全 文 ：收稿日期： 2014-05-09。
基金项目： 广东省中国科学院全面战略合作项目（2011A090100040）；国家海洋局海洋公益性行业专业项目（201105008-9）。
作者简介： 唐鸿倩（1978-），女，四川隆昌人，硕士，研究方向为水产科学。 E-mai:11hqtang@stu.edu.cn
通讯作者： 杜 虹（1976-），女，广东汕头人，博士，教授，硕士生导师，研究方向为水产科学。 E-mail：hdu@stu.edu.cn
琼胶降解菌的筛选及其在龙须菜
乙醇发酵中的初步应用
唐鸿倩， 钟名其， 陈 洋， 杜 虹
（汕头大学 理学院， 广东 汕头 515063）
摘 要： 文章以龙须菜为原料，开展发酵产乙醇的基础研究，主要进行了高效琼胶降解菌的筛选和酶解条件
的优化。 利用琼胶为唯一碳源筛选出 2 株琼胶降解能力强的菌株 QJ14 和 Hhjh，通过形态学观察和 16s rDNA
序列分析，对这两株菌株进行了鉴定，经 NCBI 数据库比对，确定 QJ14 为假单胞菌属，Hhjh 为白色噬琼胶菌
属。 用 QJ14 和 Hhjh 产生的粗酶液酶解龙须菜酸解糊化液，并对影响酶解效果的因素，如起始 pH 值、酶解时
间、震荡处理、混合酶液比例等进行了优化，结果还原糖产量最高可达 29.33 mg/g。 通过比较酵母单菌发酵、混
合菌发酵与分步酶解发酵，利用顶空气相色谱法（HS-GC 法）检测发酵液中乙醇产量，结果表明，酵母单菌发酵
和混合菌发酵几乎没有乙醇产生，分步酶解发酵的乙醇产量约为 2.36mL/L。
关键词： 筛选； 16s rDNA； 龙须菜； 发酵； 乙醇
中图分类号： TK6； TQ546 文献标志码： A 文章编号： 1671-5292（2015）05-0789-06
可再生能源
Renewable Energy Resources
第 33 卷 第 5 期
2015 年 5 月
Vol.33 No.5
May 2015
0 前言
随着石化能源的日益枯竭， 以及石化能源使
用过程中引起的环境污染日益严重， 世界各国都
在寻找开发可再生清洁能源。 生物乙醇作为可再
生清洁能源，是石油的最好替代物之一。 目前，生
物乙醇主要由甘蔗、玉米、红薯等粮食作物生产，
虽然技术路线成熟，但存在与人争粮，与粮争地的
问题，长期发展会导致粮食危机，因此，海藻乙醇
引起科研人员越来越高的关注[1]。 目前，我国的海
藻乙醇研究主要以海带等褐藻为原料 [2]，以龙须
菜为原料的研究鲜见报道。 龙须菜是我国海水养
殖的重要品种，属于红藻门，杉藻目，江篱属，主要
用于生产琼胶，作为鲍鱼养殖饲料，民间多用于入
药 [3]。 龙须菜在我国东南沿海广泛养殖，产量巨
大，是优良的生物质来源 [4]。 龙须菜生长迅速，体
内含有的大量琼胶多糖和少量纤维素， 理论上均
能被发酵微生物发酵生产生物乙醇。
海藻制取生物乙醇的一般工艺包括海藻的收
集、清洗、粉碎、酸水解、酶水解、发酵、蒸馏回收等
步骤。该流程中，生物乙醇的转化有两个非常重要
的步骤即水解 （海藻中多糖通过酸或酶水解成还
原糖）和发酵（还原糖被微生物发酵成乙醇）。 其
中，水解是关键，若海藻中多糖不先降解成简单的
可发酵糖类，则无法实现乙醇的后续发酵。稀酸水
解是获得简单可发酵糖的常用手段， 但存在腐蚀
设备，污染环境等问题。获得高效的海藻多糖水解
酶是提高海藻多糖水解效率的瓶颈， 也是各国科
研工作者研究的热点。 人们已经从海洋中分离到
了多种琼胶分解菌，包括 Pseudomonas（假单胞菌
属）、Microscilla.Vibrio（弧菌属）、Streptomyces（链
霉菌属 ）、Cytophaga （噬细胞菌属 ）、Pseudoal-
teromonsa（假别单胞菌属）、Alteromonas（别单胞菌
属）等[5]。 不同琼胶分解菌能产生不同种类的琼胶
酶， 作用于 α-1，3 糖苷键的 α-琼胶酶能将琼胶
分解生成琼四糖、琼二糖等寡糖单位，作用于 β-
1，4 糖苷键的 β-琼胶酶能将琼胶分解生成新琼
四糖、新琼二糖等寡糖单位[6]。
实验通过筛选高效降解琼胶的琼胶降解菌，
将获得的琼胶酶粗酶液用于龙须菜酸解糊化液的
酶解糖化，尝试以更加温和、环保的方法从龙须菜
发酵液中获得生物乙醇。 通过对龙须菜酸解糊化
液进行酵母单菌发酵， 混合菌发酵与分步酶解发
·789·
DOI:10.13941/j.cnki.21-1469/tk.2015.05.024
酵比较， 为龙须菜作为海藻产能原料的可行性提
供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
筛菌样品采自汕头市南澳岛海水、浅滩泥沙、
龙须菜、 鲍鱼养殖场龙须菜池水、 鲍鱼鱼苗池水
等。
龙须菜材料用清水洗净，55 ℃烘干， 粉碎机
粉碎后过 40目筛，制备的龙须菜干粉储存于棕色
瓶备用。
细菌 16S rDNA 通用引物由华大基因合成：
27F（5，-CAG CGG TAC CAG AGT TTG ATC CTG
GCT CAG-3，）和 1492R （5，-CTC TCT GCA GTA
CGG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3，）。
总 DNA 提取试剂盒使用 TaKaRa 公司的 U-
niversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，PCR
试剂为 TaKaRa 公司的 Premix Taq Version 2.0
（Loading dye mix）。
菌株酿酒酵母购于中国微生物菌种保藏管理
委员会普通微生物中心， 采用的培养基主要有
2216E 培养基：蛋白胨 0.5%，酵母膏 0.1%，CaCl2
0.2%，MgCl2 0.1%，（NH4）2SO4 0.2%，陈海水，琼脂
0.2%；YPD 培养基：葡萄糖 2％，蛋白胨 1％，酵母
膏 0.5%，琼脂 2%。
1.2 实验方法
1.2.1菌株筛选
将样品处理后涂布于以琼胶为唯一碳源
2216E 培养基，26℃恒温培养 72 h 后， 挑取有明
显透明圈的菌落， 用卢戈氏碘液染色观察， 选取
16 株透明圈大的菌株， 分别编号为 QJ1~QJ14，
Hhjh，Hhjb，将其中 6株透明圈较大的菌株接种到
2216E液体培养基，摇瓶培养 24 h后，用 DNS 法[7]
检测酶活并根据酶活大小确定目标菌株，以 40℃
条件下，1 mL琼胶酶粗酶液每分钟产生 l μg 还原
糖作为一个酶活力单位。
1.2.2 16s rDNA鉴定
菌株总 DNA 提取和 PCR 的具体方法按
TaKaRa公司的相应试剂盒说明。 PCR引物 27F和
1492R 由华大基因合成，反应体系为 25 μL，反应
条件参考 Hu Z.[8]。 将 PCR 得到的 DNA 片段 4 ℃
过夜连接 pUCm-T 载体，酶连产物转化大肠杆菌
感受态细胞， 挑取经验证的阳性克隆子送华大基
因测序。 将测序结果用 BLAST 软件与 NCBI中已
经发表的 16s rDNA 进行同源性比对 ， 并利用
CLUSTALX 和 MEGA5.1 软 件 制 作 遗 传 进 化
树[9]，[10]。
1.2.3菌株 QJ14和 Hhjh琼胶酶活力曲线的测定
以 1%的接种量将菌株 QJ14 和 Hhjh 接种于
发酵培养基中， 在 26℃，150 r/min条件下摇瓶培
养，每隔 12 h 取样，培养液在 4 ℃条件下，6 000
r/min 离心 10 min，取上清液用 0.22 um 滤膜过滤
除菌，滤液即为粗酶液。 用 DNS 法测定粗酶液中
琼胶酶活力， 根据测定结果制作菌株发酵产酶曲
线。
1.2.4龙须菜酸预处理
将 10 g龙须菜干粉， 加入 0.01 mol/L 稀盐酸
200 mL，于 121 ℃条件下，酸解 10 min。 酸解完成
后调 pH值为 6.5，制成半凝固的龙须菜泥浆备用。
1.2.5 龙 须 菜 酸 解 糊 化 液 酶 解 条 件 优 化
将 QJ14 培养 24 h，Hhjh 培养 48 h 的培养液
于 4 ℃条件下，6 000 r/min 离心 10 min，取上清液
用 0.22 um 滤膜过滤除菌制得粗酶液， 与龙须菜
酸解糊化液等量混合，酶解 24 h 后，检测不同起
始 pH 值、酶解时间、震荡条件、混合酶液比例等
不同酶解条件下酶解液中的还原糖含量。 每次试
验设 3 组平行样， 结果取平均值。 所有数据用
SPSS 统计软件进行显著性分析 （SPSS PASW
Statistics 18）。
1.2.6 琼胶酶粗酶液在龙须菜乙醇发酵中的作用
按表 1 所示设计不同的乙醇发酵组合，在 30
℃，150 r/min 条件下恒温摇床培养 6 d 后，发酵液
6 000 r/min，离心 15 min，取上清。
1.3 测检方法
半乳糖检测使用 DNS 法 [7]，乙醇检测使用顶
空气相色谱法（HS-GC 法）（Agilent 6890N，毛细
管柱：HP-INNOWAX，30.0 m×250 μm × 0.25 μm；
表 1 龙须菜乙醇发酵液组合
Table 1 Ethanol fermentation liquid of Gracilaria
lemaneiformis
实验组
1
2
3
4
发酵液组成
10 mL 酸解液+8 mL 菌液+2 mL 营养液
10 mL 酸解液+8 mL 菌液+2 mL 营养液
10 mL 酸解液+8 mL 粗酶液+2 mL 营养液
10 mL 酸解液+8 mL 去离子水+2 mL 营养液
酵母菌
1 mL
48 h 后，1 mL
48 h 后，1 mL
48 h 后，1 mL
注： 营养液为 4%蛋白胨，1%酵母膏，2%CaCl2，0.5%MgCl2，
陈海水。
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可再生能源 2015，33（5）
气流速度：载气（氮）流量为 25 mL/min，氢气流量
为 40 mL/min，空气流量为 450 mL/min；温度：检
测器 FID 温度为 280 ℃, 进样口温度为 200 ℃ ,
炉温为 120 ℃；分流进样，分流比为 20∶1；顶空进
样器：Agilent 7694E，顶空保持温度为 70 ℃，定量
环温度为 105 ℃，TR.LINE 温度为 110 ℃，顶空保
持时间为 15min）。
2 结果与讨论
2.1 菌株筛选
综合比较透明圈大小和产酶情况， 筛选得到
琼胶降解能力较强的菌株 QJ14 和 Hhjh， 革兰氏
染色均呈阴性， 与目前筛选到的绝大多数琼胶降
解菌相一致[11]。 如图 1 所示，菌株 QJ14 形成较大
的乳白色菌落，表面湿润光滑，在以琼胶为唯一碳
源的分离培养基平板上培养 2~3 d 后， 菌落周围
会凹陷，形成明显的透明圈。 菌株 Hhjh形成较小
的乳白色菌落，在划线培养 3 d 后，用卢戈氏碘液
染色，菌株周围能看到明显的降解圈。这是由于菌
落周围的琼胶被菌株分泌的胞外酶降解形成不能
被卢戈氏碘液染色的琼胶寡糖， 而没被降解的琼
胶可以被卢戈氏碘液染色。继续培养 Hhjh一周左
右，培养平板会出现液化现象。
2.2 16s rDNA鉴定结果
以细菌总 DNA 为模板，16s rDNA 通过引物
分别对菌株 QJ14 和 Hhjh 进行 PCR 扩增，均得到
长约 1.5 kb 的 PCR 扩增产物。 将测序结果用
BLAST软件在 NCBI 中进行同源性比对，将 NCBI
中同源性接近的菌株序列与菌株 QJ14，Hhjh 的
序列用 CLUSTALX 进行聚类分析，分析结果导入
MEGA5.1 软件生成遗传进化树。 结果表明，QJ14
与假单胞菌 [Pseudoalteromonas espejiana NCIMB
2127（T）]的相似度为 100%，暂将其命名为 Pseu-
doalteromonas sp. QJ14， 菌株 Hhjh与白色噬琼胶
菌 [Agarivorans albus MKT106 （T）] 的相似度为
99.9%，暂将其命名为 Agarivorans sp. Hhjh。
2.3 菌株产酶曲线
如图 2所示，在菌株培养初期，随着培养时间
的延长，菌株的酶活也在增大。 菌株 QJ14产生的
琼胶酶的酶活在 24~36 h 维持较高的水平， 在培
养 72 h 后， 培养液中的琼胶酶仍具有较高活性。
菌株 Hhjh 产生的琼胶酶的活性在 48~60 h 时，酶
活相差不大。 从节约成本，提高生产效率考虑，最
后将 24 h 作为 QJ14 的培养时间，48 h 做为 Hhjh
的培养时间。
2.4 龙须菜盐酸预处理
稀酸水解是海藻乙醇生产过程中常用到的底
物预处理方法，酸能作用于琼胶分子的 α-1,3 键，
生成琼二糖、四糖等寡糖单位，使琼胶液化。 随着
稀酸浓度的增加，琼胶的酸解效率随之升高，酸解
液中还原糖含量也随之升高[12]。 本实验采用 0.01
mol/L 的稀盐酸，在 121℃条件下，酸解 10 min，获
得的龙须菜酸解糊化液黏度适宜，流动性好，有利
于琼胶底物与琼胶酶充分接触。 虽然该酸解液的
还原糖得率仅为 6.91%，远低于徐强 [13]研究中的
还原糖得率， 但本实验酸解龙须菜的目的不是为
了获得最好的酸解效率，而是为了在更环保、温和
的条件下，使高浓度的龙须菜底物糊化，通过增大
其流动性来增加底物与琼胶酶的接触几率， 提高
琼胶酶酶解龙须菜的效率。
2.5 龙须菜酸解液的酶解条件研究
通过检测不同起始 pH 值、酶解时间、震荡条
件、 混合酶液比例等不同酶解条件下酶解液的还
原糖含量， 对龙须菜酸解糊化液的酶解条件进行
优化。
2.5.1起始 pH值对酶解效果的影响
pH 值通过影响酶分子上的氨基酸残基来影
响酶与底物的结合，进而影响酶活[4]。 从图 3中可
以看出，不同 pH值下，酶解效果差异较大。 当 pH
图 2 菌株 QJ14 和 Hhjh 的酶活随时间变化
Fig.2 Agarase activity of strain QJ14 and Hhjh changed
over time
图 1 琼胶降解菌 QJ14 和 Hhjh 的降解效果
Fig.1 Degradation effect of agarolytic strains QJ14 and Hhjh
QJ14 Hhjh 碘液染色 Hhjh 液化平板
QJ14
Hhjh
培养时间/h
100
80
60
40
20
0
酶
活
/U
·
m
L-
1
0 12 24 36 48 60 72
·791·
唐鸿倩，等 琼胶降解菌的筛选及其在龙须菜乙醇发酵中的初步应用
值低于 6 或大于 8 时， 菌株 QJ14 琼胶酶解液中
还原糖含量非常低，在 pH 值为 7 时，酶解效果最
好，酶解液中还原糖含量达到 20.47 mg/g。 当 pH
值为 4时，菌株 Hhjh琼胶酶解液中还原糖含量很
低，随着 pH 值上升，酶解液中还原糖含量也随之
上升，在 pH 值为 6 时，酶解效果最好，酶解液中
还原糖含量达到 26.72 mg/g， 随后酶解液中还原
糖含量随着 pH值的继续升高而有所下降。
2.5.2原料的最佳酶解时间
在酶解反应的初期，随着酶解时间的延长，酶
解液中还原糖含量增加， 但酶解液中酶量是有限
的，当酶量不足时，酶解液中还原糖含量将停止增
长，而且随着酶解液中还原糖含量的增加，也会对
酶解反应产生更大的抑制作用。从图 4中可看出，
在不同酶解时间下，酶解效果有很大的不同。酶解
时间从 24 h 增加到 48 h 时，QJ14 的酶解液中还
原糖含量增加了 5.97 mg/g，Hhjh 的酶解液中还原
糖含量增加了 4.43 mg/g。 如果再延长酶解时间，
酶解液中还原糖含量几乎不再增加，Hhjh 的酶解
液中还原糖甚至有所下降。因此，48 h为酶解的最
佳时间。
2.5.3 震荡对菌株 QJ14 和 Hhjh 粗酶液酶解效果
的影响
震荡能增加酶解液的溶氧量， 有利于酶解反
应的进行。 同时，震荡会引起培养液的流动，能增
加琼胶酶与底物的接触几率。从图 5中可以看出，
震荡对酶解效果有很大的影响。 在震荡酶解的过
程中，QJ14 和 Hhjh 酶解液中的还原糖含量均比
静止培养时增加约 1.5 mg/g。
2.5.4 菌株 QJ14 和 Hhjh 粗酶液的混合比例对酶
解效果的影响
不同琼胶降解菌所产琼胶酶种类不同， 作用
于琼胶分子的方式也会有差异，如 a-琼胶酶作用
于琼胶糖的 a-1，3 糖苷键，β-琼胶酶作用于琼胶
糖的 β-1，4糖苷键[14]。因此，混合酶液酶解琼胶的
效果往往好于单一的酶液。从图 6中可看出，Hhjh
粗酶液的酶解效果好于 QJ14，当将两种粗酶液按
不同比例混合后， 混合酶解液中还原糖含量有显
著差异。其中，QJ14∶Hhjh为 3∶1时，还原糖含量增
长最多，比单用 Hhjh 粗酶液增加 5.26 mg/g，比单
用 QJ14 粗酶液增加 9.64 mg/g。 混合酶液的酶解
效果好于单一的粗酶液，这与潘崇良 [15]的研究结
果相一致。
2.6 琼胶酶粗酶液在龙须菜乙醇发酵中的初步应
用
将酸解糊化后的龙须菜在相同条件下分别进
行了混合菌发酵、 分步酶解发酵和酵母单菌发酵
的实验。从图 7中可看出，第 3个发酵组合即分步
酶解发酵 （龙须菜酸解糊化液在琼胶粗酶液酶解
48 h 后，再加入 5%的酿酒酵母）的培养液获得的
图 3 酶解液起始 pH 值对酶解效率的影响
Fig.3 Impact of hydrolysate initial pH on hydrolysis efficiency
图 4 酶解时间对酶解效率的影响
Fig.4 Impact of hydrolysis time on hydrolysis efficiency
图 5 震荡对酶解效率的影响
Fig.5 Impact of shake-flask on hydrolysis efficiency
图 6 粗酶液混合比例对酶解效率的影响
Fig.6 Impact of mix ratio of agarase on hydrolysis efficiency
还
原
糖
含
量
/m
g·
g-
1
QJ14
Hhjh
pH值
30
25
20
15
10
5
0
4 5 6 7 8 9 10
QJ14
Hhjh
酶解时间/h
30
25
20
15
10
5
0
24 48 72
还
原
糖
含
量
/m
g·
g-
1
0∶4 1∶3 2∶2 3∶1 4∶0
QJ14和 Hhjh的酶液混合比
还
原
糖
含
量
/m
g·
g-
1
35
30
25
20
15
10
5
0
还
原
糖
含
量
/m
g·
g-
1
30
20
10
0
震荡
静止
QJ14 Hhjh
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可再生能源 2015，33（5）
乙醇产量是最高的，达到 2.36 mL/L；前两个混合
菌发酵组合中， 不管是同时加入酿酒酵母和琼胶
降解菌还是先加琼胶降解菌分解琼胶 48 h 后，再
加酿酒酵母发酵，发酵液中的乙醇产量都非常低。
酵母单菌发酵液中， 用顶空气相色谱法没有检测
到乙醇。
分步酶解发酵的效果明显好于酵母单菌发酵
和混合菌发酵， 原因可能是在琼胶降解菌的生长
繁殖过程中，当有还原糖存在时，会优先利用还原
糖， 使得留在发酵液中能被酿酒酵母用来发酵乙
醇的还原糖变得更少，因此，乙醇产量也减少。 酵
母单菌发酵组合，既没有添加琼胶降解菌，也没有
添加琼胶粗酶液， 结果发酵液中几乎检测不到乙
醇的存在。这也进一步说明，龙须菜酸解糊化液中
添加琼胶酶， 对龙须菜的糖化和乙醇发酵是有促
进作用的。潘崇良[15]的实验研究中，仅通过琼胶酶
水解， 酿酒酵母发酵， 就能从 10 kg 干燥龙须菜
中，获得 0.96 L 的海藻乙醇。 本实验室获得的乙
醇产量为 2.36 mL/L， 即能从 10 kg 干燥龙须菜
中，获得 0.47 L 的海藻乙醇，约为潘崇良实验研
究中乙醇产量的一半。 我们是通过稀盐酸酸解糊
化的方法来增大龙须菜的底物浓度及发酵液流动
性，与潘崇良实验中用超过滤系统将 25 L 的酶解
液浓缩至 100 mL的处理方法相比，极大程度的节
约了生产成本，更具实践意义。
3 结论
本研究获得的琼胶降解菌 Pseudoalteromonas
sp. QJ14 和 Agarivorans sp. Hhjh 均具有很强的琼
胶降解能力。 通过对它们的粗酶液的酶解条件进
行优化，最终确定 pH 7（菌株 QJ14）和 pH6（菌株
Hhjh），粗酶混合比例为 QJ14∶Hhjh=3∶1，在震荡条
件下酶解 48 h为龙须菜酸解液的酶解条件。 比较
混合菌发酵、分步酶解发酵和酵母单菌发酵结果，
只有加入琼胶降解菌粗酶液酶解 48 h 后，再利用
酿酒酵母发酵的分步酶解发酵实验组乙醇产量最
高，达到 2.36 mL/L。上述结果表明，琼胶降解菌的
粗酶液对龙须菜乙醇发酵具有促进作用，以温和、
环保的方法从龙须菜发酵液中获得生物乙醇是完
全可行的。
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图 7 不同发酵组合下的乙醇产量
Fig.7 Ethanol yields in different fermented broth
4
3
2
1
0
乙
醇
产
量
/m
L·
L-
1 酸解液+菌液+酵母
酸解液+菌液+酵母（48 h 后）
酸解液+粗酶液+酵母（48 h 后）
酸解液+灭菌水+酵母（48 h 后）
不同发酵组合
·793·
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Isolations of agar-degrading bacteria and their function in
ethanol fermentation from Gracilaria lemaneiformis
Tang Hongqian， Zhong Mingqi， Chen Yang， Du Hong
（College of Sciences， Shantou University， Shantou 515063， China）
Abstract： For the purpose of the optimal ethanol fermentation conditions of Gracilaria lemaneiformis,
bacterial strains with strong agar -degrading abilities were isolated and their enzyme production
conditions were studied. Using agar as the sole carbon source, two agar-degrading strains QJ14 and
Hhjh were isolated. By compared with 16S rDNA in NCBI database, QJ14 and Hhjh were identified as
Pseudoalteromonas sp. QJ14 and Agarivorans sp. Hhjh, respectively. Hydrolyzed Gracilaria
lemaneiformis with the crude agarase producing by QJ14 and Hhjh and then optimized hydrolysis
conditions at different initial pH, enzymatic hydrolysis times, shaking conditions, mixed enzymes
ratios. It could obtain maximum 29.33 mg/g reducing sugar. The hydrolysis product using enzymatic
hydrolysis was significantly better compared with those of yeast fermentation and mixed culture
fermentation. The ethanol production was analyzed as 2.36 mL/L using HeadSpace gas chromatography
in enzymatic hydrolysis fermentation broth, while yeast fermentation broth and mixed culture
fermentation broth were not measured. The experimental data provided laboratory references for the
feasibility of the optimal Gracilaria lemaneiformis-ethanol fermentation conditions.
Key words： isolation； 16s rDNA； G. lemaneiformis； fermentation； ethanol
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可再生能源 2015，33（5）