全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (1) : 20～24
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 03 - 36; 修回日期 : 2004 - 05 - 25
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2003AA625010; 2002AA245131)
壳寡糖与草莓细胞结合过程的研究
赵小明 1, 2 　于炜婷 1 　白雪芳 1 　李　伟 1 　杜昱光 1 　梁鑫淼 1
(1 中国科学院大连化学物理研究所 , 大连 116023; 2 西北农林科技大学植物保护学院 , 杨凌 712100)
摘 　要 : 壳寡糖是一类能有效的诱导植物抗病性的重要激发子。本研究用 2 - 氨基吖啶酮 (22AMAC)
标记壳寡糖 , 应用激光共聚焦显微成像技术 , 研究了壳寡糖与草莓细胞结合过程。结果表明壳寡糖能通过
草莓细胞壁与细胞膜结合 , 在细胞壁和细胞膜上有其结合位点 , 与壳寡糖的结合具有专一性。
关键词 : 壳寡糖 ; 草莓 ; 结合位点 ; 激光共聚焦显微镜
中图分类号 : Q 533; S 66814　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120020205
B ind ing Process of O ligoch itosan to Strawberry Cells
Zhao Xiaom ing1, 2 , Yu W eiting1 , Bai Xuefang1 , L iW ei1 , Du Yuguang1 , and L iang Xinm iao1
(1 D alian Institu te of Chem ica l Physics, Chinese A cadem y of Sciences, D alian 116023, China; 2 College of P lan t Protection,
N orthw est Sci2Tech U niversity of A gricu lture and Forestry, Yangling 712100, China)
Abstract: O ligochitosan is an important elicitor that can induce resistance of p lants against pathogens.
The p rocess and sites of oligochitosan binding to strawberry cells were investigated by the treatment of using
labeled oligochitosan with fluorophore 22am inoacidone and detecting the em ission fluorescence by a laser scan2
ning confocal m icroscopy (LSCM ). O ligochitosan can bind to membrane of strawberry p rotop lasts and cell
walls in few m inutes. the results indicated that p rotop lastsmembrane and cellwalls are the main binding of ol2
igochitosan. The binding of oligochitosan to binding sites is special.
Key words: O ligochitosan; Strawberry; B inding site; Laser scanning confocal m icroscopy
激发子能激发植物产生一系列防御反应 , 从而减轻病原菌的危害。这种防御反应包括诱导产生植
保素 , 蛋白酶抑制剂、水解酶 (如几丁质酶、β2103葡聚糖酶等 ) , 胞壁糖蛋白和木质化〔1～3〕。有研
究表明 , 激发子在植物细胞上的结合位点位于细胞膜上 , 结合位点具有高亲和性、专一性及饱和
性〔4～6〕。研究最清楚的激发子是来源于植物病原真菌菌丝细胞壁的葡聚寡糖 , M ithÊfer等应用同位素
标记及光亲和层析技术分析了葡聚寡糖在大豆细胞膜上的结合位点。该位点是 75 kDa的结合蛋
白〔7, 8〕。
几丁质是除卵菌纲真菌以外其他真菌细胞壁的主要成分 , 真菌细胞壁的几丁质可被植物细胞的几
丁质酶酶解 , 释放出可溶性的几丁寡糖激发子。几丁寡糖可以引起小麦叶片木质化〔9〕, 诱导水稻悬
浮细胞产生植保素〔10〕。Day等研究了几丁寡糖在大豆细胞膜上的结合位点是 85 kDa的蛋白质 , 并对
其亲和性、专一性进行了研究〔11〕。Shibuya等应用同位素标记研究了水稻细胞膜上几丁寡糖的结合位
点具有受体的特性〔12〕。
壳寡糖是脱乙酰基几丁质经酶解后制备的氨基葡萄糖。它可以诱导大豆、欧芹、番茄及豌豆等植
物产生植保素、胼胝质及蛋白酶抑制剂〔12〕。还有报道壳寡糖诱导棉花、草莓细胞活性氧的产生 ; 烟
草几丁质酶、β2103 -葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶的活性 ; 作物对病毒的抗性等〔13～16〕。但有关壳寡糖
激发子结合位点及细胞的整体结合情况的研究很少。本试验对壳寡糖进行荧光标记 , 应用激光共聚焦
显微技术研究了壳寡糖与草莓细胞的结合过程及在细胞上的结合位点。
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　1期 赵小明等 : 壳寡糖与草莓细胞结合过程的研究 　
1　材料与方法
1　材料
草莓 ( F ragaria ananassa‘shikinari’) 组织培养细胞由本研究室提供。以 MS固体培养基培养 ,
温度 25℃, 光照 12 h·d - 1 , 光照强度 1500 lx, 每 20 d继代培养 1次。所用细胞继代培养 30代以上。
壳寡糖以张虎等报道的方法 , 经酶降解过膜获得 , 聚合度 (DP) 3～10〔17〕。寡聚半乳糖醛酸由本实
验室自制 , 聚合度 2～10。2 - 氨基吖啶酮 (22AMAC)、NaCNBH3和半纤维素酶购自 Sigma公司。果
胶酶购自 Serva公司 , 纤维素酶 R s、纤维素酶 R210及离析酶购自 Yakult Honsha公司。其他试剂市
购 , 为分析纯级。
112　方法
11211　22AMAC标记壳寡糖 　参照 Okafo等〔18〕及 Jackson等〔19〕的方法 , 并略有改进。10 mg壳寡糖放
入 115 mL离心管中 , 加入 100μL 1 mol·L - 1的 NaCNBH3溶液 , 震荡使壳寡糖溶解 , 然后加入 3
μL 011 moL·L - 1 22AMAC冰醋酸 ∶DMSO ( 3∶17, V ∶V ) 溶液混匀 , 黑暗条件下 90℃水浴反应 40
m in后 , 放入冰中 , - 20℃中止反应。向中止反应后的离心管中加入四氢呋喃溶液萃取未反应游离的
22AMAC, 10000 ×g, 4℃条件下离心 15 m in, 收集沉淀物 , 萃取 4次 , 沉淀物在室温下干燥后 , 用
500μL二甲基亚砜∶重蒸水 ( 1∶1) 溶解 , 遮光在 - 20℃下保存。分光光度计 ( JENWAY 6505 UV /
V is1U1K1) 扫描 (200～800 nm ) 检测萃取效果。薄层层析法检测标记壳寡糖的纯度。
11212　壳寡糖与草莓细胞结合检测 　原生质体的制备及与壳寡糖结合观察参照王喆之等〔20〕的方法。
将 2 g草莓愈伤组织细胞加入 10 mL酶液中 (1%果胶酶、017 mmol·L - 1 KH2 PO4、pH 518) 酶解 12
h, 再加入 3%纤维素酶 R210, 1%果胶酶 , 012%离析酶 , 015%半纤维素酶 , 1%纤维素酶 R s, 011%
MES, 014 mol·L - 1甘露醇 , 100μg·L - 1 KH2 PO4 , CaCl2 11320 g·L - 1的酶液 , 在 30℃下酶解 8～10
h。酶解后的悬浮液用 400目网筛过滤 , 滤液经两次离心 ( 12 ×g, 5 m in) 洗涤 , 收集原生质体。
用洗涤介质 (0145 mol·L - 1甘露醇、017 mmol·L - 1 KH2 PO4、215 mmol·L - 1 Ca2 + , 011% 22N -
吗啡啉乙磺酸 ) 将原生质体密度调到 105 ·mL - 1 , 取 150μL原生质体液放入离心管 , 加入 1μL标
记壳寡糖溶液 , 25℃黑暗下结合 5～30 m in, 用洗涤介质 3次洗涤 , 取出原生质体液体滴在载玻片
上 , 在激光共聚焦显微镜 (Leica SP2型 ) 下观察 , 激发光波长 450 nm , 发射光波长 520 nm进行
扫描。
取草莓愈伤组织细胞用洗涤介质搅拌分散 , 用洗涤介质将细胞密度调到 105 ·mL - 1 , 取 150μL
细胞液放入离心管 , 然后加入 1μL标记壳寡糖溶液混匀 , 立即取出 50μL混合液滴在载玻片上 , 在
激光共聚焦显微镜下进行草莓细胞与壳寡糖结合观察并扫描。剩余液体在在 25℃黑暗下结合 5～30
m in, 用洗涤介质 3次洗涤后 , 观察扫描。
用 1133 ×10 - 2、1133 ×10 - 3和 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1未标记壳寡糖和寡聚半乳糖醛酸预处理草莓
细胞及原生质体 , 用洗涤液漂洗 3次 , 用标记的寡糖进行结合 , 洗涤液漂洗后 , 观察扫描标记寡糖与
细胞及原生质体结合竞争性。
2　结果与分析
211　22AM AC标记壳寡糖
经分光光度计扫描 , 寡糖与 22AMAC混合反应液经四氢呋喃溶液 4次萃取后 , 上清液在 295～
305 nm和 445 nm处没有吸收峰 , 而标记壳寡糖溶解后在 295～305 nm及 445 nm处有吸收率 , 表明标
记壳寡糖中没有游离的 22AMAC, 壳寡糖已与 22AMAC结合。标记的壳寡糖黑暗下干燥后 , 用 500
μL二甲基亚砜 ∶重蒸水 ( 1∶1 ) 溶解后 , 用高效薄层层析板 ( TLC PLT SIL ICA GEL 60F2250274
RGHT, 购于德国 E. Merck) 进行薄层层析 ( TLC) , 展开剂氯仿 ∶甲醇 ( 1∶1) , 展开后在紫外反
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
射投射仪下观察照相。结果证实壳寡糖与 22AMAC结合 , 且结合 22AMAC的壳寡糖中没有游离的
22AMAC存在。
212　壳寡糖与草莓细胞结合
21211　壳寡糖与草莓细胞结合动态过程 　洗涤介质使草莓细胞发生质壁分离 , 容易观察壳寡糖与细
胞膜的结合情况。壳寡糖处理不同时间的细胞扫描结果表明 , 壳寡糖与草莓细胞结合开始时 , 壳寡糖
主要聚集在细胞壁上 , 2 m in时在细胞壁上被标记的壳寡糖较多 , 胞内较少 , 原生质体膜上结合壳寡
糖不明显。随着时间的延长 , 寡糖进入细胞增多 , 与细胞膜结合 , 细胞膜上的荧光强度逐渐增强 ; 10
m in时围绕原生质体膜形成明亮的绿色荧光圈。结果 (图版 , 1～3) 表明 : 壳寡糖能在几分钟内穿过
细胞壁进入细胞 , 并与膜结合 , 激发一系列防御反应。
21212　壳寡糖结合草莓细胞竞争性　应用未标记的壳寡糖及寡聚半乳糖醛酸预处理草莓细胞 , 然后
加入标记的壳寡糖 , 观察扫描。结果表明 (图版 , 4～7) , 未标记的壳寡糖对标记的壳寡糖结合草莓
细胞有竞争作用。竞争力与未标记壳寡糖浓度有关 , 未标记壳寡糖浓度为 1133 ×10 - 2和 1133 ×10 - 3
mg·μL - 1处理后 , 标记的壳寡糖与细胞没有结合 , 即细胞上无荧光表现 (图版 , 5)。1133 ×10 - 4 mg
·μL - 1未标记壳寡糖处理后 , 细胞能结合微量的标记壳寡糖 (图版 , 6)。寡聚半乳糖醛酸对壳寡糖
与细胞结合没有竞争性 (图版 , 7) , 试验所用上述 3种浓度处理均未表现对壳寡糖结合细胞的影响。
这表明壳寡糖与草莓细胞的结合是专一性的 , 草莓的细胞壁和原生质体膜均能与壳寡糖结合 , 表明细
胞壁和原生质体膜有壳寡糖的结合位点。
213　壳寡糖结合草莓细胞原生质体及壳寡糖的竞争性
制备的原生质体与标记壳寡糖结合 , 在试验中发现标记的壳寡糖 5 m in即可与原生质体结合 , 试
验结果进一步证明壳寡糖结合位点主要在原生质体膜上 , 与壳寡糖的结合具有专一性 (图版 , 8～
11)。未标记壳寡糖能竞争标记壳寡糖与原生质体结合 , 浓度大的竞争力大。1133 ×10 - 2、1133 ×
10 - 3和 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1未标记的壳寡糖分别处理原生质体 , 对标记壳寡糖 (1133 ×10 - 4 mg·
μL - 1 ) 结合原生质体有很大抑制作用。前两个处理加入标记壳寡糖 , 看不到结合荧光物的原生质体 ,
而 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1未标记壳寡糖处理后 , 能看到微弱的荧光 (图版 , 9) , 表明原生质体只结合
少量的标记壳寡糖。寡聚半乳糖醛酸对壳寡糖与原生质体结合没有竞争作用 (图版 , 10, 11) , 其浓
度大小不影响壳寡糖与原生质体结合。说明草莓原生质体对壳寡糖的结合具有专一性。
3　讨论
寡糖能激发植物一系列防御反应 , 激发抗性表达的关键是植物能识别寡糖 , 识别是通过细胞膜上
与寡糖结合的受体或结合位点完成〔12〕。对于壳寡糖在植物细胞上的结合位点还未见报道 , 壳寡糖能
否进入植物细胞没有直接证据。
Mathieu等〔21〕报道了寡聚半乳糖醛酸 (oligogalacturonides) 是以离子键结合在烟草细胞壁上。几
丁寡糖、壳聚糖及葡聚寡糖的结合位点是在植物细胞膜上〔5, 12〕, 已有的报道是以研碎植物细胞 , 提取
细胞膜为材料进行研究 , 没有对完整细胞进行结合试验。本文的结果表明 , 壳寡糖能迅速进入草莓细
胞与胞壁上及原生质膜结合 , 这种结合具有专一性。
过去研究激发子结合位点都是用同位素标记 , 存在一定的不安全性 , 试验需要在特殊条件下进
行。本研究用荧光标记的壳寡糖为材料 , 采用激光共聚焦显微技术进行 , 安全、技术简便易行 , 在细
胞及原生质体水平显示了壳寡糖结合位点 , 结果直观。
壳寡糖可与草莓细胞壁结合 , 说明细胞壁不单纯是保护细胞的组织 , 也可能参与激发子激发细胞
防御反应的过程 , 但具体参与那一环节及与细胞膜上结合位点的关系尚有待进一步研究。
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　1期 赵小明等 : 壳寡糖与草莓细胞结合过程的研究 　
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图版说明 : 1: 2 m in时壳寡糖与细胞的结合情况 ; 2: 10 m in时壳寡糖与细胞的结合情况 ; 3: 可见光下草莓细胞 ; 4: 1133 ×10 - 4 mg
·μL - 1标记壳寡糖结合细胞荧光照片 ; 5: 1133 ×10 - 2 mg·μL - 1未标记壳寡糖竞争后细胞荧光照片 ; 6: 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1未标
记壳寡糖竞争后细胞荧光 , 7: 1133 ×10 - 2 mg·μL - 1寡聚半乳糖醛酸糖竞争后细胞荧光 ; 8: 结合标记壳寡糖的草莓原生质体 ; 9:
1133 ×10 - 4 mg·μL - 1未标记壳寡糖竞争后原生质体荧光 ; 10: 1133 ×10 - 2 mg·μL - 1未标记寡聚半乳糖醛酸竞争后原生质体荧光 ;
11: 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1未标记寡聚半乳糖醛酸竞争后原生质体荧光。
Explana tion of pla tes: 1: The binding of 22AMAC2oligochitosan to strawberry cells in 2 m in; 2: The binding of 22AMAC2oligochitosan to straw2
berry cells in 10 m in; 3: B right2field image of strawberry cells; 4: B inding with 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1 22AMAC2oligochitosan; 5: Pretreated
with 1133 ×10 - 2 mg·μL - 1 unlabeled oligochitosan before binding with 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1 22AMAC2oligochitosan; 6: Pretreated with
1133 ×10 - 4 mg·μL - 1 unlabeled oligochitosan before binding with 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1 22AMAC2oligochitosan; 7: Pretreated with 1133 ×
10 - 2 mg·μL - 1 unlabeled oligogalaturonide before binding with 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1 22AMAC2oligochitosan; 8: B inding with 1133 ×10 - 4
mg·μL - 1 22AMAC2oligochitosan; 9: p retreated with 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1 unlabeled oligochitosan before binding with 1133 ×10 - 4 mg·
μL - 1 22AMAC2oligochitosan; 10: Pretreated with 1133 ×10 - 2 mg·μL - 1 unlabeled oligogalaturonide before binding with 1133 ×10 - 4 mg·
μL - 1 22AMAC2oligochitosan; 11: Pretreated with 1133 ×10 - 4 mg·μL - 1 unlabeled oligogalaturonide before binding with 1133 ×10 - 4 mg·
μL - 1 22AMAC2oligochitosan.
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