全 文 ：·研究简报·
原生质体紫外诱变选育姬松茸新菌株
张　卉1 ,李长彪2 ,陈明波2 ,刘长江2
(1.沈阳化工学院 环境与生物工程学院 ,辽宁沈阳　110142;2.沈阳农业大学食品学院 ,辽宁 沈阳　110161)
摘　要　对姬松茸原生质体进行紫外诱变处理 , 选育出在液体培养条件下生物量明显高于原始菌株的诱变
株 。经 10 代传代培养及摇瓶培养 ,表明该菌株稳定性良好 , 与出发菌株相比生物量提高 5.5 %, 胞外多糖产
量提高 6.1 %。
关键词　姬松茸;原生质体;紫外诱变
中图分类号　S646-1+1　　　文献标识码　B　　　文章编号　1005-7021(2004)06-0056-02
　　姬松茸(Agaricus blazei Murr.)是近 10 a 传
入我国的珍稀食药兼用真菌 ,因其含有丰富的多
糖 、核酸等生理活性物质而引起广泛的关注 。本
文在研究姬松茸原生质体释放 、再生的基础上 ,进
行了姬松茸高生物量和高胞外多糖含量菌株的原
生质体紫外诱变选育 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1 　菌株 　姬松茸 , 购于福建三明真菌研
究所 。
1.1.2　培养基　斜面培养基:PSA;液体培养基:
PSA 不加琼脂;原生质体再生培养基:YMP ,
0.6 mol/L蔗糖为渗透压稳定剂 。
1.2　方法
1.2.1　原生质体制备与纯化　①菌丝培养:新鲜
斜面菌种接种于液体培养基中 ,25 ℃培养 7 d;以
此为液体种子再接种于 PSA 液体培养基中 ,培养
3 ～ 4 d。 ②原生质体制备与纯化:将液体培养的
菌丝过滤 ,依次用无菌水和 0.6 mol/L 蔗糖高渗
缓冲液洗涤 ,再用灭菌的滤纸吸去水分 ,称取菌丝
重量 。将溶壁酶 、蜗牛酶和纤维素酶溶解于
0.6 mol/L蔗糖高渗缓冲液中 , 0.45 μm 微孔滤膜
过滤除菌 。按照 100 mg 菌丝/mL 酶液的比例将
菌丝酶解 2.5 h ,然后用双层擦镜纸过滤 ,滤液于
1 000 r/min离心 10 min ,弃上清液 , 加入 10 mL
渗透压稳定剂缓冲液 ,血球计数板计数 。
1.2.2　原生质体紫外诱变处理　诱变前 ,先打开
15 W 石英紫外光管预热 20 ～ 30 min 以稳定光
波。将制备好的原生质体浓度调整至 1×105 个/
mL ,取 0.2 mL 涂皿 。距离紫外灯 30 cm 照射
0 ～ 300 s。然后黑暗避光于 25 ℃恒温培养 ,待平
板长出菌落后 ,记数 ,并计算原生质体紫外诱变的
半致死剂量 。
1.2.3　生物量测定　摇瓶培养后的发酵液以尼
龙布过滤收集菌丝体 , 并用蒸馏水冲洗 3 次 ,
60 ℃烘至恒重 ,称量 。
1.2.4　胞外多糖的测定　取上述发酵滤液 ,缓缓
加入 3 倍体积的无水冷乙醇 , 置于 4 ℃醇析
12 h ,10 000 r/min离心 5 min;弃上清液 ,沉淀用
75 %乙醇洗涤 2 次 ,离心 , 沉淀用 60 ℃热水溶
解 , 6 000 r/min离心 10 min , 上清液定容至
50 mL ,以葡萄糖为标准品 ,苯酚-硫酸法检测。
2　结　果
2.1　姬松茸原生质体诱变效应曲线及诱变剂量
的选择
将涂有新鲜制备原生质体的平皿 3 个一组分
别照射 0 ,5 ,15 , 30 ,60 ,90 ,120 ,150 ,180 , 300 s ,然
后暗处培养 ,菌落计数 。以每组平皿再生菌落数
的平均值作为纵座标 ,以照射时间为横座标 ,作出
姬松茸原生质体紫外诱变的剂量效应曲线
(图 1)。
图 1　姬松茸原生质体紫外照射剂量响应曲线
收稿日期:2003-03-22
作者简介:张卉　女 ,博士研究生。主要从事食品生物技术 、生物活性物质方面研究。
56 微生物学杂志 2004年 11月第 24卷第 6期　JOURNAL OF MICROBIOLOGY Nov.2004 Vol.24 No.6
　　由图 1 可见 ,姬松茸原生质体经紫外照射后
随照射时间的增加 ,再生率下降;0 ～ 25 s范围内 ,
曲线下降剧烈;25 s以后 ,曲线下降趋于平缓 。按
图 1 计算出姬松茸原生质体半致死剂量约为 25
s。又根据大量研究结果:致死率在 70 %～ 80 %
时 ,发生正向突变的几率高。由图 1 可知 ,致死
率为 75 %时 ,照射时间约为 60 s ,取此剂量进行
5批诱变 。
2.2　姬松茸原生质体诱变株的筛选
根据菌丝长势挑取再生株 100 株 ,经 5 次传
代培养 ,再根据固体培养基上线性生长速度 、菌丝
浓度选取 20株再传代 5 次 ,选取稳定性良好的 5
株进行液态培养条件下生物量和胞外多糖的测
定 ,结果见表 1。
　　由表 1 可见 ,筛选出的 5 株诱变株的生物量
和胞外多糖产量比出发菌株高或相近。其中诱变
株Ab-UV39的 2 项指标均高于出发菌株 ,生物
量提高 5.5 %,胞外多糖产量提高 6.1 %。将诱
变株Ab-UV39 进行多次传代 , 其生物量及胞外
多糖产量稳定性均良好。经过拮抗试验和同工酶
电泳分析 ,表明 Ab-UV39是与出发菌株不同 ,但
有亲源关系的新菌株 。
　表 1　姬松茸诱变株的生物量及胞外多糖产量
　Table 1　Biomass and exopolysaccharides yield
　　　　　of Agaricus blazei Murr.
菌株　　 生物量/(g/ L) 胞外多糖产量/(g/ L)
Ab-1 12.1 0.98
Ab-UV1 13.0 0.78
Ab-UV17 12.0 0.59
Ab-UV19 10.3 0.60
Ab-UV39 12.77 1.05
Ab-UV64 9.96 1.03
　注:以上数据获得条件为摇瓶液体培养 7 d
3　讨　论
　　姬松茸原生质体对紫外线较敏感 ,因此利用
原生质体诱变技术可以对该菌进行选育 ,以达到
提高次生代谢产物产量的目的 。近年来的研究表
明 ,较低致死剂量的诱变处理发生正向突变的几
率较大 ,本研究结果也证明了此观点 。对于高次
生代谢产物产量菌株的筛选较繁琐 ,有些诱变初
始性状好的菌株退化严重。针对此问题 ,可用菌
丝长速作为初筛指标 ,再经传代培养选取变异稳
定的菌株 ,再以目的产物为最终筛选标准。
参　考　文　献
[ 1] 　李刚 ,杨凡.原生质体紫外诱变选育灵芝新菌种的研究[ J] .
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[ 2] 　刘士旺 ,梁忠琦.羊肚菌原生质体诱变筛选高生物量高氨基
酸含量菌株[ J] .菌物系统 , 1999 , 18(2):168～ 171.
[ 3] 　Lee Jae Sung Release , Regeneration and M utant Induct ion of
P leurotus cornusopiae (Tamogitake)Protoplast s[ J] .Agric.Bi-
ol.Chem , 1988 , 52(7):1877～ 1878.
Mutagenesis Breeding New Strain of Jisongrong mushroom
(Agaricus blazei)by UV
ZHANG Hui
1 , LI Changbiao2 ,CHEN Mingbo2 , LIU Changjiang2
(1.Coll.of Environm.&Biol.Eng.Shenyang Coll.of Chem.Ind., Shengyang 110142;
2.Coll.Food Sci.Shenyang Agric.Univ.Shenyang 110161)
Abstract　Protoplast of jisongrong mushroom(Agaricus blazei)was mutagenesis treated with UV , and a mutant strain
that its biomass and exo-poly saccharide-yielding apparent higher than its o riginal strain in liquid culture w as bred.It has good
stability after transferring for ten generations and cultures in shaker.As compared with the star ting strain the biomass increased
by 5.5%, and exo-poly saccharide increased by 6.1%.
Keywords　jisongrong mushroom (Agaricus blazei), pro toplast , UV mutagenesis.
　　(上接 50页)
Study on Extremozymes
LIU Aimin1 , 2 ,HUANG Weiyi1
(1.Coll.of Li fe Sci.Anhui Normal Univ.Wuhu 241000;2.Coll.of Life S ci.Nanjing Agric.Univ.Nanjing 210095)
Abstract　New advance in researches of extermozymes is expounded through their catego ry , functional mechanism , and
application prospect in this paper.
Keywords　ex termozymes , functional mechanism , application prospects.
576期　　　　　　　　　　　　　　　　张卉等:原生质体紫外诱变选育姬松茸新菌株