全 文 ：Ｊ．ＳＨＡＮＸＩ　ＡＧＲＩＣ．ＵＮＩＶ．（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
学报（自然科学版）２０１４，３４（２） ００３１１０
收稿日期：２０１３－１２－１２　　　修回日期：２０１４－０１－１７
作者简介：姚众（１９９０－），女（汉），山西运城人，硕士，研究方向：农药毒理与生物农药。
通讯作者：韩巨才，教授，博士生导师。Ｔｅｌ：１３８３５４６３６１２；Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｎｄｈｊｃ＠１６３．ｃｏｍ
基金项目：山西省留学基金项目（２０１１－５２）；山西省科技攻关项目（２０１１０３１１０１３－１）；山西省农业技术推广示范行动（ＳＮＪＴＧＳＦＸＤ２０１３０４－３）
皂荚内生拮抗细菌的分离筛选及代谢产物分析
姚众，韩巨才，刘慧平，刘东，张宝俊
（山西农业大学 农学院，山西 太谷０３０８０１）
摘　要：为明确抗病细菌在皂荚体内的分布及其抑菌活性，采用组织分离法从皂荚树中分离筛选出１２株有拮抗效果
的内生细菌，并通过过滤灭菌处理和高温灭菌处理２种方法对其代谢产物进行分析，选出ＺＪ４、ＺＪ７两株潜在生防菌，并
对其抗菌谱进行了测定。结果显示，ＺＪ４、ＺＪ７经高温灭菌处理后抑菌活性明显下降，推测其可能代谢产生对热敏感的蛋
白酶类，而且对不同病原菌的抑制作用表现出一定的选择性，对链格孢属的番茄早疫病菌和梨黑斑病菌效果较好。
关键词：皂荚；内生菌；抑菌作用
中图分类号：Ｑ９３－３３；Ｓ４７６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１６７１－８１５１（２０１４）０２－０１１４－０３
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｆｒｏｍ
Ｇｌｅｄｉｔｓｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　Ｌａｍ
Ｙａｏ　Ｚｈｏｎｇ，Ｈａｎ　Ｊｕｃａｉ，Ｌｉｕ　Ｈｕｉｐｉｎｇ，Ｌｉｕ　Ｄｏｎｇ，Ｚｈａｎｇ　Ｂａｏｊｕｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｈａｎｘｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ　Ｓｈａｎｘｉ　０３０８０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｒｏｍＧｌｅｄｉｔ－
ｓｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　Ｌａｍ，１２ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｉｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ
ｂｙ　ａｕｔｏｃｌａｖｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．ＺＪ４ａｎｄ　ＺＪ７ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｏｕｔ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｎｔｉ－ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｓｐｅｃｔｒｕｍｓ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＺＪ４ａｎｄ　ＺＪ７ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｕｔｏｃｌａｖｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｙ　ｍａｙ　ｍｅ－
ｔａｂｏｌｉｚｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｈｅａｔ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ａｎｄ　ｈａｄ　ｒｅ－
ｍａｒｋａｂｌｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｏｌａｎｉ　ａｎｄ　Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ａｌｔｅｒｎａｔａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｅｄｉｔｓｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　Ｌａｍ；Ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ；Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
　　植物内生细菌是指在其生活史的一定阶段或
全部阶段生活于健康植物根、茎、叶等组织的细胞
间隙或细胞内的一类细菌，与宿主植物建立和谐联
合共生的关系，是植物微生态系统的重要组成部
分［１，２］。植物内生细菌中广泛分布着抗菌活性菌
株，亦可产生具有生物活性的次生代谢产物。迄今
为止，有关植物内生细菌抑制病原菌的研究已积累
了大量资料，在防治真菌性病害、细菌性病害和线
虫病害等方面发挥了巨大作用。Ｒａｕｙｅ　Ｓｈｗａｒａｎ
等［３］从鹰嘴豆、向日葵、辣椒植物茎内分离筛选到
１０株对镰刀菌、菌核菌、丝核菌有明显抑制作用的
内生细菌；崔林等［４］从马铃薯组织内分离到５５株
对密执安棒形杆菌环腐亚种有拮抗作用的内生细
菌；李进荣等［５］从大豆根瘤内分离出４株内生细菌
对大豆胞囊线虫孵化有强烈的抑制作用。由于生
物农药良好的应用前景及化学农药的过度使用存
在环境污染、３Ｒ（Ｒｅｓｉｄｕｅ、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、Ｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅ）
问题等，近年来从植物中分离筛选具有生防作用的
内生细菌以已成为国内外研究的热点。
皂荚（Ｇｌｅｄｉｔｓｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　Ｌａｍ）是中国特有的
苏木科皂荚属树种之一，是食品、化妆品、洗涤用品
等的天然原料，亦是一种中药材，有祛痰止咳、开窍
通闭、抗菌杀虫等药理作用［６］。目前尚未见对皂荚
内生细菌有详细的研究报道。本研究对皂荚内生
细菌进行了分离筛选，并对其代谢产物进行了分析
研究，旨在筛选出能产生抑菌活性物质的内生菌，
为皂荚的综合开发利用及寻找新的抗菌药物资源
奠定基础。
DOI:10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2014.02.001
１　材料和方法
１．１　供试材料
１．１．１　植物组织
供试的植物组织均采自山西农业大学健康皂
荚树的枝、叶等不同部位。
１．１．２　供试培养基
ＰＤＡ培养基、ＬＢ培养基、ＮＡ培养基。
１．１．３　拮抗指示菌
梨黑斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ａｌｔｅｒｎａｔａ）、番茄早疫病
菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｏｌａｎｉ）、辣椒枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘ－
ｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃａｐｓｉｃｕｍ）、番茄灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉ－
ｎｅｒｅａ）、西瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．
ｎｉｖｅｕｍ）、棉花立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ），均由山
西农业大学农药学实验室提供。
１．２　试验方法
１．２．１　内生菌的分离纯化
将新鲜无病虫害的植物组织用清水冲洗干净
后进行表面消毒处理［７，８］：７５％的酒精浸泡３～５
ｍｉｎ，无菌水冲洗３次，再在３％的次氯酸钠中浸泡
３～５ｍｉｎ，用无菌水冲洗５次。取最后一次冲洗的
无菌水２００μＬ涂布于平板培养基上做对照。将叶
片用灭菌的解剖刀切成０．５ｃｍ ×０．５ｃｍ大小，茎
部样品裁剪为０．５ｃｍ左右的小段，用灭菌刀片纵
向剖开，紧贴于 ＮＡ培养基上于２７℃恒温培养箱
中培养。待材料周围长出菌落后，采用划线法分
离、纯化，根据菌落形态、颜色等分类保存。
１．２．２　拮抗菌株的筛选
采用平板对峙法［９］：在ＰＤＡ平板中央接入直
径５ｍｍ的病原菌菌块，距离菌块２ｃｍ处的２个
点对称接种细菌菌体，以不接细菌作为对照，２５℃
恒温避光培养５ｄ，观察病原菌菌落生长状况，测定
菌落直径，分析细菌菌体对病原菌的抑制率。
１．２．３　拮抗菌株代谢产物分析
将分离到的内生细菌接种于 ＬＢ培养液中，
２８℃、１６０ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养７２ｈ，得到拮抗菌株
发酵液。８０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ去除菌体，上
清液分２种方式进行处理［１０］。方法１：０．４５μｍ微
孔滤膜过滤灭菌；方法２：１２１℃高压湿热灭菌３０
ｍｉｎ。采用生长速率法测定各菌株的发酵液活性：
将各处理发酵液按１∶９的比例与ＰＤＡ培养基混
合，制备平板，并在平板中央接入直径为５ｍｍ的
新鲜病菌菌块，５ｄ后测定菌落直径，计算抑菌率。
以ＬＢ培养液为对照，每处理３次重复。
１．２．４　抗菌谱分析
用生长速率法对最终筛选的２个拮抗菌株
ＺＪ４和ＺＪ７代谢产物进行抑菌广谱性测定。发酵
液经滤膜过滤灭菌。
２　结果与分析
２．１　内生拮抗细菌的筛选
　　从所有分离获得的细菌中筛选、纯化得到２６
个菌株。以梨黑斑病菌和灰霉病菌为指示菌，用平
板对峙培养法筛选出１２株抑制率均高于６０％的
菌株为拮抗菌株，分别编号为ＺＪ１～ＺＪ１２，其抑菌
活性见表１。分离的１２株内生细菌其菌体对梨黑
斑病菌抑菌率最高的为ＺＪ４，抑制率达７４．３％，其
次为ＺＪ９，抑制率为６７．６％；其菌体对番茄灰霉病
菌抑菌率最高的为ＺＪ７，抑制率达７４．６％，其次为
ＺＪ４，抑制率为７１．４％。
表１　１２个菌株对梨黑斑病菌和番茄灰霉病菌的拮抗作用
Ｔａｂｌｅ　１　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｏｆ　１２ｓｔｒａｉｎｓ　ｔｏ　Ａ．ａｌｔｅｒｎａｔａａｎｄ　Ｂ．
ｃｉｎｅｒｅａ
菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ
对梨黑斑病菌抑制率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｇａｉｎｓｔ
Ａ．ａｌｔｅｒｎａｔａ／％
对番茄灰霉病菌抑制率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｇａｉｎｓｔ
Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ／％
ＺＪ１　 ６７．５　 ６５．５
ＺＪ２　 ６２．４　 ６６．７
ＺＪ３　 ６３．３　 ６３．９
ＺＪ４　 ７４．３　 ７１．４
ＺＪ５　 ６４．６　 ６３．９
ＺＪ６　 ６４．６　 ６５．５
ＺＪ７　 ６７．５　 ７４．６
ＺＪ８　 ６２．４　 ６０．３
ＺＪ９　 ６７．６　 ６６．７
ＺＪ１０　 ６７．５　 ６８．３
ＺＪ１１　 ６５．８　 ６３．９
ＺＪ１２　 ６６．３　 ６３．９
２．２　拮抗菌株代谢产物分析
代谢产物对梨黑斑病菌抑菌活性见表２，１２
个菌株的次生代谢物质对梨黑斑病菌的抑制作用
差异较大，ＺＪ７菌株的无菌发酵液抑菌效果最佳，
对梨黑斑病菌的抑制率达８２．１５％，其次是ＺＪ４，抑
制率为８０．２６％，表明这２个菌株的次生代谢物中
含有大量的抗菌物质。发酵液经高温灭菌处理后
ＺＪ４、ＺＪ７的抑菌活性明显下降，推测该菌株可能代
谢产生对热敏感的蛋白类物质；而ＺＪ１、ＺＪ２、ＺＪ５等
菌株经高温处理后的抑菌活性无明显丧失，表明其
抗菌物质对热不敏感，推测其抗菌物质可能为抗生
５１１３４（２） 姚众等：皂荚内生拮抗细菌的分离筛选及代谢产物分析
素类或多肽类物质。ＺＪ４、ＺＪ７菌株活性高，可作为
潜在生防菌进行后续研究。
表２　１２个菌株代谢产物对梨黑斑病菌的拮抗作用
Ｔａｂｌｅ　２　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ　１２ｓｔｒａｉｎｓ　ａ－
ｇａｉｎｓｔ　Ａ．ａｌｔｅｒｎａｔａ
菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ
过滤处理抑菌率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｆｉｌｔｅｒｅｄ
ｂｙ　０．４５μｍ　ｆｉｌｔｅｒ／％
高温处理抑菌率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ
ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ａｕｔｏｃｌａｖｉｎｇ／％
ＺＪ１　 ４４．２９　 ４１．５８
ＺＪ２　 ５０．０２　 ４８．０５
ＺＪ３　 ６２．３３　 １７．４
ＺＪ４　 ８０．２６　 ４．０８
ＺＪ５　 ７５．８５　 ６８．０５
ＺＪ６　 ５５．３６　 ４０．２５
ＺＪ７　 ８２．１５　 ７．６１
ＺＪ８　 ５９．２１　 ４０．２５
ＺＪ９　 ４５．５８　 １４．２９
ＺＪ１０　 ５９．１８　 ４０．１４
ＺＪ１１　 ７２．５１　 ５０．６３
ＺＪ１２　 ５６．４６　 １２．９３
２．３　ＺＪ４和ＺＪ７代谢产物抗菌谱分析
ＺＪ４和ＺＪ７菌株的抗菌谱测定结果见表３。２
菌株对番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、梨黑斑病菌、
棉花立枯病菌、辣椒枯萎病菌５种植物病原菌具有
不同程度的拮抗作用，ＺＪ４菌株对梨黑斑病菌的抑
制率最高，为８３．９９％，ＺＪ７菌株对番茄早疫病菌的
抑制率最高，为８２．５８％，２菌株对西瓜枯萎病菌均
没有抑制作用。２菌株对不同病原菌的抑制作用
表现出一定的选择性，对链格孢属的番茄早疫病菌
和梨黑斑病菌效果较好。
３　结论与讨论
试验结果表明，皂荚内生细菌中广泛分布着抑
表３　ＺＪ４和ＺＪ７发酵液对６种植物病原菌的抑制率
Ｔａｂｌｅ　３　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ＺＪ４ａｎｄ
ＺＪ７ｏｎ　ｓｉｘ　ｐｌａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ／％
植物病原菌
Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
ＺＪ４菌株
Ｓｔｒａｉｎ　ＺＪ４
ＺＪ７菌株
Ｓｔｒａｉｎ　ＺＪ７
番茄早疫病菌Ａ．ｓｏｌａｎｉ　 ７９．０５　 ８２．５８
番茄灰霉病菌Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ　 ７６．６２　 ７２．５６
梨黑斑病菌Ａ．ａｌｔｅｒｎａｔａ　 ８３．９９　 ８０．６３
棉花立枯病菌Ｒ．ｓｏｌａｎｉ　 ３４．０４　 ４３．１９
辣椒枯萎病菌
Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃａｐｓｉｃｕｍ
３７．００　 ４８．２５
西瓜枯萎病菌
Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｎｉｖｅｕｍ
－ －
　　注：“－”代表无抑菌作用。
Ｎｏｔｅ：－ｄｅｎｏｔｅ　ｎｏｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．
菌活性菌株（占分离菌株总数的５０％左右），其代
谢产物对病原菌的抑制作用差异较大，表明其代谢
可能产生蛋白类、抗生素类或多肽类等多种抗菌物
质。筛选出的潜在生防菌ＺＪ４、ＺＪ７经高温灭菌处
理后抑菌活性明显下降，推测其可能代谢产生对热
敏感的蛋白酶类，而且其对不同病原菌的抑制作用
表现出一定的选择性，因此下一步将对抗菌物质特
别是抗菌蛋白进行分离纯化，进一步研究抗菌机
理，探索其在农作物病虫害防治中的应用途径。
内生菌生活于植物的根、茎、叶等组织器官中，
一旦从寄主植物中分离出来后，由于生存环境的变
化，某些特性可能会改变，菌种也容易出现退化、变
异等现象［１１］。因此，对初步筛选出来的菌株还需
进一步测定其生物学及生理生化特性，以确定其最
适的培养和保存条件。
参　考　文　献
［１］林玲，乔勇升，顾本康，等．植物内生细菌及其生物防治植物病害的研究进展［Ｊ］．江苏农业学报，２００８，２４（６）：９６９－９７４．
［２］韩继刚，宋未．植物内生细菌研究进展及其应用潜力［Ｊ］．自然科学进展，２００４，１４（４）：１６－２１．
［３］Ｒａｎｇｅ　ｓｈｗａｒａｎ　Ｒ，ＷａｓｎｉｋａｒＡ　Ｒ，ＰｒａｓａｄＲ　Ｄ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｏｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｗｉｌｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ－
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，２００２，１６（２）：１２５－１３３．
［４］崔林，孙振，袁军，等．马铃薯内生细菌的分离及环腐病拮抗菌的筛选鉴定［Ｊ］．植物病理学报，２００３，３３（４）：３５３－３５８．
［５］李进荣，段玉玺，陈立杰，等．大豆根瘤内生细菌对大豆胞囊线虫影响研究［Ｊ］．大豆科学，２００５，２４（２）：１５４－１５６．
［６］梁静谊．皂荚荚果化学组成及皂甙提取工艺的研究［Ｄ］．南京：南京林业大学，２００４．
［７］张玉洁，李洪超．三七内生菌分离及抗根腐病病原真菌筛选［Ｊ］．北方园艺，２０１１（２３）：１３０－１３２．
［８］冀玉良，李丹青，李堆淑，等．连翘内生菌的分离及对植物病原菌的抑菌活性测定［Ｊ］．西南农业学报，２０１１，２４（６）：２２５８－２２６２．
［９］何建清，张格杰，陈芝兰，等．大花黄牡丹内生菌的分离鉴定及其抗菌活性菌株的筛选［Ｊ］．西北植物学报，２０１１，３１（１２）：２５３９－２５４４．
［１０］王慧利．抗真菌活性水稻内生菌的筛选及美达霉素生物合成中糖基化机制研究［Ｄ］．武汉：华中师范大学生命科学学院，２０１０．
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６１１ 山 西 农 业 大 学 学 报（自然科学版） ２０１４