全 文 ：江汉大学学报（自然科学版） 总第 41卷
藜 豆（Stizolobium cochinchinensis）（2X=2N=
22），别名猫豆、狗爪豆等，属豆科藜豆属一年生
草质藤本植物，具有食用［1］、药用［2］、家畜饲料［2］
等多种用途。 该种原产于热带及亚热带地区，在
我国的分布区域包括广东、海南、广西、四川、贵
州、湖北和台湾等省区。前人对藜豆的研究主要
集中在栽培生理及左旋多巴含量、提取方法等方
面［3-4］，而对其遗传多样性方面的研究鲜见报道。
分子标记是分析种质遗传多样性的有效手
段［5-7］，与形态学、细胞学和蛋白质标记相比较，
分子标记直接以核酸作为研究对象，在植物体的
各个组织、各个发育时期均可检测，不受发育阶
段、环境限制，方法可靠，揭示多态性水平高［8］。
ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，简单重复序
列区间）是 1994年由加拿大蒙特利尔大学的 Ziet⁃
kiewicz等［9］在微卫星分子标记基础上发展起来的
一种分子标记技术，结合了 RADP和 SSR的优
点，具有多态性高、重复性好、显性标记、成本较
低、模板用量少等特点。目前，该技术广泛应用
于农作物［10］、蔬菜［11］、果树［12］、牧草［13］等植物的
遗传多样性、亲缘关系、遗传作图、基因定位等
方面的研究。
本研究利用 ISSR标记对 9份藜豆种质资源进
行遗传多样性分析，对相应资源建立特异性的指
纹图谱，以期为科学合理地保护和利用藜豆种质
资源提供理论依据和技术支持，为利用分子标记
辅助育种手段培育藜豆新品种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
9 份 藜 豆 种 质 资 源 LD-1、LD-2、LD-3、
LD-4、LD-5、LD-6、LD-7、LD-8、LD-9（分别记
为 1、2、3、4、5、6、7、8、9）作为本研究的试验
材料，其来源及主要性状列于表 1。对 9份藜豆
种质资源进行穴盘育苗，待幼苗长至 2片真叶
时，每份材料随即选取 5株取其嫩叶备用。
1.2 DNA提取
采用改良的 CTAB 法［14］提取藜豆基因组
DNA。经 2%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计
检测其质量和浓度后，置于-70 ℃冰箱保存备用。
1.3 PCR扩增及检测
根据加拿大哥伦比亚大学公布的 ISSR引物
序列，由金斯瑞生物科技有限公司合成。利用优
化的 PCR反应体系从 35条 ISSR引物中筛选出扩
第 41卷 第 6期2013年 12月 江汉大学学报（自然科学版）J. Jianghan Univ. Nat. Sci. Ed. Vol.41 No.6Dec. 2013
藜豆种质资源遗传多样性的 ISSR分子标记分析
张凤银，戴希刚，潘 磊
（江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056）
摘 要：利用 ISSR标记构建了 9份藜豆种质的指纹图谱，并对其遗传多样性进行评价。结果表明，从
35条引物中筛选出 8条重复性好的多态性引物进行 PCR扩增，共扩增出 64条带，其中多态性条带 50条，
多态性比例为 78. 1%。应用其中 3条多态性 ISSR引物（UBC889、UBC812、UBC825）的 12条特异性条带，可
以有效区分供试的 9份藜豆种质资源。藜豆种质间的遗传相似系数变化范围在 0. 47～0. 97之间。利用
UPGMA聚类分析，在相似性系数为 0. 73处可将 9个藜豆种质资源划分为 3个类群，其亲缘关系与种质地
理来源之间存在一定关联性。
关键词：藜豆；种质资源；遗传多样性；ISSR；相似系数；聚类分析
中图分类号：S643.9 文献标志码：A 文章编号：1673-0143（2013）06-0100-05
收稿日期：2013－09－22
基金项目：湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心开放基金项目（2012-01）；武汉市科技攻关计划项目
（201120822281）；武汉市科技攻关计划项目（2013021001010478）
作者简介：张凤银（1964—），女，副教授，研究方向：园艺植物遗传育种。
2013年第 6期
增条带清晰、多态性强和重复性好的 8条 ISSR引
物（表 2）。基于 8条多态性 ISSR引物分别对 9份
藜豆材料进行 PCR扩增。25 μL反应体系中各反
应物含量为：20 ng模板 DNA，2μL 10 × Buffer，
1U Taq DNA 聚合酶，0.4 μM 引物，0.20 mM
dNTPs. PCR扩增在 PTC-100TM（Bio-Rad，USA）
PCR仪上进行，采用 touchdown扩增程序：94 ℃预
变性 5 min，然后进行下列循环：94 ℃变性 30 s，
最佳退火温度下复性 30 s，72 ℃延伸 1 min，35个
循环，最后于 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。扩增
产物采用 2. 0%琼脂糖凝胶电泳（TBE 电泳缓
冲液，0. 5 μg/L EB）检测，在 80 V恒压下电泳约
1 h，用 DL2000 DNA Marker（北京鼎国昌盛生物
技术有限责任公司）作分子量标准，在凝胶成像
系统仪中拍照记录电泳图谱。
种质资源
LD-1
LD-2
LD-3
LD-4
LD-5
LD-6
LD-7
LD-8
LD-9
来源
广西东兰县
广西东兰县
广西富川瑶族自治县
广西富川瑶族自治县
四川资中县
广东罗定县
广东罗定县
广西东兰县
广东罗定县
主要性状
早熟，分枝较强，白花，荚绿色、扁形、茸毛较硬，花籽
早熟，分枝较强，白花，荚绿色、扁形、茸毛较硬，灰籽
晚熟，分枝较强，白花，荚绿色、扁形、茸毛硬，浅灰籽
极早熟，分枝较强，白花，荚黄绿色、扁形、茸毛软，黑花籽
晚熟，分枝强，白花，荚深绿色、扁形、茸毛硬，黑籽
晚熟，分枝较强，白花，荚黄绿色、扁形、茸毛软，灰籽
极晚熟，分枝较强，白花，荚黄绿色、扁形、茸毛软，黑花籽
中熟，分枝较强，白花，荚绿色、扁形、茸毛较硬，花籽
中熟，分枝较强，紫花，荚绿色、扁形、茸毛较硬，花籽
表 1 供试藜豆种质材料来源及其主要性状
引物编号
UBC807
UBC808
UBC810
UBC812
UBC825
UBC889
UBC873
UBC 891
总计
引物序列
AGA GAG AGA GAG AGA GT
AGA GAG AGA GAG AGA GC
GAG AGA GAG AGA GAG AT
GAG AGA GAG AGA GAG AA
ACA CAC ACA CAC ACA CT
DBD ACA CAC ACA CAC AC
GAC AGA CAG ACA GAC A
HVH TGT GTG TGT GTG TG
退火温度/℃
54
49
55
52
54
54
56
53
扩增条带数/条
11
4
8
6
10
12
7
6
64
多态性条带/条
9
2
6
4
10
9
6
4
50
多态性比率/%
81. 8
50. 0
75. 0
66. 7
100
75. 0
85. 7
66. 7
78. 1
表 2 ISSR引物序列及多态性分析
1.4 数据处理与指标计算
选取清晰 ISSR电泳图谱，采用 0/1赋值记
带，有带的记为 1，无带或弥散的条带记为 0，汇
总建立 0/1 矩阵数据库。利用 NTSYS-pc 2.10
软件统计 ISSR数据的遗传相似系数（GS），用
UPMGA法进行聚类分析并绘出聚类图。
2 结果与分析
2.1 藜豆种质资源 ISSR 遗传多样性分析
从 35条 ISSR引物中筛选出能够产生稳定、
清晰多态性扩增条带的 8条引物进行分析（表 2），
PCR扩增结果见图 1。基于这 8条多态性 ISSR引
物在 9份藜豆资源材料中共扩增出 64个条带，平
均每条引物扩增的条带数为 8 条，其中引物
UBC889扩增的条带数最多，为 12条，而引物
UBC808扩增的条带数最少，只有 4条。在所获得
的 64个条带中多态性条带有 50条，其多态性比
率为 78. 1%，其中引物 UBC825的多态性比率最
高为 100%，而引物 UBC808的多态比率最低，仅
有 50%。
2.2 供试种质的指纹图谱
电泳结果表明，不同 ISSR引物在供试的 9份
藜豆种质资源之间检测到不同的分子指纹图谱。
其中，3条多态性 ISSR引物（UBC889、UBC812、
UBC825）能有效区分不同基因型。UBC889引
物检测到的多态性条带中有 4个条带（560，750，
1 500，1 800 bp）能区分 LD-4、LD-5、LD-6和
LD-8（图 1），因为 750 bp条带为 LD-4所特有，
张凤银，等：藜豆种质资源遗传多样性的 ISSR分子标记分析 101
江汉大学学报（自然科学版） 总第 41卷
LD-5缺失 560 bp条带，LD-6有 560 bp条带，而无
750 bp条带，LD-8同时缺失 1 500 bp和 1 800 bp
条带。UBC812引物检测到的多态性条带中有
3个条带（580，660，1 600 bp）能区分 LD-1、LD-2
和 LD-4（图 2）。在 LD-1和 LD-2均有 1 600 bp
条带，而其他 7份样品则没有此带，在 LD-4中同
时缺 580 bp和 660 bp条带。UBC825引物检测
到的多态性条带中有 5个条带（250，570，625，
1 900，2 000 bp）能区分 LD-1、LD-3、LD-7和
LD-8（图 3）。LD-1中无 570 bp条带，LD-3中同
时缺失 1 900 bp和 2 000 bp条带。LD-7中缺失同
时缺失 250 bp和 570 bp条带，而 LD-8中同时缺
失 570 bp和 625 bp条带。因此，综合运用上述
3条多态性 ISSR引物检测到的 12条特异性条带，
可以有效区分供试的 9份藜豆种质资源。
2.3 遗传相似性与聚类分析
供试材料间的遗传相似系数（GS）见表 3。通
过遗传相似系数计算出遗传距离（GD=1-GS）。
表 3 藜豆种质的遗传相似系数矩阵
种质资源
LD-1
LD-2
LD-3
LD-4
LD-5
LD-6
LD-7
LD-8
LD-9
LD-1
1. 00
0. 97
0. 78
0. 53
0. 63
0. 56
0. 59
0. 50
0. 66
LD-2
1. 00
0. 81
0. 56
0. 66
0. 59
0. 56
0. 47
0. 69
LD-3
1. 00
0. 75
0. 72
0. 66
0. 69
0. 59
0. 75
LD-4
1. 00
0. 72
0. 84
0. 75
0. 59
0. 75
LD-5
1. 00
0. 88
0. 84
0. 75
0. 91
LD-6
1. 00
0. 84
0. 69
0. 84
LD-7
1. 00
0. 78
0. 81
LD-8
1. 00
0. 72
LD-9
1. 00
M：DNA marker
图 1 引物UBC889的 ISSR扩增图谱
M：DNA marker
图 2 引物UBC812的 ISSR扩增图谱
M：DNA marker
图 3 引物UBC825的 ISSR扩增图谱
遗传相似系数大，遗传距离短，表明种质之间的
亲缘关系近，反之，亲缘关系远。9个藜豆种质
资源之间的相似系数范围为 0. 47~0. 97。其中同
来自广西东兰县的主栽品种花籽藜豆 LD-1和灰
籽藜豆 LD-2的相似系数最大，为 0. 97，遗传距
离最短，亲缘关系最近。来自四川的黑籽白花藜
豆的 LD-5 和来自广东的花籽紫花藜豆 LD-9
的遗传相似系数次之，为 0. 91。而同来自广西东
兰县的 LD-2和 LD-8之间的相似系数最小，为
0. 47，遗传距离最远，亲缘关系最远。
系统聚类图（图 4）可以直接反映 9份种质的
亲缘关系，聚类图显示，若以相似系数 0. 73为阈
值，可将 9份藜豆种质资源划分为 3类。第 1类
包括 LD-1、LD-2、LD-3；第 2 类包括 LD-4、
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
1800 bp
1500 bp
750 bp
560 bp
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 92000 bp
1000 bp750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1600 bp
660 bp570 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M2000 bp1900 bp
625 bp570 bp
250 bp
2000 bp
1000 bp750 bp
500 bp
250 bp100 bp
102
2013年第 6期
LD-5、LD-6、LD-7、LD-9；第 3 类包括 LD-8。
从聚类结果来看，9份藜豆材料分为 3大类，但并
非来自同一地区的种质归为同一类，如 LD-1、
LD-2、LD-3、LD-4、LD-8均来自广西，前 3种归
为 1类，而后两者分别归为另 2类。说明聚类的
结果与地理来源有一定相关性，但并不密切，这
说明藜豆种质资源有较高的遗传变异性，存在着
较大的选育潜力。
3 讨论
由于 ISSR标记具有信息量丰富、操作简单、
重复性好、稳定性强等诸多优点，因而被广泛应
用于植物遗传多样性的研究中。曾亮等［15］利用
ISSR标记技术对来自国内外的 73份豌豆材料进
行遗传多样性分析，发现 11条有效引物共扩增出
91个位点，其中多态性位点 78个，多态性比率
为 86. 4%，聚类结果显示，来源相近的材料聚为
1类，呈现出一定的地域性分布规律。高山等［16］
采用 ISSR标记技术对源自中国 7个省份的 38份
瓠瓜（Lagenaria sicerari）种质进行遗传多样性分
析，12个 ISSR引物共扩增出 96条多态性带，多
态性比率平均为 83. 5％，聚类结果与瓠瓜的农艺
性状分类和地理分布有一定的相关性。本研究也
得出相似的结果。在本研究中，对 9份藜豆种质
资源进行 ISSR分子标记，发现对 8条重复性好的
多态性引物进行 PCR扩增，共扩增出 64条带，其
中多态性条带 50条，多态性比例为 78. 1%，这表
明藜豆种质资源具有遗传多样性。从聚类图可以
看出，在相似系数约为 0. 73处，将 9份材料聚
为 3类，聚类基本符合地理来源相近的品种聚为
1类。但也有相同地理来源的品种未归为 1类，
如 LD-1、LD-2、LD-3、LD-4、LD-8 均来自广
西，前 3种归为 1类，而后两者分别归为另 2类。
产生这种结果的原因可能有 2个方面：
1）地理来源相同的材料虽来自同一环境，但
由于选择方向的不同和选用育种材料的错综复
杂，也可能形成遗传差异较大的类型，因此出现
地理来源相同的品种被归入不同类群；
2）受环境饰变作用的影响，物种在长期适应
环境的过程中会出现某些性状趋同的现象，造成
不同物种性状间的交叉。
致谢：华中农业大学食品科学学院熊善柏教
授及广西农科院陈彩虹研究员、高国庆研究员在
收集藜豆种质资源时给予了大力帮助，谨致谢意。
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Genetic Diversity Analysis of Velvet Bean Germplasm Resources with
ISSR Markers
ZHANG Feng-yin，DAI Xi-gang，PAN Lei
（School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）
Abstract：Constructed the fingerprint of 9 velvet bean（Stizolobium cochinchinensis） germ⁃
plasm resources and analyse their genetic diversity with ISSR markers. The results indicated that 8
primers with strong stability and repeatability were screened from 35 primers and carried out PCR
amplification. 64 bands were amplified from 9 velvet bean varieties，among which 50 were polymor⁃
phic，and the polymorphic rate was up to 78.1%. Using 12 specific bands in the 3 polymorphic ISSR
primers（UBC889、UBC812、UBC825），the 9 velvet bean germplasm resources could be differentiat⁃
ed. The genetic similarity coefficients of velvet bean germplasm ranged from 0. 47 to 0. 97. Nine vel⁃
vet bean varieties were divided into 3 groups by UPGMA cluster analysis with the similarity coeffi⁃
cient of 0. 73. The phylogenetic relationship of velvet beans are partly related to the geological sourc⁃
es of the germplasm.
Key words：velvet bean；germplasm resources；genetic diversity；ISSR；similarity coeffi⁃
cient；cluster analysis
（责任编辑：陈 旷）
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