细胞的分裂和
生长(P<0.05);当质量浓度超过 0.01 g/L后可
能产生毒性 ,生长受到抑制 ,生物量较低;FeCl3·
6H2O的质量浓度在 0 ～ 0.002 g/L范围是属于缺
铁状态 ,藻细胞分裂较为缓慢 ,藻液颜色为黄色。
培养基中虽然有足够的氮 、磷等营养盐 ,但斜生栅
藻的生长却受到限制 ,适当加入铁盐 ,能促进藻细
胞对硝酸盐的利用 。本试验结果与 Martin等[ 8]
提出的部分海域浮游植物生长中铁的限制性作用
假说相一致 。
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2.7Mg2 +对斜生栅藻生长的影响
微藻是光合自养生物 ,因而镁在其生长过程
中起着重要的作用。镁是酶的激活剂 ,在植物体
内参与糖酵解 、三羧酸循环 、呼吸作用 、碳酸盐还
原等过程的酶都要依靠镁来激活[ 9] 。本组试验
选取 MgSO4· 7H2O提供镁元素 ,分析了不同浓度
的 Mg2 +对斜生栅藻生长的影响(图 7)。
图 7　不同质量浓度的 MgSO
4
· 7H
2
O
对斜生栅藻生长的影响
　　当 MgSO4 · 7H2O的质量浓度在 0.01 ～
0.025 g/L范围内时 ,对斜生栅藻的生长有明显
的促进作用(P<0.05);当浓度在 0.025 ～ 0.10
g/L范围内时 ,对该藻的生物量基本没有影响;质
量浓度超过 0.10 g/L后生长呈下降趋势 。当培
养基中不含镁时 ,斜生栅藻的生长状态较差 ,原因
可能是缺镁导致叶绿体结构严重破坏和某些需镁
酶的失活 ,因此 , MgSO4· 7H2O的最适质量浓度
为 0.10 g/L。
2.8优化后微藻生长情况的测定
图 8　斜生栅藻在优化培养基中的生长曲线
　　该藻优化后在培养基中培养的生物量 ,第 10
d就超过了该藻在 BG11培养基中的最高生物量 ,
并提前 3 d进入对数生长期可持续增长 ,稳定期
的最大生物量吸光值(A6 8 0)可达 1.905,富油斜
生栅藻在优化培养基中的生长情况良好。
3结论
笔者对内蒙古中西部呼包鄂地区湖泊中富油
的藻种进行了大量的筛选工作 ,对其中一株长势
较好含油相对较高的斜生栅藻的生长条件进行了
初步研究。结果表明:最适合斜生栅藻生长的接
种量为 20%;培养基的初始 pH值为 6.5;N、P、
Fe、Mg4种营养盐的水平是:NaNO3的质量浓度
为 0.5g/L, K2HPO4· 3H2O的质量浓度为 0.1g/
L, FeCl3· 6H2O的质量浓度为 0.008 g/L, MgSO4
· 7H2O的质量浓度为 0.10 g/L。
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