全 文 ：西北林学院学报 2008 , 23(3):127～ 129
Journa l of No rthwe st Fore st ry Univ ersity
天女木兰组织培养中有效获得无菌外植体的研究
＊徐　石 , 　陆秀君 , 　李天来
(沈阳农业大学 林学院 ,辽宁 ,沈阳 , 110161)
摘　要:为探讨天女木兰组织培养中无菌外植体的有效获得 ,将天女木兰外植体分为种子和其他 3
种(侧芽 、带侧芽的茎段 、顶芽)外植体进行研究。天女木兰种子分为 3种不同类型消毒 , 进行材料
污染率 、萌发率及成苗率的统计。其他 3种外植体(侧芽 、带侧芽的茎段 、顶芽)采用 L9(34)正交设
计 ,统计无菌率 。结果表明:天女木兰种子消毒时间为 4 min 的 Ⅲ型试材为最适外植体 ,成苗率可
达 70%。采用正交设计的 3 种外植体的最优水平组合为 A 1B2C3 ,即外植体为侧芽 ,消毒剂为
0.1% HgCl2 ,消毒时间为 12 min 。
关键词:天女木兰;外植体;正交设计
中图分类号:S685.790.353　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-7461(2008)03-0127-03
Studies on Tissue Culture of Magnolia sieboldii to Get Bacteria-free Explant s
XU Shi , 　LU Xiu-jun , 　LI Tian-lai
(Forest r y Department , Shenyang A gr icu ltura l Un iver sity , Sh enyang , Liaonin g 110161 , China)
Abstract:T o get nonto xic explant f rom Magnol ia sieboldi i tissue culture ef fect ly , the explant of M.siebol-
d ii was divided into seed and othe r three explants like sprout , stem of sprout and terminal bud for researc-
hing deeply.The a rticle takes 3 kinds o f sterilizhing to M.siebold ii to statistics the contamination rate ,
germination rate and seedling ra te.Othe r explants(sprout , stem of sprout and terminal bud)used L 9(34)
orthogonal design to mearsure pathogen-f ree rate.The results show ed that the best e xplant w as Ⅲ seed of
M.sieboldi i , it s ste rilizhing times w as 4 min and seedling rate w as high to 70%.The best compose in 3
types of explant using o rthogonal design w as A1 B2C3 :explant w as sprout , disinfectant was 0.1%HgCl2 ,
steri li zhing times w as 12 min.
Key words:Magnol ia sieboldi i;explant;or thogonal design
　　天女木兰(Magnolia siebold ii)为木兰科木兰
属落叶小乔木 ,是木兰科树种中最抗寒的品种 。其
数量稀少 ,仅分布在辽宁长白和黄山一带 ,为国家三
类保护植物[ 1-2] 。天女木兰育苗栽培技术十分复杂 ,
繁殖难度很大 , 目前多用种子繁殖或者扦插繁
殖[ 3-6] ,而对于天女木兰的组织培养技术报道很少 。
组织培养是建立在无菌操作基础之上的专门技术 ,
因此 ,在进行植物组织培养时 ,必须选择合适的外植
体并进行有效的灭菌和接种 ,才能确保组织培养工
作的顺利进行[ 7-8] 。本文以天女木兰为研究对象 ,探
索获得组织培养中有效无菌材料的途径和方法 ,为
进一步研究和生产提供借鉴 。
1　材料与方法
1.1　材 料
材料为沈阳农业大学植物园内天女木兰当年生
种子和当年新生枝条。
1.2　培养基
培养基为 B5 +蔗糖 30 g · L-1 +琼脂 10 g ·
L-1 ,pH5.8 。121℃下灭菌 20 min。
＊　收稿日期:2007-10-23　修回日期:2008-03-18
　基金项目:沈阳农业大学博士后基金项目(777-230409)　作者简介:徐石(1983-),女 ,辽宁本溪人 ,硕士研究生 ,从事苗木培育研究。
1.3　外植体处理
1.3.1　种子处理　将天女木兰种子分为 3种不同
类型:Ⅰ 带外种皮的天女木兰种子;Ⅱ 带中种皮的
天女木兰种子;Ⅲ 带内种皮的天女木兰种子。每种
天女木兰的种子均用自来水冲洗 10 min 后在无菌
室里 ,分别放在已经灭菌的锥形瓶中 ,用 70%酒精
浸泡 30 s ,再用 0.1%升汞消毒 ,每组进行 6个消毒
时间处理 ,即 0 、2 、4 、6 、8 、10 min ,消毒后立即用无
菌水冲洗4 ～ 5次 ,在超净台上将天女木兰幼胚从种
子中剥离出来 ,并及时接种 。
1.3.2　枝条处理　剪取天女木兰当年新生枝条 ,流
水冲洗 2 h 后 ,分别取侧芽 、带侧芽的茎段和顶芽
(0.5 ～ 0.8 cm), 采用 L9(34)正交设计 ,各因素水平
设计如下所示:
A:外植体: A1侧芽 A 2带侧芽的茎段 A 3顶芽
B:消毒剂: B1 2%NaClO B2 0.1%HgCl2 B3 2%Ca(ClO)2
C:消毒时间: C1 4 min C2 8 min C3 12 min
1.4　接种培养
每瓶接种 1个外植体 ,每种处理接种 40瓶 ,按
标记顺序放在培养室培养 , 培养温度(25 ±1)℃,
光照强度 3000 lx ,光照时间 14 h · d-1 。每 5 d 观
察 1次 ,并记录结果 ,直到结果不再有变化为止 ,试
验重复 2次。
1.5　结果统计方法
种子为外植体时 ,统计外植体污染率 、萌发率 、
成苗率 。结果统计按肖显华等[ 9] 的方法 ,并做改动 。
污染率%=(污染外植体数/接种外植体总数)×
100%;萌发率%=(未污染且萌动个数/接种外植
体总数)×100%;成苗率%=(成苗个数/接种外植
体总数)×100%。其他 3 种外植体采用 L9(34)正
交设计的方法统计无菌率 。无菌率%=(没有污染
的外植体数/接种外植体总数)×100%。
2　结果与分析
2.1　天女木兰种子为外植体的培养
　　由表 1看出 ,用 0.1%升汞消毒 Ⅰ(带外种皮的
天女木兰种子)剥胚培养时 ,其中 ,消毒 8 min时的
污染率最低为 10%, 萌发率 、成苗率最高 ,分别为
90%和 45%。不经过升汞消毒处理的 Ⅰ全部污染。
用 0.1%升汞消毒Ⅱ(带中种皮的天女木兰种子)剥
胚培养时 ,消毒 10 min时污染率最少 ,萌发率和成
苗率分别达到 65%和 30%。从污染率 、萌发率 、成
苗率 3个方面综合分析 ,消毒 6 m in时的污染率 、萌
发率和成苗率分别为 20%、65%、30%,在一定程度
上优于 10 min 的消毒处理 。不经过升汞消毒处理
的 Ⅱ全部污染。 Ⅰ 、Ⅱ在各个时间段均有不同数量
的污染现象 。随着消毒时间的延长 ,污染率逐渐
降低。
表 1　天女木兰种子不同类型剥胚培养的萌发及成苗情况
T ab le 1　Resul t of embryo cultures af ter dif feren t types of M.sieboldi i seed s being steri li zed direct ly
消毒时间
/min
污染率/ % 萌发率/ % 成苗率/ %
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ
0 100 100 90 - - 10 - - 5
2 30 25 0 50 50 80 20 10 40
4 25 20 0 55 55 100 25 20 70
6 20 20 0 80 65 90 30 30 50
8 10 15 0 90 75 75 45 20 40
10 10 10 0 70 65 60 25 10 30
　　用 0.1%升汞消毒 Ⅲ(带内种皮的天女木兰种
子)剥胚培养时 ,污染率均可降至 0 ,处理时间在 4
min时 , 萌发率和成苗率达到最高水平 , 分别为
100%和 70%。不经过升汞消毒处理的 Ⅲ污染率很
高 ,达到 90%,萌发率和成苗率分别为 10%和 5%。
随着消毒时间的增加 ,各种类型的外植体污染
率均下降 ,而萌发率和成苗率均呈先升后降的趋势 。
主要原因是消毒时间过长 ,消毒剂渗入幼胚 ,造成对
幼胚的毒害而不易萌发和成苗 。
由表 2得出 ,天女木兰幼胚离体培养中最好的
消毒方式是将带内种皮的天女木兰种子用 0.1%升
汞消毒 4 min ,或消毒 6 min效果也较好。其他均不
太理想 , Ⅱ型的试材在最优排列中未曾出现。 Ⅰ型 、
Ⅱ型的试材均有一定的污染 ,而且萌发率和成苗率
都不高 。主要是因为天女木兰种皮坚硬 ,消毒不易
彻底 ,加上必须在培养皿内剥去种皮才可以剥离出
幼胚 ,增加了剥胚难度并使操作时间加长 ,从而使污
染率增高。
128 西北林学院学报 23 卷　
表 2　不同外植体在不同消毒时间下的最优排列
Table 2　The best perm utat ion in di fferent
disinfection t ime w ith dif feren t ex plants
外植体类型 消毒时间/min
污染率
/ %
萌发率
/ %
成苗率
/ %
Ⅲ 4 0 100 70
Ⅲ 6 0 90 50
Ⅲ 8 0 75 40
Ⅲ 2 0 80 40
Ⅰ 8 10 90 45
2.2　其他 3种外植体正交设计结果与分析
由表 3可以看出 , 3个因素的各个水平最佳组
合为 A 1 B2C3 或 A 2 B2C3 , 也就是说 , A 因素(外植
体)以 A 1 或 A2 为最佳 ,即侧芽或带侧芽的茎段;B
因素(消毒剂)以 B2 为最佳 ,即 0.1% HgC l2 ;C 因
素(消毒时间)以 C3 为最佳 ,即 12 min 。
表 3　正交设计 L 9(34)试验结果
Table 3　 T he result s of orthogonal design L9(34)
试验号 外植体 消毒剂 消毒时间/min 无菌率/ %
(1) 1 1 1 30
(2) 1 2 2 60
(3) 1 3 3 0
(4) 2 1 2 0
(5) 2 2 3 80
(6) 2 3 1 10
(7) 3 1 3 10
(8) 3 2 1 40
(9) 3 3 2 10
T1 90 40 80
T2 90 180 70 T总=240
T3 60 20 90
X 1 30 13.3 26.7
X 2 30 60.0 23.3
X 3 20 6.7 30.0
R 10 53.3 6.7
R值越大 ,因素对试验结果的影响越显著 。因
为 RB >RA >RC ,则试验中的各个因素中 B 因素为
试验主导因素 ,即消毒剂对天女木兰组织培养的增
殖有显著的影响 ,各因素影响效果的主次关系是:消
毒剂>外植体>消毒时间 。
对正交表进行方差分析(表 4), 3个因素中 ,对
天女木兰组织培养的增殖情况影响从大到小依次
为:消毒剂>外植体>消毒时间 。实验所安排的 3
个因素对无菌率的影响无显著性差异。
通过试验 ,在天女木兰组织培养的无菌体系的
建立中 ,最佳的外植体为侧芽或者带侧芽的茎段 ,消
毒剂为 0.1% HgCl2 ,消毒时间为 12 min 。但由于
带侧芽的茎段在培养过程中褐化严重 ,所以宜选择
侧芽为外植体。
表 4　L9(34)试验结果的方差分析
Table 4　Variance analysis of orthogonal tes t L9(34)
变异来源 自由度 离差平方和 均方 均方比 F
A 2 200 100 0.2 F(0.05)=19.0
B 2 5 066.7 2 533.4 4.8 F(0.01)=99.0
C 2 66.7 33.4 0.06
误差 2 1066.6 533.3
总变异 8
3　讨 论
在植物组织培养中 ,外植体接种是组培的前提条
件。外植体的接种成功与否 ,主要取决于外植体的选
取和消毒时间 。天女木兰种子用 0.1%升汞消毒处
理实验发现 ,所选取的外植体不同 ,适宜的消毒时间
也不同 ,当消毒时间超过一定程度时就会出现材料致
死而变黑现象 ,导致萌发率和成苗率逐渐降低 。
天女木兰的外植体容易发生褐化[ 10] ,在本试验
中发现 , 当用植物组织培养中常用的次氯酸钠 、次
氯酸钙等以产生氯气灭菌的表面消毒剂时 , 天女木
兰的带侧芽的茎段外植体极易褐化 , 顶芽褐化较
轻 ,侧芽褐化最轻 。因此 , 在天女木兰组培中 , 应
当首选侧芽为外植体建立无性系 。采用带侧芽的茎
段为外植体(如生产脱毒苗)时 , 则宜用 0.1%
HgC l2 作为消毒剂 。
在本试验中 , 有效获得了天女木兰幼胚和侧芽
的大量无菌外植体 , 已经用于诱导其脱分化和再分
化 , 为天女木兰这一濒危植物无性系建立及基因转
化奠定了基础。
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