全 文 ：基金项目:广东医学院科研基金项目(编号:M2011027) ;湛江市科
技攻关项目(编号:2012C3104028)
吴伟全 王思捷 吴 平:广东医学院 广东湛江 524001
李元歌 王永存:广东医学院附属医院 广东湛江 524001
通讯作者:吴 平
基于蒿草切片对比分析激光共聚焦系统的三维重构成
像及二维平面成像的应用价值
吴伟全 李元歌 王思捷 王永存 吴 平
APPLICATION VALUE OF LASEＲ SCANNING CONFOCAL MICＲOSCOPE 3D ＲECON-
STＲUCTION IMAGING AND 2D IMAGING BASED ON THE COMPAＲISON ANALYSIS OF
WOＲMWOOD SLICE
WU Weiquan，LI Yuange，WANG Sijie，et al
【摘 要】 目的 比较激光扫描共聚焦显微镜二维平面成像和三维重构成像在生物组织形态学研究中
的运用价值。方法 运用我院临床医学研究中心的激光扫描共聚焦显微镜对蒿草切片进行二维平面成像及
三维重构成像，实验分为 A组:二维平面图像组; B 组:垂直叠加三维重构成像组; C 组:沿 X 轴旋转 45°三维
重构成像组三个组，并对结果比较分析。结果 激光扫描共聚焦显微镜不但可以获取的分辨率高和成像清晰
的二维平面图像及三维重构图像，还可显示沿着 X轴旋转 45°的三维重构成像。结果统计显示三维重构图像
的荧光值比二维平面图像的荧光值增加，另外三维图像沿 X轴旋转 45°后，其荧光值也增加。结论 与二维平
面图像比较，三维重构图像具有三维立体及含图像信息量多的特点，并可沿任意角度显示，更有利于了解对标
本的空间结构关系。
【关键词】 激光扫描共聚焦显微镜 蒿草切片 三维重构 二维平面
【Abstract】 Objective To compare the application value of two － dimensional imaging and three － dimension-
al reconstruction imaging of laser scanning confocal microscope in a morphological study of biological tissue．Methods
The two － dimensional imaging and three － dimensional reconstruction imaging of wormwood slice were performed
with a laser scanning confocal microscope in our clinical research center． According to the different imaging condi-
tions，the experiment was divided into three groups． Group A:two － dimensional image set;Group B:vertical stac-
king of three － dimensional reconstruction imaging set;Group C:along X axis rotation angle of 45 ° of three － dimen-
sional reconstruction imaging set，and then the results were compared． Ｒesults The laser scanning confocal micro-
scope not only can obtain two or three － dimensional image with high resolution and clear imaging，but also can get
three － dimensional reconstruction imaging with high resolution along X axis rotation with an angle of 45 °． The results
statistics showed that the fluorescence values of the three － dimensional reconstructed image were significance higher
than two － dimensional images． The fluorescence values of the three － dimensional image increased after rotating along
the X axis 45 °． Conclusion Three － dimensional reconstruction of images have more image information than two －
dimensional image，can get images rotated any angle along the X axis，and benefit to realize the relationship of speci-
mens spatial structure．
【Key words】 laser scanning confocal microscope;the wormwood slice;three － dimensional reconstruction;
two － dimensional plane
【Authors address】 Guangdong Medical College，Zhanjiang，Guangdong 524001，PＲC
doi:10． 3969 / j． issn． 1671 － 332X． 2013． 07． 008
随着生物组织形态学研究的发展，激光扫描共聚焦显
微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)作为生物
组织形态学新一代强有力的研究工具［1 － 2］。传统的生物
结构显微组织学研究，基本上都是在二维形态上进行［3］，
但是，实际的生物组织结构都是三维立体结构。为了更准
确地描述生物组织结构，进一步研究组织结构与生理功能
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的关系，利用激光扫描共聚焦显微镜获取生物组织标本连
续的“光学切片”图像再利用软件重构三维成像是目前实
验研究的热点［4］。本实验通过激光扫描共聚焦显微镜对
蒿草切片进行二维平面成像及三维重构成像，比较激光共
聚焦显微镜二维平面成像和三维重构成像对生物组织形
态学研究的运用价值。
1 材料与方法
1． 1 材料及主要仪器
采用 Leica 公司的蒿草切片样品，经异硫氰酸荧光素
(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)及四甲基异硫氰酸罗丹
明(Tetramethyl Ｒhodamine Isothiocyanate，TＲITC)染色后固
定在载玻片上。激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP5Ⅱ，Lei-
ca公司)。
1． 2 激光共聚焦扫描获取二维平面图像
在激发和发射光选择菜单上，选择 FITC 和 TＲITC。
发射光采用两通道检测。第一通道激发光为 488 nm，检
测的发射波长为 520 ～ 545 nm，伪彩色采用绿光，所对应
的检测器为 PMT1;第二通道激发光为 543 nm，检测的发
射波长为 570 ～ 620 nm，伪彩色采用红光，所对应的检测
器为 PMT2。分别用 10倍、20 倍和 63 倍物镜采集共聚焦
图像。扫描方式(mode)为 XYZ;分辨率(format)为
1 024 × 1 024;扫描速度(speed)为 200 Hz;针孔大小(pin-
hole)为 1Airy;放大倍数(zoom)为 1。手动调节 Z轴位置
至清晰的焦平面，扫描获取二维平面图像。
1． 3 激光共聚焦扫描获取“光学切片”断层图像，并进行
三维重构
采用与 1. 2 扫描二维平面图像相同的基本参数，但启
动“光学切片”断层扫描程序:用 Z 轴驱动旋钮找到欲扫
描的组织的起始层面，设为“Begin”，再找到相应的终止层
面，设为“End”，设定扫描层数，获取“光学切片”断层图
像，并进行三维重构成像。
1． 4 实验分组
实验按采图方法分为三组。A 组:二维平面图像组;
B组:34 层扫描“光学切片”断层图像垂直叠加三维重构
成像组(扫描时系统推荐层切数目的优化值为 34) ;C 组:
34层扫描“光学切片”断层图像沿 X轴旋转 45°三维重构
成像组。共 30 个样品，每个样品用不同的采图方法及不
同倍数物镜分别采图 3 次。
1． 5 统计学处理
实验数据采用 SPSS 17. 0 软件进行统计学分析。计
量数据用 珋x ± s 表示，采用方差分析(One － Way － ANO-
VA) ，多样本均数比较选用 Dunnett 法，以 A 组为对照组。
p ＜ 0. 05表示差异有统计学意义。
2 结果
图 1A、图 2A和图 3A为激光扫描共聚焦显微镜扫描
蒿草切片获取的二维平面图像，具有分辨率高和成像清晰
的特点;图 1B、图 2B和图 3B为用激光扫描共聚焦显微镜
扫描蒿草切片所获得的 34 个连续“光学切片”的图像再
利用 LAS AF软件垂直叠加重构的三维图像;由于三维图
像具任意角度显示的特点，图 1C、图 2C和图 3C为将重构
的三维图像沿 X 轴旋转 45°显示的图像。三组实验结果
统计显示三维重构的图像的荧光值比二维平面图像的荧
光值增加，另外三维图像沿沿 X 轴旋转 45°后，其荧光值
也增加，见表 1。
A:二维平面图像;B:34层扫描“光学切片”断层图像垂直叠加三维重构成像;C:34层扫描“光学切片”断层图像沿 X轴旋转 45°三维重构成像
图 1 蒿草切片二维平面成像及其三维重构成像的对比(100 ×)
A:二维平面图像;B:34层扫描“光学切片”断层图像垂直叠加三维重构成像;C:34层扫描“光学切片”断层图像沿 X轴旋转 45°三维重构成像
图 2 蒿草切片二维平面成像及其三维重构成像的对比(200 ×)
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A:二维平面图像;B:34 层扫描“光学切片”断层图像垂直叠加三维重构成像;C:34 层扫描“光学切片”断层图像沿 X轴旋转 45°三维重构成像
图 3 蒿草切片二维平面成像及其三维重构成像的对比(630 ×)
表 1 三组蒿草切片不同倍数图像荧光强度比较
分组
荧光强度值
10 倍物镜 20 倍物镜 63 倍物镜
A组 33． 65 ± 0． 34 25． 20 ± 0． 02 26． 94 ± 0． 04
B组 68． 60 ± 0． 071) 54． 64 ± 0． 341) 44． 48 ± 0． 461)
C组 108． 71 ± 0． 031) 86． 55 ± 0． 391) 68． 70 ± 0． 041)
表中实验数据用 珋x ± s表示，共 30 个样品，每个样品用不同的采图
方法及不同倍数物镜分别采图 3 次;B组、C组不同倍数图像荧光强
度分别与 A组(对照组)的比较1)p ＜ 0. 05;实验按采图方法分为三
组，表中 A组为二维平面图像组;B组为 34 层扫描“光学切片”断层
图像垂直叠加三维重构成像组;C 组为 34 层扫描“光学切片”断层
图像沿 X轴旋转 45°三维重构成像组
3 讨论
激光扫描共聚焦显微镜是 20 世纪 80 年代发展起来
的高科技光学显微镜，它对普通光镜做了多方面的技术改
进，用激光做光源并采用了共聚焦技术消除了透镜的色差
和球差，运用点扫描技术，使标本上每一点的图像避免了
相邻点的衍射光和散射光的干扰，得到的共聚焦图像克服
了普通显微镜图像模糊的弱点，因而其图像高度清晰且数
字化［5］。研究显示相同标本激光扫描共聚焦获得图像比
普通荧光显微镜的清晰度高［6］。为了对比分析激光共聚
焦系统的三维重构成像及二维平面成像应用价值，本实验
通过激光扫描共聚焦显微镜扫描蒿草切片二维平面图像
作为对照组。另外本实验中采用 Leica 公司的蒿草切片
样品，具有结构分明，且荧光不易淬灭的特点，有利于成像
效果比较。
激光扫描共聚焦显微镜可以沿标本 Z 轴逐层扫描获
得标本相应光学横断面的 XY 平面图像，即“光学切片”。
通过相应的三维重建软件，可以原位地、直观地、精确地显
示标本的三维立体空间形态，并能够了解标本的空间结构
关系［7］。另外重建后高分辨率的三维图像，也可沿着 X、
Y、Z 轴旋转或其它任意角度显示［8］。本实验用激光扫描
共聚焦显微镜扫描蒿草切片所获得的 34 个连续“光学切
片”的图像再利用 LAS AF 软件垂直叠加重构的三维图
像，具有三维立体的特点，体现蒿草切片的空间结构关系，
在二维平面不能观察到的某些结构在三维图像中可以很
好地显示。实验结果荧光值统计显示三维图像比二维平
面图像荧光值增加，说明三维图像包含的信息量比二维平
面图像更多，三维图像通过多个“光学切片”的叠加，有效
地防止某些关键图像信息的丢失。另外本实验将重构的
三维图像沿 X轴旋转 45°显示，说明了三维图像可以通过
不同的角度显示，与相关研究一致［8］。
利用激光扫描共聚焦显微镜三维重建组织细胞的结
构是当今生物组织形态学研究的先进手段之一［9］。与二
维成像技术比较，三维重建技术的运用使我们能从组织细
胞的外表到内部结构和从平面到立体多个方面进行研究，
并可沿 X、Y、Z轴或其它任意角度显示，为生物组织形态
学研究开辟了新的途径和新的思路。
参考文献
［1］ CHEN G N，HUANG Z F，CHEN Ｒ，et al． Fluorescence spectra
and imaging of Platymonas subcordiformis via LSCM［J］． Guang
Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi，2009，29(9) :2330 － 2333．
［2］ 赵海强，盘 杰．量子点荧光技术标记口腔鳞癌细胞中 bax 的
应用研究［J］．现代医院，2011，11(5) :6 － 8．
［3］ 朱玉珍，符 达，刘黎黎，等．肝细胞癌中一种高通量二维细胞
识别技术方法的建立［J］． 世界华人消化杂志，2011，19(23) :
2455 － 2460．
［4］ SA Y，ZHANG Y，LI Ｒ，et al． WE － C － 217BCD － 05:A Novel
Interpolation Method for the 3D Ｒeconstruction of Cell Structures
［J］． Med Phys，2012，39(6) :3950．
［5］ HANＲAHAN O，HAＲＲIS J，EGAN C． Advanced microscopy:la-
ser scanning confocal microscopy［J］． Methods Mol Biol，2011，784
(20) :169 － 180．
［6］ 佘俊萍，张锡林，王光西，等．三种显微技术对人毛囊蠕形螨的
观察和研究［J］．四川动物，2011，30(1) :47 － 49．
［7］ ＲOTHEN － ＲUTISHAUSEＲ B，LEHMANN A D，CLIFT MJ，et al．
Laser scanning microscopy combined with image restoration to ana-
lyse a 3D model of the human epithelial airway barrier［J］． Swiss
Med Wkly，2010，140(26) :136 － 145．
［8］ INDHUMATHI C，CAI Y Y，GUAN Y Q，et al． Adaptive － weigh-
ted cubic B － spline using lookup tables for fast and efficient axial
resampling of 3D confocal microscopy images［J］． Microsc Ｒes
Tech，2012，75(1) :20 － 27．
［9］ POGOＲELOV A G，POGOＲELOVA V N． Quantitative tomography
of early mouse embryos:laser scanning microscopy and 3D recon-
struction［J］． J Microsc，2008，232(1) :36 － 43．
32现代医院 2013 年 7 月第 13 卷第 7 期 专业技术篇 Modern Hospital Jul 2013 Vol 13 No 7