全 文 ：云南大学学报 (自然科学版), 2003 , 25 (增刊):101～ 106 CN 53-1045/N　ISSN 0258-7971
Journal of Yunnan University
重金属及其形态对斜生栅藻生长的影响
姬乃建1 , 鲍慈光2 , 许良知1 , 彭　莉2 , 赵逸云3 , 王若南1
(1.云南大学 生物系;2.云南大学 实验中心;3.云南大学 化学系 , 云南 昆明　650091)
摘要:采用均匀设计方法设计实验 ,研究了 Cu2+ , Pb2+ , Zn2+3 种重金属离子以及与 EDTA 、三聚磷酸钠 、
柠檬酸形成的络合物对斜生栅藻生长量的影响.通过对实验结果进行回归分析 ,表明了重金属离子及其形态与
斜生栅藻生长量的关系.当柠檬酸 、三聚磷酸钠和 EDTA 的浓度分别为 0 , 5.0×10-3 , 1.0×10-3mol/ L时 , Cu ,
Zn , Pb 分别抑制斜生栅藻生长的 144 h-LC50为 4.791×10-6 , 1.128×10-2 , 1.06×10-4 mol/L.从重金属抑制
斜生栅藻生长的 144 h-LC50考虑 , 3 种重金属对斜生栅藻毒害作用由大到小的顺序依次是 Cu , >Zn , >PB>:
柠檬酸和三聚磷酸钠能加强重金属对斜生栅藻的毒害作用;重金属对斜生栅藻的毒害作用随 EDTA 的增加而
受到抑制.
关键词:均匀设计;回归分析;斜生栅藻;Cu;Zn;Pb;EDTA;三聚磷酸钠;柠檬酸;毒性
中图分类号:Q 945.14　　文献标识码:A　　文章编号:0258-7971(2003)S-0101-06
　　Cu和 Zn是生物必需的微量元素 ,在一定浓度
范围内对生物生长有利 ,但它们达到一定浓度时都
会表现出毒性.用铜盐溶液处理藻类(Anabaena
variabil is和Plectomema boryanum )时 ,它们的质
体兰素会增加 ,细胞色素 c-553下降[ 1] .用过量铜
盐处理绿藻(Ankistrodesmus falcatus)时 ,光合作
用被抑制.Cu可使藻类(Lyngbyanigra)膨胀淡黄
化 ,降低光合作用.王菊英等[ 2]对金藻(Dierateria
zhanjianggensis)的亚微结构变化方面进行了研
究 ,发现 Cu和 Zn 可造成线粒体操作并阻碍蛋白
质合成从而抑制金藻的生长.阎海等[ 3] 的实验表
明Cu和 Zn分别抑制蛋白核小球藻生长的 96 h-
EC50为 67.3和 473.0μg/ L ,也说明了重金属抑制
蛋白核小球藻生长的毒性大小顺序是 Cu>Zn.尽
管 Pb并非生物体必需的营养元素 ,但它对生物体
的营养仍很重要 ,关键在于 Pb容易在体内积累以
及它与其它物质的相互作用.大剂量的 Pb 对植物
体有毒害作用.它能阻碍植物的生长 ,降低光合作
用 ,而且还能引起 Cu缺乏.植物中的 Pb能参与到
线粒体和叶绿体中[ 1] .多种重金属的混合作用很
复杂 ,重金属与络合物相结合更可能产生意想不到
的影响.络合剂的种类不同 ,对重金属毒性的影响
也就不一样.柠檬酸可加强 Cu对水池中的绿藻的
清除[ 1] .张怀成等[ 5]的实验证明 EDTA 能阻止叉
鞭金藻(Dicratoria)对 Cu的吸收.
1　均匀设计方案的确定
本实验涉及到 3 种重金属 Cu , Zn , Pb和 3 种
络合物 EDTA 、柠檬酸和三聚磷酸钠 ,总共有 6 个
因素.对于多因素多水平的实验如果采用正交实验
设计最少需要 rq2次实验[ 5](r 为自然数),这在时
间和经费上都不允许.均匀设计的基本思想就是使
布点在方格中尽可能均匀分布从而减少实验次数.
为了研究的需要 ,本实验中每个因素取 11个值 ,因
此需要采用均匀设计表 U ×(116)来设计实验.实
验中每个因素的取值范围见表 1.
采用均匀设计表 U ×(116)设计实验.Cu2+浓
度 ,Zn2+浓度 ,Pb2+浓度 ,柠檬酸浓度 ,三聚磷酸钠
浓度和 EDTA 浓度以及所测得的最后光密度平均
值分别用 X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , X 6 和 OD484 nm表示
时 ,各条件和相应的处理结果如表 2所示.
收稿日期:2003-03-02
　作者简介:姬乃建(1977-　),男 ,陕西人 ,硕士生,主要从事藻类学的研究.
表 1　各实验因数的取值范围
Teb.1 The bound of factors in the experiment
Cu2+/
(×10-6mo l·L-1)
Zn2+/
(×10-6mol·L-1)
Pb2+/
(×10-6mol·L-1)
柠檬酸/
(×10-3mol·L-1)
三聚磷酸钠/
(×10-3mol·L -1)
EDTA/
(×10-4mo l·L-1)
1 0 0 0 0 0 0
2 0.50 1.00 1.00 0.50 1.00 1.00
3 1.00 2.00 2.00 1.00 2.00 2.00
4 1.50 3.00 3.00 1.50 3.00 3.00
5 2.00 4.00 4.00 2.00 4.00 4.00
6 2.50 5.00 5.00 2.50 5.00 5.00
7 3.00 6.00 6.00 3.00 6.00 6.00
8 3.50 7.00 7.00 3.50 7.00 7.00
9 4.00 8.00 8.00 4.00 8.00 8.00
10 4.50 9.00 9.00 4.50 9.00 9.00
11 5.00 10.00 10.00 5.00 10.00 10.00
表 2　按 U ×(116)表设计的实验方案及实验结果
Tab.2 The design table U ×(116)and results of the experiment
X 1/(×10-6·
mol·L-1)
X 2/(×10-6·
mol·L-1)
X 3/(×10-6·
mol·L-1)
X 4/(×10-3·
mol·L-1)
X 5/(×10-3·
mol·L -1)
X 6/(×10-4·
mo l·L-1) OD484
1 0 1.00 2.00 2.00 3.00 9.00 0.459
2 0.50 3.00 5.00 4.50 1.00 8.00 0.491
3 1.00 5.00 8.00 1.50 4.50 7.00 0.466
4 1.50 7.00 0 4.00 2.50 6.00 0.496
5 2.00 9.00 3.00 1.00 0.50 5.00 0.700
6 2.50 0 6.00 3.50 4.00 4.00 0.450
7 3.00 2.00 9.00 0.50 2.00 3.00 0.697
8 3.50 4.00 1.00 3.00 0 2.00 0.509
9 4.00 6.00 4.00 0 3.50 1.00 0.620
10 4.50 8.00 7.00 2.50 1.50 0 0.433
11 5.00 10.00 1.00 5.00 5.00 10.00 0.465
2　材料与方法
2.1　实验材料　斜生栅藻(Senedesmus obl iquus)
购自中科院武汉水生生物研究所 ,重金属盐分别为
CuSO4 ,Zn(NO3)2 和乙酸铅.所用化学试剂如下:
CuSO4:分析纯 ,实验前未经进一步纯化 , [ Cu2+]浓
度由原子吸收法测定.Zn(NO3)2:同上;乙酸铅:同
上;Na2-EDTA:分析纯 ,按文献[ 6]方法配制与标
定(由于 EDTA 的溶解度较小 ,因此用 Na2 -ED-
TA 代替 EDTA);柠檬酸:分析纯 ,按文献[ 7] 方法
配制与标定;三聚磷酸钠:工业用一级 ,使用前未经
进一步纯化 ,按文献[ 8]配制及标定.
102 云南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 25 卷
2.2 　培养基的配制(100 mL)　NaNO3:25mg ,
CaCl2:2.5 mg , K2HPO4:7.5 mg , MgSO4·7H2O:
7.5 mg ,KH2PO4:17.5 mg , NaCl:2.5 mg , Soil ex-
tract:4 mL , Fe -EDTA:0.1 mL , FeCl3·6H2O:
0.5 mg ,A5 solution:0.1 mL ,蒸溜水:95.8mL.
以上药品均为分析纯.其中 ,Soil ex tract的制
备方法是称取黄土 0.5 kg ,加水 1 000 mL ,水浴中
加热并搅拌 , 2 h后静置 ,将上清夜过滤后即可得
到.
Fe-EDTA solution 的配制方法是将 Na2 -
EDTA和 FeCL3 分别溶于水和 HCl(0.1 mol/ L)混
匀即可.
Na2 - EDTA:1 g , 蒸 溜 水:50 mL ,
FeCl3·6H2O:81mg ,HCl(0.1 mol/L):50 mL.
2.3　培养条件　所用玻璃器皿和培养液 、蒸馏水
均经过121℃20 min灭菌 ,玻璃器皿在干燥箱中干
燥后于实验前置于无菌室内用紫外线灭菌 20min.
实验所用容器为 250 mL 玻璃三角瓶(洗涤时用稀
硝酸溶解玻璃中含有的重金属离子),培养量为
100 mL .实验温度为 28±2℃.光照黑暗循环为 12
h∶12 h ,光照强度为 2 000 LX ,光源为日光灯.培养
液的 pH 值为 6.59.实验前通过对斜生栅藻生长量
的测定绘制生长曲线 ,取处于对数生长期的斜生栅
藻(扩种后第 3 天)作为实验初始液 ,并测定其
OD484为 0.426.在本实验中 ,斜生栅藻的培养时间
为 144 h.
2.4　生长量测定方法　本实验为 11组(按均匀设
计要求),每组取 3 个平行样.用 722光光度计在
484 nm 处测定藻液光密度(OD484)以示斜生栅藻
的生长量.在平行样之间的相对偏差小于 10%时 ,
实验数据取自 3个平行样的均值.
3　实验结果的回归分析
3.1　回归方程及方差　对实验结果进行回归分析
表明 ,各实验条件与最终光密度 OD之间不是简单
的线性关系.部分量取对数或改变函数形式后 ,再
求回归方程.
令 y1 = x 12 ×1012 , y 2 =x 21/3 ×102 , y 3 = x 31/3 ×
102 , y 4=x 41/ 4×103/4 , y 5=x 51/2 ×103/2 , y 6=x61/3
×104/ 3 , y7=x1 x 3×1012
则得表 3.
按文献[ 9]的方法进行回归分析 ,求得最终光
密度的回归方程为:
ln(OD)=0.309 - 3.01×10-2 y 1 -1.43×10-2
y2-0.146y3 - 0.472y 4- 0.262y 5 +8.78×10
-2y 6+2.21×10-2 y7 (1)
回归方程的方差分析结果见表 4.
表 3　实验参数的对数及结果平均值
Tab.3 The lo garithm o f experiment result
y 1 y2 y 3 y 4 y 5 y 6 y 7 ln(OD)
1 0.00 1.00 1.260 1.189 1.732 2.080 0.000 -0.779
2 0.25 1.442 1.709 1.457 1.000 2.000 2.500 -0.711
3 1.00 1.709 2.000 1.107 2.121 1.913 2.000 -.0764
4 2.25 1.913 0.000 1.414 1.581 1.817 0.000 -0.701
5 4.00 2.080 1.442 1.000 0.707 1.710 6.000 -0.357
6 6.25 0.00 1.816 1.368 2.000 1.587 15.00 -0.799
7 9.00 1.260 2.080 0.841 1.414 1.442 27.00 -0.361
8 12.25 1.587 1.000 1.361 0.000 1.260 3.500 -0.675
9 16.00 1.816 1.587 0.000 1.871 1.000 16.00 -0.478
10 20.25 2.000 1.913 1.257 1.225 0.000 31.50 -0.837
11 25.00 2.154 2.154 1.495 2.236 2.654 50.00 -0.785
103增刊　　　　　　　　　　　姬乃建等:重金属及其形态对斜生栅藻生长的影响
表 4　方程(1)的方差分析表
Tab.4 The mean square error analisis of equation(1)
方差来源 平方和 自由度 F
回归 0.297 7 9.916
误差 1.29×10-2 3
总和 0.316 10
F>F 0.0列1(7 ,11)=6.62 ,所以方程(1)是可信的.
3.2　各因素对 OD的影响分析　将各因素从方程
中逐一删除后产生的偏回归平方和分别为:
Sc(234567)=8.49×10-2 , Sc(134567)=1.34 ×
10-2 , Sc(124567)=4.12×10-2 , Sc(123567)=0.255 ,
Sc(123467)=0.154 , Sc(123457) = 2.86 × 10-2 ,
Sc(123456)=0.101.
所以:P1 =7.20×10-2 , P2 =0.05×10-2 , P3
=2.83 ×10-2 , P4 =0.242 , P5 =0.141 , P 6 =
1.58×10-2 , P 7=0.088.
可见 ,各因素对最终 ln(OD)值的影响大小顺
序为:y 4 , y 5 , y 7 , y1 , y 3 , y 6 , y 2.即:柠檬酸浓度的 14
次方 ,三聚磷酸钠浓度的 1
2
次方 ,Cu2+浓度与 Pb2+
浓度之积 , Cu2+浓度的平方 , Pb2+浓度的 13次方 ,
EDTA浓度的 1
3
次方 ,Zn2+浓度的 1
3
次方.
4　讨　论
4.1　重金属对斜生栅藻毒性的规律
4.1.1　由回归方程 ln(OD)=0.309-3.01×10-2
y 1-1.43×10-2 y 2-0.146y 3-0.472y 4-0.262y 5
+8.78×10-2y 6+2.21×10-2 y 7 ,(1)可见:
当 Pb2+ ,Zn2+ ,Cu2+和柠檬酸浓度均为 0时 ,
三聚磷酸钠为 2.5×10-3mol/ L , EDTA 为 5.0 ×
10
-4
mol/L ,则最终 OD值为 1.046.
4.1.2　由回归方程 ln(OD)=0.309-3.01×10-2
y 1-1.43×10-2 y 2-0.146y 3-0.472y4 -0.262y 5
+8.78×10-2y 6+2.21×10-2 y 7 ,(1)可见:
当 Pb2+ ,Zn2+和柠檬酸浓度均为 0时 ,三聚磷
酸钠为 5.0 ×10-3 mol/L , EDTA 为 1.0 ×10-3
mol/ L ,最终OD值与 Cu2+的关系为:
ln(OD)=-0.088-0.0301×1012 x12 , (2)
Cu2+浓度与 OD值的关系见表 5.
可见 ,在溶液中只有三聚磷酸钠(为 5.0 ×
10
-3
mol/ L)和 Na2 -EDTA(为 1.0×10-3mol/L)
时 ,斜生栅藻的生长量随着铜的增加而降低.铜对
斜生栅藻的 144 h半致死浓度 144 h-LC 50为 4.
791×10-6mol/L.
4.1.3　当 Cu2+ , Pb2+浓度和柠檬酸均为 0时 ,三
聚磷酸钠为 5.0×10-3mol/L , EDTA 为 1.0×10-3
mol/ L ,最终OD值与 Zn2+的关系为:
ln(OD)=-0.088-0.0143×102 x 21/3 , (3)
Zn2+与OD值的关系见表 6.
可见 ,斜生栅藻生长量随着锌浓度的增加而降
低.锌对斜生栅藻的 144 h 半致死浓度 144 h-LC
50为 1.128×10-2mol/L.
表 5　Cu2+浓度与 OD值的关系
Tab.5 The relation of density of cuprum and optical density
c(Cu2+)/(mol·L -1) 0　　 0.5×10-6　 1.0×10-6　 1.5×10-6　 2.0×10-6　 2.5×10-6　
OD 0.917 0.909 0.889 0.855 0.812 0.759
c(Cu2+)/(mol·L -1) 3.0×10-6 3.5×10-6 4.0×10-6 4.5×10-6 5.0×10-6
OD 0.698 0.633 0.566 0.497 0.437
表 6　Zn2+浓度与 OD值的关系
Tab.6 The relation of density of zinc and optical density
c(Zn2+)/(mol·L-1) 0　　 1.00×10-6　 2.00×10-6　 3.00×10-6　 4.00×10-6　 5.00×10-6　
OD 0.917 0.903 0.899 0.897 0.895 0.894
c(Zn2+)/(mol·L-1) 6.00×10-6 7.00×10-6 8.00×10-6 9.00×10-6 10.0×10-6
OD 0.892 0.891 0.890 0.889 0.888
104 云南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 25 卷
4.1.4　当 Cu2+ , Zn2+和柠檬酸浓度均为 0 时 ,三
聚磷酸钠为 5.0×10-3mol/L ,EDTA 为 1.0×10-3
mol/L ,最终 OD值与 Pb2+的关系为:
ln(OD)=-0.088-0.146×102 x 31/ 3 , (4)
Pb
2+浓度与OD值的关系见表 7.
表 7　Pb2+浓度与 OD值的关系
Tab.7 The relation of density of plumdum and optical density
c(Pb2+)/(mol·L-1) 0　　 1.00×10-6　 2.00×10-6　 3.00×10-6　 4.00×10-6　 5.00×10-6　
OD 0.917 0.791 0.762 0.742 0.726 0.713
c(Pb2+)/(mol·L-1) 6.00×10-6 7.00×10-6 8.00×10-6 9.00×10-6 10.0×10-6
OD 0.703 0.693 0.684 0.676 0.669
　　可见 ,斜生栅藻生长量随着 Pb的增加而降低.
Pb对斜生栅藻的 144 h 半致死 144 h -LC 50 为
1.06×10-4mol/ L.
4.1.5　各因素作用的大小 ,由各影响因素对 OD
值影响的作用大小顺序可见 ,在 0 ～ 5.0×10-6
mol/L浓度范围内 ,重金属对斜生栅藻 OD值影响
的作用大小为:Cu>Zn>Pb.而从影响斜生栅藻的
144 h-EC 50考虑 ,铜 、锌和铅对斜生栅藻的毒性
作用大小顺序为 Cu>Pb>Zn.
4.2　络合剂对重金属的毒性影响规律
4.2.1　由回归方程　ln(OD)=0.309-3.01×
10
-2
y1 -1.43 ×10-2 y 2 -0.146y 3 -0.472y 4 -
0.262y5+8.78×10-2y 6+2.21×10-2 y 7 ,
可见 ,在三聚磷酸纳浓度 、EDTA 浓度和柠檬酸浓
度均为 0 , Pb2+浓度为 5.0×10-6mol/L , Cu2+为
2.5×10-6mol/L ,Zn2+浓度为 5.0×10-6mol/L ,最
终OD值应为:0.674.
4.2.2　由回归方程　ln(OD)=0.309-3.01×
10-2 y1 -1.43 ×10-2 y 2 -0.146y 3 -0.472y 4 -
0.262y5+8.78×10-2y 6+2.21×10-2 y 7 ,
可见 ,在 Pb2+为 5.0×10-6mol/ L , Cu2+为 2.5×
10
-6
mol/L ,Zn2+为 5.0×10-6mol/L ,三聚磷酸钠
的浓度 、EDTA 为 0时 ,最终 OD 值与柠檬酸浓度
的关系为:ln(OD)=-0.394-0.472×103/ 4 x 41/4.
显然 ,柠檬酸的加入能增强重金属对斜生栅藻
的毒害作用.
4.2.3　由回归方程　ln(OD)=0.309-3.01×
10
-2
y1 -1.43 ×10-2 y 2 -0.146y 3 -0.472y 4 -
0.262y5+8.78×10-2y 6+2.21×10-2 y 7 ,
可见 ,在 Pb2+为 5.0×10-6mol/ L , Cu2+为 2.5×
10
-6
mol/L ,Zn2+为 5.0×10-6mol/L ,柠檬酸的浓
度 、EDTA为 0时 ,最终 OD值与三聚磷酸钠的关
系为:ln(OD)=-0.394-0.262×103/2 x 51/ 2.
显然 ,三聚磷酸钠的加入也能增强重金属对斜
生栅藻的毒害作用.
4.2.4　由回归方程　ln(OD)=0.309-3.01×
10
-2
y 1 -1.43 ×10-2 y2 -0.146y3 -0.472y4 -
0.262y 5+8.78×10-2 y 6+2.21×10-2 y 7 ,
可见 ,在 Pb2+为 5.0×10-6mol/ L , Cu2+为 2.5×
10-6mol/L ,Zn2+浓度为 5.0×10-6mol/ L ,柠檬酸
的浓度 、三聚磷酸钠为 0 时 ,最终 OD 值与 EDTA
浓度的关系为:ln(OD)=-0.394+0.087 8×104/3
x 6
1/3.
这反映出 ,Cu ,Zn , Pb与 EDTA 形成的络合物
形态对斜生栅藻的毒性较无机盐的离子形态要低.
5　结　论
(1)采用均匀设计方法设计实验并对实验结
果进行回归分析表明 , Cu , Zn , Pb 3种金属对斜生
栅藻的生长有毒害作用.当柠檬酸 、三聚磷酸钠和
EDTA分别为 0 , 5.0×10-3 ,1.0×10-3mol/L 时 ,
Cu ,Zn ,Pb 分别抑制斜生栅藻的 144 h-LC 50 为
4.791×10-6 , 1.128×10-2 , 1.06×10-4mol/L.从
半致死浓度考虑 ,Cu ,Zn ,Pb 抑制斜生栅藻生长的
顺序依次是 Cu>Zn>Pb.
(2)柠檬酸 、EDTA 、三聚磷酸钠等络合剂能与
重金属络合形成稳定的重金属络合物.实验结果表
明重金属的络合物形态对斜生栅藻的毒害作用不
同与离子形态;柠檬酸和三聚磷酸钠能加强重金属
对斜生栅藻的毒害作用 ,而 EDTA则能降低重金属
105增刊　　　　　　　　　　　姬乃建等:重金属及其形态对斜生栅藻生长的影响
对斜生栅藻的毒害作用.这可能是因为铜在斜生栅
藻细胞表面的结合程度要小于 EDTA ,从而使得大
部分留在细胞表面以外 ,只有小部分进入细胞内.
现实当中 EDTA与重金属形成的络合物稳定且可
溶 ,能将污泥中的重金属再次溶出 ,从而容易造成
二次污染.因此络合剂在污染环境的治理中的应用
需要综合考虑多种因数 ,这一方面还有待进一步研
究.
(3)均匀设计方法在本实验中的应用使得实
验次数大大减少.与前人研究藻类毒性的单因数实
验相比 ,本实验既可讨论单因数的作用 ,也可讨论
多种因数的混合效应.极大地提高了实验的效率.
参考文献:
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Effects of heavy metals and complex on senedesmus obliquus
JI Nia-jian1 , BAO Chi-guang 2 , XU Liang-zhi1 , PENG Li2 , ZHAO Yi-yun3 , WANG Ruo-nan1
(1.Deparment of Bio logy Yunan University;
2.Tht Center of Experiment , Yunnan University;
3.Department of Chmistry , Yunnan University;Kunming 650091 , China)
Abstract:The experiment w as arranged by the uniform design.I t w as studied the effect of heavy metals
and heavy metal complexes on senedesmus obliquus s grow th.Through experimental data statistics and regres-
sion , the funct ion relationship between the results of the experiment , OD484 nm and facto rs of Cu ,Zn , Pb ,ED-
TA ,C6H 8O7·H2O ,Na5P3O10 was discussed.It w as found that the 144 h-LC 50 of Cu ,Zn and Pb were 4.791
×10-6 ,1.128×10-2 , 1.06×10-4mol/L when the concentrations of C6H8O7·H2O , Na5P3O10 and EDTA
were 0 ,5.0×10-3 , 1.0×10-3mol/L .According to 144 h-LC 50 , the toxic sequence of these heavy metals
from high to low on the inhibi tion of Senedesmus obliquus s grow th w ere Cu ,Pb and Zn.The dif ferent af fini-
ties between different heavy metal ions and alga cells w ere mainly responsible for the different inhibitions of
Senedesmus obliquus grow th.C6H8O7·H2O and Na5P 3O10 st reng thened heavy metal s toxicity .EDTA bated
heavy metal s toxicity on the inhibit ion of Senedesmus obliquus g row th.
Key words:unifo rm design;regression analy sis senedesmus obliquus;Cu;Zn;Pb;EDTA;Na5P3O10;
C6H8O7·H2O;toxicity.
106 云南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 25 卷