全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2016，28:1309-1312
文章编号:1001-6880(2016)8-1309-04
收稿日期:2016-03-24 接受日期:2016-06-08
基金项目:西藏自治区科技计划“自然科学基金”(Z2012Z01G03);科
技部十二五“重大新药创制”重大科技专项(2012ZX09
301001-003)
# 共同第一作者
* 通讯作者 Tel:86-21-51980157;E-mail:luyan@ fudan． edu． cn
西藏扁芒菊总多糖的理化性质及免疫增强活性
高慧琴1，2#，德 吉3#，凌丽君2，张庆琳2，卢 燕2* ，陈道峰2
1山西医科大学药学院，太原 030001;2 复旦大学药学院，上海 201203;3 西藏大学理学院，拉萨 850000
摘 要:用水提醇沉法提取了西藏扁芒菊总多糖，并利用一系列物理化学方法对总多糖的组成进行表征，探究
其对免疫功能的影响。结果表明:西藏扁芒菊总多糖由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、
半乳糖醛酸、核糖组成，多糖分子量为 1110000。其多糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量分别为 63． 6%、20． 76%、
11． 24%。进一步研究表明西藏扁芒菊总多糖能够显著增强巨噬细胞 NO分泌功能，具有免疫增强活性，为西藏
扁芒菊多糖的开发利用提供了依据。
关键词:西藏扁芒菊;总多糖;理化性质;免疫增强
中图分类号:S859． 79 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2016． 8． 025
Physicochemical Property and Immuno-enhancing Activity
of Polysaccharides from Waldheimia glabra (Decne．)Ｒegel
GAO Hui-qin1，2#，DE Ji3#，LING Li-jun2，ZHANG Qing-lin2，LU Yan2* ，CHEN Dao-feng2
1College of Pharmacy，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2School of Pharmacy，
Fudan University，Shanghai 201203，China;3College of Science，Xizang University，Lasa 850000，China
Abstract:The crude polysaccharides of Waldheimia glabra (Decne．)Ｒegel (W． glabra)were extracted by water ex-
traction and ethanol precipitation method and characterized with a series of physical and chemical methods． The effect of
the polysaccharides on the immunologic functions was then investigated． The results showed that the polysaccharides were
composed of galactose，arabinse，glucose，mannose，rhamose，glucuronic acid，galacturonic acid and ribose and the rela-
tive molecular mass was about 1110000． The contents of polysaccharides，uronic acid and protein of the crude polysac-
charides were 63． 60%，20． 76% and 11． 24%，respectively． The in-depth study indicated that the polysaccharides obvi-
ously promoted the NO secretion of macrophage and thus enhanced immune activity． This study provided the basis for the
development and utilization of polysaccharides from W． glabra．
Key words:Waldheimia glabra (Decne．)Ｒegel;polysaccharides;physicochemical properties;immuno-enhancing
西藏扁芒菊［Waldheimia glabra (Decne．)Ｒe-
gel］为菊科扁芒菊属植物，多年生草本，产自我国西
藏海拔 4900 ～ 5500 m的高山碎石破石缝中，印度北
部、巴基斯坦、阿富汗等地也有分布。藏族群众主要
用西藏扁芒菊全草治疗感冒或敷于患处作为抗菌剂
加速伤口的愈合。文献报道该植物具有抗菌、抗氧
化活性，其中挥发性酚类成分是其主要的抗氧化活
性物质［1］。近年来，随着对植物多糖研究的深入，
人们逐渐认识到植物多糖来源的广泛性和生物学功
能的多样性［2］，多数植物多糖具有免疫调节作
用［2，3］。然而民族植物学的研究主要集中在低海拔
植物，对于西藏扁芒菊等高海拔地区的植物少有涉
及［4］，尚未有学者对西藏扁芒菊多糖进行研究。本
研究对西藏扁芒菊总多糖进行了提取纯化和理化性
质表征，进一步通过体外试验研究其对免疫系统的
作用，为西藏扁芒菊多糖的开发利用奠定基础。
1 仪器与材料
1． 1 仪器与试剂
AB135-S型电子天平(梅特勒-托利多仪器公
司) ;YP1002N 型电子天平(上海精科仪器有限公
司) ;Multiskan MK3 型酶标仪 (Thermo 公司) ;
US10300AH超声波清洗器(北京优晟联合科技有限
公司) ;ZHBE-50T 型闪式提取器(河南智晶生物科
技股份有限公司) ;N-1100 型旋转蒸发仪(上海爱
朗仪器有限公司) ;德国Martin Christ ＲLPHＲ 1-2 LD
型冷冻干燥器(博励行仪器有限公司) ;UV759S 紫
外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司) ;
SHB-Ⅲ 型循环水式多用真空泵(上海诚献仪器设
备有限公司) ;Agilent 1200 高效液相色谱(安捷伦
科技有限公司)。
95%乙醇、三氯乙酸、浓硫酸、NaOH、苯酚均为
分析纯 AＲ 级，PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)、
LPS(细菌脂多糖)、PB(多粘菌素 B)、考马斯亮蓝、
四硼酸钠、亚硝酸钠均购自国药集团化学试剂有限
公司;水为哇哈哈饮用纯净水;单糖对照品均由中国
食品药品检定研究院提供;间羟联苯(上海源叶生
物科技有限公司) ;牛血清白蛋白(上海维编科贸有
限公司)。
1． 2 材料准备
西藏扁芒菊药材采收于 2014 年 8 月，经复旦大
学药学院卢燕副教授鉴定为菊科扁芒菊属西藏扁芒
菊［Waldheimia glabra (Decne．)Ｒege］全草，标本存
放于复旦大学药学院生药学教研室。
2 实验方法
2． 1 西藏扁芒菊总多糖的制备
西藏扁芒菊药材 1． 285 kg 中加入 95%乙醇(1
∶ 10 料液比) ，闪式提取器提取 2 min × 3 次，抽滤并
收集滤渣，重复 2 次上述操作除脂。滤渣晾干，加入
5 倍量的水沸水浴回流 30 min 后取上清，浓缩至小
体积并加入 4 倍量无水乙醇，4 ℃静置过夜，离心取
沉淀晾干后加入适量水复溶，加入等体积 30%三氯
乙酸沉淀 2 h 除蛋白，离心取上清并用 1 mol /L
NaOH 调 pH至中性，于流动自来水中透析 3 d，冻干
得西藏扁芒菊粗多糖 4． 7 g，提取率为 0． 38%。
2． 2 多糖结构表征
2． 2． 1 多糖含量测定［5］
标准溶液的制备:称取半乳糖单糖对照品 4． 0
mg加水溶解，定容至 25 mL。
回归方程的建立:吸取 1． 0 mL标准溶液于离心
管中，倍比稀释得一系列浓度分别为 0． 16、0． 08、
0. 04、0． 02、0． 01、0． 005 mg /mL的标准溶液，将上述
6 个不同浓度的标准溶液分别取 0． 5 mL 于磨口试
管中，加入 5%的苯酚溶液 0． 5 mL，再加入 2． 5 mL
的浓硫酸后剧烈振荡 5 min，放置 15 min，在 490 nm
下测定吸光度值，用蒸馏水同样操作作空白对照。
样品溶液的测定:精密称取干燥至恒重的总多
糖样品 2． 70 mg，置于 10 mL 容量瓶中，加水至刻
度。吸取样品液体 0． 5 mL于磨口试管中，按以上操
作步骤测定吸光度值，通过回归方程求其含量。
2． 2． 2 糖醛酸含量测定［6］
标准溶液的配置:称取半乳糖醛酸 1． 9 mg，加
水溶解，定容至 25 mL。
标准曲线制备:吸取 1． 0 mL标准溶液于离心管
中，倍比稀释得一系列浓度分别为 0． 076、0． 038、
0. 019、0． 0095、0． 00475、0． 002375 mg /mL 的标准溶
液，将上述 6 个不同浓度的标准溶液分别取 0． 5 mL
于磨口试管中，冰浴中预冷，加入 3． 0 mL四硼酸钠-
硫酸试剂(0． 0125 M四硼酸钠的硫酸溶液) ，振荡混
合，在沸水浴中加热 5 min，以冰浴冷却至室温后，加
50 μL 0． 15%间羟联苯溶液(以 NaOH 配制) ，摇匀
后，在 520 nm下用分光光度计测其吸收值，绘制标
准曲线。
样品溶液的测定:精密称取干燥至恒重的总多
糖样品 1． 30 mg，置于 10 mL 容量瓶中，加水至刻
度。吸取样品液体 0． 5 mL于磨口试管中，按以上操
作步骤测其吸收值，通过回归方程求其含量。为避
免非糖醛酸成分的干扰，以 NaOH 代替间羟联苯试
液作对照，测得光吸收值从样品吸收值中扣除。
2． 2． 3 蛋白含量测定［6］
考马斯亮蓝溶液:称取 50． 0 mg 考马斯亮蓝 G-
250，溶于 25 mL 90%乙醇中，加入 85%(W/V)的磷
酸 50 mL，最后用蒸馏水定容到 500 mL。
标准溶液的配置:取 25． 0 mg牛血清白蛋白，溶
于 25 mL蒸馏水中，即为 1． 0 mg /mL的蛋白原液。
回归方程的建立:取 1． 0 mL的牛血清白蛋白原
液，倍比稀释得一系列浓度分别为 1． 0、0． 05、
0. 025、0． 0125、0． 0065、0． 00325 mg /mL 的标准溶
液，将上述 6 个不同浓度的标准溶液分别取 0． 1 mL
于带塞试管中，以 0． 1 mL水作为空白，加入 5． 0 mL
考马斯亮蓝蛋白试剂，盖塞、混匀，放置 5 min 后在
595 nm下测吸光度，制作标准曲线。
样品溶液的测定:称取样品 1． 5 mg 置于 10 mL
容量瓶中，加水至刻度。吸取样品液体 0． 1 mL于磨
口试管中，按以上操作步骤测其吸收值，通过回归方
程求其含量。
2． 2． 4 分子量分布测定［7］
将分 子 量 分 别 为 25000、410000、110000、
2000000 的葡聚糖配成标准品溶液，水为流动相，检
测器为蒸发光散射检测器，采用分子排阻色谱法［7］
0131 天然产物研究与开发 Vol. 28
测定样品中多糖分子量的分布。
2． 2． 5 单糖组成测定
取 8 mg 多糖样品，放入试管中，加入 1 mol /L
的三氟醋酸(TFA)2 mL，充 N2 后封管，在 110 ℃下
水解 5 h。试管内溶液减压蒸干，然后加入甲醇 1 ～
2 mL 蒸干，重复三次操作，以完全除去 TFA。再向
样品中加入 2 mL左右的水使样品溶解，取 1 mL 加
入 1 mL 0． 5 mol /L PMP 溶液与 1 mL 0． 3 mol /L
NaOH，70 ℃加热 2 h。冷却至室温后加入 1 mL 0． 3
mol /L HCl 中和，加入氯仿萃取 3 次弃去氯仿层，剩
余样品进 HPLC进行检测分析其单糖组成［8，9］。
2． 3 总多糖对免疫系统的作用［10］
Balb /c小鼠实验前 4 d 腹腔注射 5%硫乙醇酸
盐培养基，4 d后收集小鼠腹腔巨噬细胞，将细胞浓
度调整为 5 × 105 /mL种入 96 孔板中，200 μL /孔，置
于细胞培养箱中贴壁培养 2 h(37 ℃，5% CO2)。按
照以下分组加样: (1)空白对照组; (2)多糖单独处
理组;(3)经 PB(多粘菌素 B)处理的多糖组; (4)
LPS(细菌脂多糖)处理组(LPS 终浓度为 1 μg /
mL) ;(5)多糖与 LPS联合处理组;(6)经 PB处理的
多糖与 LPS联合处理组;(7)阳性药地塞米松与 LPS
联合处理组(DEX) ，每组四复孔，置于培养箱中培
养 24 h。收集上清，采用 Griess法测定 NO的水平，
取上清液 50 μL 加入 50 μL Griess 试剂，混匀后室
温放置 10 min，使其充分反应，以 100 μL Griess 试
剂为调零孔，540 nm检测光吸收值。以亚硝酸钠溶
液为标准溶液建立 NO 标准曲线，确定各实验组细
胞培养上清中的 NO水平。
3 结果与讨论
3． 1 西藏扁芒菊多糖的结构表征
3． 1． 1 多糖含量
半乳糖溶液作标准品建立的回归方程为 A =
5. 04626C + 0． 07066，r = 0． 9997 根据回归方程求得
样品中多糖含量为 63． 60%。
3． 1． 2 糖醛酸含量
半乳糖醛酸溶液作标准品建立的回归方程为 A
=5． 97163C + 0． 00068，r = 0． 9982 根据回归方程求
得样品中糖醛酸含量为 20． 00%。
3． 1． 3 蛋白含量
牛血清白蛋白溶液作标准品建立的回归方程为
A = 0． 48804C + 0． 75162，r = 0． 9948 根据回归方程
求得样品中蛋白含量为 11． 24%。
3． 1． 4 分子量分布
测得西藏 扁 芒 菊 粗 多 糖 分 子 量 大 概 为
1110000。
3． 1． 5 单糖组成
西藏扁芒菊多糖是由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄
糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、核糖
组成的杂多糖。HPLC分析结果见图 1，各单糖含量
见表 1。
250
200
150
100
50
0
m
AU
0 10% 20% 30% 40% 50% 60
时间
Time(min)
图 1 西藏扁芒菊多糖单糖组成的 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatogram of monosaccharide composition
of polysaccharide from W． glabra
注:1-8:依次为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄
糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖
Note:1 to 8:mannose，rhamnose，glucuronic acid，galacturonic acid，
glucose，galactose，ribose，arabinose
表 1 西藏扁芒菊多糖的几种单糖含量分析
Table 1 Content of monosaccharides in polysaccharide from W．
glabra
单糖名称
Monosaccharide
含量
Content(%)
甘露糖 mannose 6． 37%
鼠李糖 rhamnose 4． 40%
葡萄糖醛酸 glucuronic acid 2． 22%
半乳糖醛酸 galacturonic acid 28． 12%
葡萄糖 glucose 12． 05%
半乳糖 galactose 25． 10%
核糖 ribose 2． 23%
阿拉伯糖 arabinose 17． 01%
3． 2 西藏扁芒菊多糖的免疫增强活性
NO是一种由巨噬细胞分泌的生物活性物质，
在机体的炎症反应和免疫调节中发挥重要作用［2］。
当巨噬细胞受到相应刺激活化时，释放出的 NO 可
以有效杀伤微生物(病毒、真菌、细菌)、寄生虫和肿
瘤细胞等，亦可通过诱发炎症反应来保护机体抵御
外界有害因素的入侵［3］。研究表明，植物多糖可以
1131Vol. 28 高慧琴等:西藏扁芒菊总多糖的理化性质及免疫增强活性
通过调节巨噬细胞的 NO等细胞因子的分泌量来调
节机体的免疫功能［3］。
实验数据表明，西藏扁芒菊多糖与经 PB 处理
后的多糖单处理均能显著上调巨噬细胞 NO 分泌水
平，增强巨噬细胞 NO的分泌功能，具有免疫增强活
性。然而，西藏扁芒菊多糖对 LPS 诱导的腹腔巨噬
细胞 NO 分泌并无显著影响，无显著抗炎作用。因
此西藏扁芒菊多糖对腹腔巨噬细胞分泌功能仅有增
强作用，并无双向调节作用。西藏扁芒菊多糖对巨
噬细胞 NO分泌量的影响如图 2 所示。
30
20
10
0Ni
tri
c%o
xi
de
(μ
m
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/L
)
DM
EMWT
P
WT
P+
PB LP
S
WT
P
WT
P+
PB DE
X
图 2 西藏扁芒菊多糖对巨噬细胞 NO分泌量的影响
Fig. 2 The effect of polysaccharide from W． glabra on the a-
mount of NO released by macrophage
注:＊＊＊ P ＜ 0． 001(n = 4) ，与空白对照组比较;###P ＜ 0． 001(n
= 4) ，与 LPS处理组比较;WTP:西藏扁芒菊总多糖
Note:＊＊＊ P ＜ 0． 001 (n = 4) ，compared with control;###P ＜ 0． 001
(n = 4) ，compare with LPS treatment group;WTP:Crude polysaccha-
rides of W． glabra
4 结论
本研究采用水提醇沉法对西藏扁芒菊总多糖进
行提取并对其多糖进行初步表征，得到总多糖的多
糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量、分子量分布、单糖组
成的信息，并对西藏扁芒菊粗多糖在提高机体免疫
功能方面进行了初步探讨，为其开发利用奠定了基
础。
NO的浓度是巨噬细胞活化的重要标志，在机
体的炎症反应和免疫调节中发挥重要作用，可以作
为免疫作用强弱的一个重要指标［11］。本论文研究
结果表明西藏扁芒菊粗多糖能够提高巨噬细胞 NO
分泌量，提示对于固有免疫系统存在显著增强作用，
能促进机体的免疫应答，保护机体抵御外界有害因
素的入侵，为后续动物实验中全面深入研究西藏扁
芒菊粗多糖免疫增强活性的作用机制及作用靶点提
供线索和依据。
参考文献
1 Giorgi A，Panseri S，Mattara MS，et al． Secondary metabolites
and antioxidant capacities of Waldheimia glabra (Decne．)
Ｒegel from Nepal． J Sci Food Agric，2013，93:1026-1034．
2 Shang QH (尚庆辉) ，Jie YH (解玉怀) ，Zhang GG (张桂
国) ，et al． Immune regulation roles of phytogenic polysac-
charides and its mechanisms． Chin J Animal Nutr (动物营
养学报) ，2015，27:49-58．
3 Saifuding A (赛福丁·阿不拉) ，Wang JM (王君敏) ，Mik-
eremu S (米克热木·沙衣布扎提)． Progress on antivirus
and immune enhancement activities of polysaccharides and
sulfated derivatives． Nat Prod Ｒes Dev (天然产物研究与开
发) ，2013，25:572-575．
4 Ghimire SK，Gimenez O，Prade Ｒ，et al． Demographic varia-
tion and population viability in a threatened Himalayan me-
dicinal and aromatic herb Nardostachys grandifogli:matrix
modeling of harvesting effects in two contrasting habitats． J
Appl Ecol，2008，45:41-51．
5 Zhang JJ (张娟娟)． Preparation，purification and character-
ization of anti-compelementary polysaccharide from Houttuyn-
ia cordata Thurb． Shanghai:Fudan University (复旦大学) ，
MSc． 2012．
6 Di HY (狄宏晔)． Preparation，purification and characteriza-
tion of anti-compelementary polysaccharide from Bupleurum．
Shanghai:Fudan University (复旦大学) ，PhD． 2011．
7 Chen QM (陈琴鸣) ，Liu B (刘斌) ，Chen WP (陈卫平) ，
et al． Determination of molecular weight and molecular weight
distribution of polysaccharide． Chin Tradit Patent Med (中成
药) ，2011，33:79-81．
8 Liu W，Xu JN，Zhu Ｒ，et al． Finger printing profile of poly-
saccharides from Lycium barbarum using multiplex approa-
ches and chemometrics． Int J Biol Macromol，2015，78:230-
237．
9 Wang YF，Xian JH，Xi XG，et al． Multi-fingerprint and qual-
ity control analysis of tea polysaccharides． Carbohyd Polym，
2013，92:583-590．
10 Lai XQ，Ye YX，Sun CH，et al． Icaritin exhibits anti-inflam-
matory effects in the mouse peritoneal macrophages and peri-
tonitis model． Int Immunopharmacol，2013，16:41-49．
11 Ｒong YG (荣岳光)． Effects of polysavone on NO，IL-6，
TNF-α production and its mechanism in mouse macropha-
ges． Beijing:Chinses Academy of Agricultural Sciences (中
国农业科学院) ，MSc． 2007．
2131 天然产物研究与开发 Vol. 28