全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(4)：439～442
Aeta Hordcultume Sl"mca
梨自花及异花授粉对其花柱 自发荧光的影响
徐国华 张绍铃 张超英2 陈迪新
( 南京农业大学园艺学院，南京 210095； 南京师范大学生命科学学院，南京 210097)
摘 要：利用激光共聚焦显微技术研究 了砂梨 (Pyrus serotina Rehd．)品种 ‘丰水 ’自花授粉和异花
(‘二十世纪’)授粉 16 h后花柱自发荧光的分布规律。发现未授粉花柱整体的自发荧光比较弱。但从柱头
端向子房端花柱自发荧光呈上升趋势；异花授粉和自花授粉后花柱整体的自发荧光都有所增加；授粉后自
发荧光变化最大的部位在柱头区域；自花授粉后 ，在柱头及距柱头 0～400／an范围内荧光值较高，其他区
域的荧光值相近；而异花授粉后在花柱的中部 (距柱头 1500～2050／an范围内)荧光值最低；自花授粉后
自发荧光除柱头以外主要分布在花柱的边缘区域 ；异花授粉后 自发荧光在花柱上半部的分布情况与自花授
粉类似，下半部分布相对均匀。
关键词：梨 ；自花授粉 ；异花授粉；花柱 ；自发荧光 ；激光共聚焦显微镜
中图分类号：S 661．2 文献标识码 ：A 文章编号：0513—353X(2003)04-0439—04
1 目的、材料与方法
梨 ( )是典型的配子体型自交不亲和性果树，目前虽然在梨 自交不亲和性基因的克隆⋯、
表达特性 J、产物的分离纯化及其功能的研究 ]等方面均取得了重大的进展 ，但是还不能完全解释自
交不亲和性的机理 J。植物 自交不亲和性是雌蕊与花粉相互识别、相互作用结果的综合表现 ，涉及植
物细胞间信息传递、细胞识别及花粉管的定向生长等过程。已有研究主要集中在自交不亲和性相关因
子对花粉萌发和花粉管伸长特性的影响方面 ]。而对于梨等木本果树在 自交不亲和性识别和反应过程
中花柱活体或半活体的生理变化研究极少。作者利用激光共聚焦显微镜对梨半活体花柱在白花及异花
授粉后的自发荧光进行了比较研究，从另一个侧面来直观地反映 白花与异花授粉后花柱各个部位的生
理变化，为研究配子体型自交不亲和性机理提供新的方法和手段。
以生产上主栽的已知 ．s基因型的砂梨 (尸 serotina Rehd．)品种 ‘丰水’(基因型 ．s ．s )和 ‘二
十世纪’(基因型 ．s2．s4)为试材。材料采自江苏省高邮市果树试验场梨园6年生树，于2002年 3月 1
日每品种各剪取长 60—8O cm的 2年生花枝 8条，每枝约有饱满花芽 1O 20个，带回室内插入盛有
5％蔗糖溶液的烧杯中 (溶液高度约 5 cm，每隔 2 d更换 1次糖溶液)，两个品种分放于两个光照培养
箱中，在光照 12 h、光强 60 panol·mI2·s～、20~C恒温下培养 15 d左右开始开花。先采取开花前 1 2
d的花蕾，取出花药，用透明纸包好后埋于硅胶内，室温下干燥 1—2 d即可散出花粉。选用花瓣即将
展开的大花蕾进行人工授粉后仍置于原培养箱中，不必套袋。设异花授粉：‘丰水’(早)X ‘二十世
纪’(舍)和白花授粉 ‘丰水’X ‘丰水’。授粉 16 h后，选取基本等长的已授粉花柱，用镊子将其
从紧挨子房端取下，立即置于配备 Zeis镜头的 BioRADTM MRC 1024ES激光共聚焦显微系统观察。将
花柱置于载物台上，依次从柱头开始向子房端分段观察 ，每段长度 550 pan左右。仪器沿花柱段的纵
切面从一侧至另一侧每隔2 pan自动扫描 1次，通过计算机采集图像数据。试验激发波长为488 nln。
收稿日期：2003—03—04；修回日期：2003—06—10
基金项目：国家自然科学基金项 目 (30170651，30270926)；国家高技术发展计划 (“863”)项 目 (2002AA241191)；高等学校博士
点基金项目 (20010307012)；江苏教育学院 “十五”科研重点资助项 目
*现工作单位：江苏教育学院生物系，南京 210013
**通讯作者．E．mail：nnzsl@sina．coln．cn
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园 艺 学 报 30卷
于 522 nrn波长采集图像。将扫描获得的系列图像储存于计算机中，然后通过 La．ser Sharp 3．2及 Confo．
cal Assistant 4．02激光共聚焦图像分析软件将每一段花柱的系列图像进行 “蒙太奇” (Montage)处理，
选取每段中荧光强度最强的一帧图像运用 Ad0b Photoshop 6．0进行像素 (pixe1)分析，统计荧光值。
以未授粉花柱作为对照，每个处理进行 3次重复。
2 结果分析与讨论
2．1 未授粉花柱的自发荧光值
未授粉 ‘丰水’花柱整体的自发荧光比较弱 (图版 1、2，限于篇幅，花柱中间部分的图像未给
出)，但是在靠近子房端存在一个明显的上升趋势，子房端的荧光值是柱头端的 3倍多 (图 1)。
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柱头stigma 0 400 400 950 950～1500 1500’2050 2050 2600 2600 3150 3150 3700 (Jan)
图 1 距柱头不同距离的花柱各部荧光强度值 (垂直线代表标准误)
Fig．1 Fluorescence value of each part of style(Vertical bars represent standard erors)
2．2 授粉后花柱的自发荧光值
与未授粉相比，授粉刺激 (包括花粉萌发和花粉管生长所引起的生理生化变化等)增强了柱头及
花柱的自发荧光，且无论是异花授粉 (图版，3—9)还是 白花授粉 (图版，lO—l6)后花柱整体的自
发荧光都发生了极大的变化 (图 1)。授粉后自发荧光变化最大的部位都在柱头及距柱头0 4O0脚 的
区域，异花授粉 (图版，3)和白花授粉 (图版，lO)柱头的荧光强度分别达到未授粉柱头 自发荧光
强度的 l3倍和9倍。而在靠近子房端花柱 自发荧光值因授粉与否的差异较小。以上试验结果表明，
授粉后柱头及花柱上部的强荧光可能与花粉刺激有关，无论是 白花授粉还是异花授粉，柱头上都发生
了剧烈的生理变化。
白花与异花授粉后花柱 自发荧光值也有一定差异，白花授粉后 ，除在柱头及距柱头 0 4O0脚 区
域 (图版，lO)的荧光值达到 74像素和 59像素外，其他区域 (图版，11 16)的荧光密度的绝对值
差异不大 ，荧光值基本上稳定于 24 28像素之间 (图 1)；而异花授粉后花柱 自发荧光发生了较大的
改变，柱头区及距柱头 0—4O0 左右区域的荧光值分别达到 96像素和94像素 (图版 ，3)，但是在
花柱的中部 (图版，6)荧光值最低，只有 l8像素 (图 1)，然后向着子房端荧光值又升至 4l像素。
同时我们从图 1可以看出，各种处理所得的数据的标准误较大，表明在同一段花柱中不同部位的荧光
强度变化较大，但是这种荧光分布的差异在 白花授粉和异花授粉后又有区别 ，白花授粉后 自发荧光除
柱头以外主要分布在花柱的边缘区域 (图版，11—13)，而异花授粉后花柱上半部 自发荧光的分布与
白花授粉时类似 (图版，4—9)，但是在花柱的后半段 (图版，7 9)自发荧光在整个花柱中表现比
较均匀。
白花授粉与异花授粉后花柱自发荧光的差异主要是从花柱的中部开始表现出来，因为从柱头到花
柱中部白花授粉与异花授粉的自发荧光都在较高的水平上 (与对照相比)下降，而从中部到子房端的
是白花授粉与异花授粉差异表现的区域 (尽管差异不够显著)。异花授粉时 自发荧光从中部开始恢复
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4期 徐国华等：梨 白花及异花授粉对其花柱 自发荧光的影响 441
上升，而自花授粉时 自发荧光未曾恢复上升状态；从中部到子房端荧光不均匀分布的差异与活体花柱
内白花花粉管在花柱的中部开始受到抑制的研究结果【 ， ]相符。
本研究的方法可为在活体／半活体条件下研究木本植物的自交不亲和性提供借鉴。以往离体条件
下的实验结果往往与生物活体中实际情况存在一定的偏差，离体研究的结果只有在活体中得到证实才
能够更加完善 。我们在试验中首次直观地在花柱中初步观察到了白花和异花授粉后花柱中出现不同
反应的区域 ，并为已有的生理及生化研究结果 I6]提供了直观的佐证。但是由于试验中发现花粉一旦
萌发之后自身原本就很低的自发荧光几近消失 ]，所以，本试验尚无法应用这种方法来直观地观察花
粉管到达的位置与花柱 自发荧光改变之间的关系。另外 ，本试验为延长取样时期和控制试验条件，剪
取带花芽的枝条在室内培养促进开花，可能与田间自然开花存在一定差异，这种差异对研究结果是否
产生影响还有待于进一步的研究。
参考文献：
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97 】03
The Variation of Style Auto-fluorescence after Self-and Cross-pollination in
serotina Rehd．
Xu Guohua ，Zhang Shaoling ，Zhang Chaoy~ng，and Chen Dixin
( Colege of Honicalture，Nanjing Agricultural University，Nanfing 210095，Ch／na； Colege of Ufe Science，Nanfing Normal
University，Ⅳn， ，lg 210097，Ch／na)
Abstract：The variations of style auto—fluorescence after self-and cn)ss—polination in 尸 岱 serot~na Rehd．
were studied with laser scanning confocal microscope(LSCM)．The polination combinations were as follows：
‘Housui’(S3S5)(旱)× ‘Housui’(舍)and‘Housui’× ‘Nijiseiki’(S2S4)． Ihe style auto-fluores—
cence increased after pollination and the most remarkable increases occurred in the stigma an d the a瑚 0—400 pm
down(total length of style is about 3700／nn)．After self-pollination．with a rapid decline of auto-fluorescence
from stigma to 950 tan down，there was almost no variation from 950 tan to the end of style． But a visible climbing
of auto-fluorescence can be detected from 950 tan to the end of style after cro~s—po lination． Results also showed
that there were diferences of style auto—fluorescence distribution between self-and cIDss—po lination treatments．AⅡ
treatments proved that in the upper half of the style the auto—fluorescence in the parietal part was stronger than that
in the middle part and so did that in the lower part after self-polina tion． But after cn)ss—polination the au to-fluo—
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rescence was relatively evenly distributed in the lower half of the style．All above indicated that，with LSCM ，visi-
ble changes in the style after various polination treatments Can be detected and thus another method to study the
self-incompatibility in vivo or senti in vivo Can be established．
Key words： serotiruz Rehd．； Self-pollination； Cross-pollination； Style； Auto—fluorescence； Laser
scanning confocal microscope
图版说明：花柱各部分的自发荧光图 1．授粉前柱头及其下0～4O0 tm花柱；2．授粉前花柱近子房端；3～9．异花授粉后花柱各
部 (3．柱头及柱头下 0～4O0tLm；4．距柱头 4O0～950胛 ；5．950～1500／an；6．1500～2050／an；7．2050～2600／an；8．260O～3150
m；9．3150 3700 m)；l0～16．白花授粉后花柱各部 (10．柱头及柱头下 0～400／xm；11．距柱头 400～950 ／xm；12．950～1500
m；13．1500 2050／xm；14．2050～2600 ；15．2600 3150／an；16．3150～3700／an)。箭头所示为未萌发花粉。
Explanation of plates：The auto-fluorescence of each part of style 1．Unpolinated stigma and 0—4O0／an down；2．Style aajacent to ovary；
3—9．Auto-fluore~enee of each part of style after cross．polination (3．Stigma and 0—4O0／an down ；4．4O0—950 ／an；5．950 —1500／an；
6．1500—2050f￡in；7．2050—2600 Irl；8．2600—3150／xm；9．3150—3700／xm)；l0—16．Auto-fluorescence of each part of style after self-
polination (10．Stiletto and 0—4OO I13 down ； 11 4O0—950 m；12 950— 1500／xm；13．1500—2050／an；14．2050—260O／an；
15．2600—3150￡urn；16．3150—3700 barn)．AITOWS pointtothepollen grain．
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