全 文 ：收稿日期:2006 - 05 - 17基金项目:广东省自然科学基金资助项目(021295)
作者简介:吴玉荷(1946 -), 女 , 广东增城人 , 教授。主要从事细胞生物学方面的研究。
E -m ail:wuyh@ szu. edu. cn
薇甘菊水提物的抑菌试验研究
吴玉荷 ,杨小华 ,蒋灵芝
(深圳大学生命科学学院 , 广东 深圳 518060)
摘　要　以枯草芽孢杆菌 、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为代表 ,分别探讨了薇甘菊水溶性提取物对上述 3种细菌在
培养 24 h过程中的光密度 、活菌数和最低杀菌浓度的影响。试验结果表明 , 在一定浓度范围内薇甘菊水提物对上述 3
种细菌均有不同程度的抑制作用。其中 , 枯草芽孢杆菌的抑制作用最强, 其次是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。透射电
镜观察结果表明 ,薇甘菊水提物可抑制金黄色葡萄球菌细胞壁的分离 ,因而抑制了细胞的分裂而达到抑菌效果。
关键词　薇甘菊;水提物;细菌;抑菌
中图分类号:S567　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006 - 9690(2007)01 -0051 - 04
The Antibacterial E ffects ofW ater - solub ility Extractant
fromM ikania m icran tha
W u Yuhe, Yang X iaohua, Jiang Lingzh i
(Co llege of L ife Science, Shenzhen Unive rsity, Shenzhen 518060, China)
Abstract　The an tibacte ria l effect of w a ter - so lubility m aterial ex tracted from M ikan ia m icrantha was
stud ied by te sting theO ptica lDensity value (OD640nm), Colony Fo rm ing Un it(CFU) andM inimum Bac-
tericidal Concentra tion(MBC) of 3 spec ie s o f bacteria. The resu lts show ed tha t the antibacterial ac tiv ity o f
w a te r - so lub ility extractant resisting P seudomonas putida was stronger than that o fE scherichia coli, Bacil-
lus subtilis and S taphy lococcus aureus. The cell div ision o fS taphylococcus aureus was affected by the ex-
traction as observed by e lectronm icroscope.
Key words　M ikania m icran tha;water - solubility ex tractant;bacte ria;bacte riostasis
　　薇甘菊 (M ikania m icrantha H. B. K )是菊科多
年生草质藤本植物 ,原产中 、南美洲 ,现已扩散至南
亚 、东亚许多国家 [ 1 -3] ,香港和我国广东深圳 、东莞
等地区随处可见 ,是一种国际上公认的危害农作物
和森林植被资源的有害杂草。
薇甘菊在阳光充足 ,空气潮湿的地区生长快 ,有
“m ile -m inu te - w eed” [ 4] 之称 ,大量覆盖农作物和
森林植被 ,竞争营养 ,遮挡阳光 ,使植物大量死亡 。
在深圳的内伶仃岛 , 50% ～ 60%左右的地面被薇甘
菊所覆盖 ,岛上的森林植被受到严重威胁 [ 5] ,因而
有 “植物杀手 ”之称。
对薇甘菊的研究可以从两个方面进行:一方面
是研究控制杀灭的方法 ,另一方面是对薇甘菊资源
进行开发利用 。从植物中寻找生物活性物质是目前
创制新型药物的重要途径之一 ,据报道菊科植物含
有多种天然杀菌类物质 [ 6] 。为探讨薇甘菊的抑菌作
用 ,设计了本实验 ,以期变害为利 ,为薇甘菊的利用
提供依据 。
1　材料和方法
1. 1　试验材料
1. 1. 1　薇甘菊
在本校园周围采集 , 80 ℃烘干后粉碎备用。
1. 1. 2　供试菌株
大肠杆菌 (E scherichia coli)、金黄色葡萄球菌
(S taphy lococcus aureus)、枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
由本校生命科学学院提供。
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第 26卷第 1期
2007年 2月 　　　　　　　　　　　　　 中 国 野 生 植 物 资 源Ch ineseW ild P lant R esources　　　　　　　　　　 　Vo.l 26 No. 1Feb. 2007
1. 1. 3　培养基
牛肉膏蛋白胨培养基:0. 5%牛肉膏 , 1%蛋白
胨 , 0. 5%NaC l,水 100 mL, pH7. 0 ～ 7. 2,固体培养基
加 2%琼脂。
1. 2　方法
1. 2. 1　薇甘菊水提液 (WG JWE)的制备
称取粉碎的薇甘菊干燥茎叶 100 g加蒸馏水
600mL,浸泡 30 m in,然后煮沸 30m in,过滤。残渣
再加水 300 mL,煎煮 20 m in,滤出药液 。将 2次滤
液合并 ,于 3000 r /m in离心 10m in,取上清液加热浓
缩至 100mL,即为 100%浓度水提液 ,密封置冰箱中
保存备用。细菌培养物的制备 [ 7] 。
先将供试菌种培养活化 ,然后挑取一环菌苔放
入装有 2 mL无菌水的试管内 ,在 WH - 851型旋涡
混合器上震荡数分钟 ,使菌液内细菌分布均匀 。然
后 ,将菌悬液分别接种在上述液体培养基中 , 37℃、
160 r /m in条件下培养 6 ～ 8 h后 ,用培养基调节菌
悬液的浓度 ,并使此初始培养物的使浓度为 5. 0×
10
5个 /mL左右 ,储藏在 4℃冰箱中备用。用 6个
100mL的三角瓶 ,每瓶装浓度为 5. 0 ×105个 /mL
左右的菌悬液 1mL,其中 4个瓶分别加入 49 mL用
液体培养基稀释的含 500、250、125、62. 5mg /mL浓
度薇甘菊提取液的药基 ,另 2个瓶分别加入 49 mL
1∶1 000的新洁尔灭溶液和纯液体培养基 ,作为阳
性对照和阴性 (空白)对照样品 ,轻摇三角瓶 ,使其
中的培养物和水提液混匀. 每一浓度设 3个重复 。
将所有样品置 37 ℃、160 r /m in摇床中黑暗培养 24
h。期间 ,每隔 2 h测定一次 OD640nm ,每隔 4 h测定 1
次 CFU /mL。
1. 2. 2　OD值测定
在摇床培养后 ,每隔 2 h取样 ,在 640 nm 波长
处检测 OD值。各样品分别用含相同浓度的薇甘菊
提取液和 0. 1%新洁尔灭溶液作空白对照和阳性对
照 。最后 ,求出 3个重复样品的平均 OD640nm。
1. 2. 3　CFU测定[ 8]
10倍稀释法 ,每个样品取稀释度为 10-3 、10-4 、
10
- 5 、10-6 、10-7的菌悬液 0. 1mL于培养皿中 ,到入
45 ℃的融化培养基 ,混匀凝固后倒置 , 37℃培养 48
h,每个稀释度做 3个重复 ,计算 CFU ,取 CFU在 30
～ 300范围内的平板 , 求出个样品 CFU /mL的平
均数。
1. 2. 4　MBC检测
用培养基把薇甘菊提取液稀释为 500、 450、
400、350、300、250、200、 150、100、50 mg /mL系列梯
度的药基 。取稀释至 10-7的菌悬液 0. 1 mL于培养
皿中 ,倒入 45℃系列梯度浓度的药基 20 mL,混匀 、
凝固后倒置 , 37℃培养 48 h,同时做空白对照和阳性
对照 ,每种处理重复 3次 ,无菌生长的平板所对应的
最低浓度即为最低杀菌浓度 (MBC mg /mL)。
1. 2. 5　透射电镜样品制备
用 100 mg /mL浓度的薇甘菊水提物作用于金黄
色葡萄球菌 ,不加薇甘菊水提物的为对照。 24 h后取
出标本 ,采用原位包埋法 。先用 2. 5%戊二醛预固定
2 h,然后用 1%锇酸固定 1 h,磷酸盐缓冲液 (pH7. 4)
漂洗 、丙酮梯度脱水 , Epon - 812包埋 ,半薄切片定
位 ,甲苯胺蓝染色 , LKB -V型超薄切片机切片 ,日立
H - 600型透射电镜观察 ,放大倍数 2 ～ 6万倍。
2　结果与讨论
2. 1　薇甘菊水提液处理枯草杆菌 、大肠杆菌和金黄
色葡萄球菌后的 OD640nm
OD值反映了薇甘菊提取液对细菌生长的影
响。薇甘菊水提液处理枯草杆菌 、大肠杆菌和金黄
色葡萄球菌后 ,每隔 2 h测定 OD640 nm值的结果见图
1、图 2和图 3。
图 1　薇甘菊水提物对枯草杆菌生长过程中 OD值的影响
图 2　薇甘菊提取物对大肠杆菌生长过程中 OD值的影响
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 野 生 植 物 资 源　　　　　　　　　　　　　　　　第 26卷
图 3　薇甘菊提取物对金黄色葡萄球菌生长过程中 OD值的影响
　　从上述 3个图可知 , 3种供试菌均以加入液体
培养基的空白对照生长最好 , OD值最大。加入
0.1%新洁尔灭的阳性对照生长最差 ,表现为 OD值
很小或等于零。用薇甘菊水提液 4个浓度处理 3种
细菌 ,不同时段的 OD640nm值 ,均小于空白对照而大
于阳性对照 。说明 ,薇甘菊水提液对 3种供试细菌
有抑制或杀灭作用 ,这种作用随浓度增加而加强。
2. 2　薇甘菊水提液处理枯草杆菌 、大肠杆菌和金黄
色葡萄球菌后的 CFU /mL检测
CFU /m l反映了薇甘菊水提液对细菌的抑制
程度。CFU /mL越大 ,存活的细菌越多 ,则薇甘菊水
提液的抑菌或杀菌作用越差;反之 ,则薇甘菊水提液
的抑菌或杀菌作用越强。薇甘菊水提液处理细菌
后 ,在 24 h的培养中 ,每隔 4 h测定 1次 CFU /mL
的结果见表 1、表 2和表 3。
表 1　薇甘菊水体液处理枯草杆菌后的 CFU /m L
时间 / h 4 8 12 16 20 24
阴性
对照 3. 9×10
5
3. 4×107 2. 93×107 1. 23×107 1. 83×107 9. 4×106
阳性
对照 - - - - - -
500
mg /mL
- - - - - -
250
mg /mL
- - - - - -
125
mg /mL
1. 63×105* 6. 3 ×104* - - - -
62. 5
mg /mL
3×104 1. 32×105 2. 5×103 - - -
注:与阴性组相比 **P <0. 01, *P <0. 05
表 2　薇甘菊水体液处理大肠杆菌后的 CFU /mL
时间 /h 4 8 12 16 20 24
阴性
对照 1. 97×10
7
4×107 1. 68×108 1. 68×108 1. 07×109 1. 55×108
阳性
对照 - - - - - -
500
mg /mL
- - - - - -
250
mg /mL
- - - - - -
125
mg /mL
1. 12×106** 6. 9×105** 7. 9×105** 5. 1×105** 3. 1×105* 2. 35×105**
62. 5
mg /mL
1. 09×106* 1. 18×106* 8. 6×106* 6. 8×107* 2. 94×108* 2. 08×107*
注:与阴性组相比**P <0. 01,*P<0. 05
　　从表 1、表 2和表 3可知 ,薇甘菊水提液对 3种
细菌均有抑制或杀灭的作用 ,作用强度随浓度的增
加而增强 ,这一结果与图 1、图 2和图 3相似 。当薇
甘菊水提液的浓度在 250 mg /mL以上时 ,分别在处
理后 4 h(枯草杆菌和大肠杆菌)和 12 h(金黄色葡
萄球菌)CFU /mL下降至零;当浓度下降到 125 ～ 62.
5mg /mL时 ,对枯草杆菌还有很强的杀灭能力 ,分别
在处理后 12 ～ 16 h下降到零 ,但对大肠杆菌和金黄
色葡萄球菌在 24 h小时内只表现出抑制的作用。
表 3　薇甘菊提取液处理金黄色葡萄球菌后的 CFU /mL
时间 /h 4 8 12 16 20 24
阴性对照 3. 1×107 5. 1×108 2. 09×109 3. 3×109 1. 63×109 4. 3×108
阳性对照 - - - - - -
500
mg /mL -
- - - - -
250
mg /mL
1. 78×106 8×103 - - - -
125
mg /mL
1. 15×106** 4. 5×106** 5. 5×106** 1. 87×107** 4. 2×106** 1. 09×106**
62. 5
mg /mL
5. 1×106* 1. 02×107* 1. 09×107* 1. 46×108* 6×107* 5. 1×106*
注:与阴性组相比**P <0. 01, *P <0. 05
2. 3　MBC检测
MBC检测的结果见表 4。
表 4　MBC检测的结果
细菌 原液浓度 /m g m L- 1
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
对照
阳性 阴性
E scherichia coli 6. 3×103 - - - - - - - - - - 1. 48×106
Bacillus subtilis 2. 28×104 5. 1×103 - - - - - - - - - 8. 6×106
S taphy llococcus aureus 1. 90×106 5. 3×105 6. 9×103 - - - - - - - - 6. 7×107
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第 1期　　　　　　　　　　　　　 　吴玉荷 ,等:薇甘菊水提物的抑菌试验研究　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　从表 4可知 ,枯草杆菌 、大肠杆菌和金黄色葡萄
球菌的 MBC分别是 100、150mg /mL和 200 mg /mL
这一结果与表 1 ～表 3的结果相似 。
2. 4　透射电镜观察结果
从透射电镜照片看出(图 4、图 5)未经薇甘菊水提
物处理的对照组细胞分裂正常 ,细胞的数量多;薇甘菊
水提物处理后的细胞处于分裂时期的较多 ,且细胞空
洞多 ,细胞已经均匀的分成两个 ,但仍被一个完整的细
胞壁包裹 ,这样细菌细胞处于分裂相而没有最终分开
而致使最终的细菌细胞数目较少。从图 4、图 5还可以
看出 ,对照组金黄色葡萄球菌细胞圆形或椭圆形 ,细胞
壁光滑。实验组在 2万倍下 ,每个视野观测到的细胞
数量均较对照少 ,胞体大小较对照组略小 ,且细胞壁不
如对照组光滑 ,胞浆内有空化现象。
图 4　正常生长的金黄色葡萄球菌
图 5　薇甘菊水提物作用后的金黄色葡萄球菌
　　试验结果显示 ,薇甘菊对上述 3种细菌有广泛
的抑菌作用 [ 9] ,在试验设计的 62. 5 ～ 500 mg /mL浓
度范围内 ,低浓度可抑制细菌生长 ,高浓度可杀死细
菌 (100 mg /mL以上 ),这一结果在 OD值 、CFU /mL
和 MBC检测均得到相似的结论 。
新洁尔灭 (Benzalkonium B rom ide Neo -G eram-
ine)是一种阳离子表面活性剂 ,易吸附于细菌表面 。
改变细胞壁的透性 ,干扰菌体的新陈代谢而产生杀
菌作用 ,抗菌谱广 ,杀菌力强 ,广泛用于医疗 、卫生和
禽畜养殖场的消毒 ,但反复使用可出现过敏反应。
改革开放以来 ,随着人民生活水平的提高 ,饮食结构
发生了重大变化 ,对动物及动物制品的需求量日益
增大 ,禽畜养殖业也随之迅猛发展 ,已成为农业和农
村经济的重要支柱产业 。但是 ,随着畜牧业现代化 、
集约化 、规模化进度的加快 ,由此而引起的环境污
染 ,疾病传播 ,大量使用抗生素及其他化学药物造成
的病原体抗药性增强和禽畜产品药物残留加重 ,使禽
畜产品的质量及安全性下降等问题日益突出。薇甘
菊是一种外来恶性杂草生长快 、来源广 ,其水提液在
250mg /mL浓度时与新洁尔灭的效果差别不大 ,且属
于植物源消毒剂如果能将其开发成抗菌药物 ,用于禽
畜养殖场等环境的消毒作用 ,不仅消除了薇甘菊在沿
海地区的危害 ,并且还能带来较大的经济效益。
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