全 文 ： 基础理论研究
一氧化氮对紫外线-B辐射下小浮萍保护作用
任长江 1 ,余亚平2 ,李富荣1 ,张娅婷 1 ,谢素霞 1*
(1. 信阳师范学院 生命科学学院 , 河南 信阳 464000;2.信阳市森林病虫害检疫站 , 河南 信阳 464000)
摘　要:以小浮萍为材料 ,研究紫外线-B(UV-B)辐射下 NO对植物的保护作用 .经紫外线处理过的小浮
萍 ,叶绿素和可溶性蛋白质含量降低 ,而 SOD、POD和 CAT活性上升;加入 NO后 , 可以阻止叶绿素含量下降 ,
提高可溶性蛋白质含量 , 且增加 SOD、POD和 CAT的活性 .NO可以提高小浮萍抗紫外线能力 .
关键词:一氧化氮;紫外线-B;小浮萍;抗氧化酶
中图分类号:Q949. 2　　　文献标识码:A　　文章编号:1003-0972(2007)04-0452-04
Effects of N itricOx ide on the SmallDeckweed Treated w ith the UV-B
REN Chang-jiang1 , YU Ya-ping2 , L I Fu-rong1 , ZHANG Ya-ting1 , XIE Su-x ia1
(1. C ollege o f L ife Science s, X inyang Norm a l Unive rsity, Xinyang 464000, Ch ina;
2. Fo rest D iseases and Insect Pests O ffice o f X inyang, X inyang 464000, China)
Abstract:The p ro tec tive effects o f n itric ox ide on sm all deckw eed response to UV-B radiated
w ere studied in this pape r. The chlorophyll conten t of the deckw eed d ropped down, nitric oxide p re-
ven t the process. The disso lubility pro te in w as reduced by UV-B radiated, nitric oxide pro tec t the
pro te in demolished by UV-B. The SOD 、POD and CAT raised treated w ith UV-B , nitric ox ide also
boosted the activities o f SOD 、 POD and CAT. The results suggested that nitric ox ide enhanced com-
petence o f the plan t response to UV-B radiance.
Key words:n itric ox ide;the u ltravio let ray-B;Lemna m inor;an tioxidant enzyme system s
　　 NO是一种广泛存在于生物体内的气体分
子 .3位美国科学家因对动物 NO的出色研究而共
同获得 1998年度诺贝尔生理学与医学奖[ 1] .因
此 ,确定 NO参与调控动物的生理过程 ,曾经成为
当时国际生物学及医学界的一项令人瞩目的发现
.NO不仅有松弛内皮的作用 ,还可以作为神经传
导的逆信使 ,对肿瘤细胞与入侵微生物进行杀伤和
生理调节[ 2] ,同时它还有某些病理生物学作用 ,如
亚硝酰化 (nitrosy lation)、硝基化 (nitration)、DNA
脱氨 、氧化损伤 、神经损伤等 ,其中一些研究成果已
成功应用于临床治疗 [ 3] .自 1998年后 ,有关 NO在
植物体内的功能研究 ,也越来越多地引起全球植物
学界的密切关注 .初步研究表明 , NO可以作为植
物抗病反应的信号分子 [ 4] ,同时对植物的呼吸作
用 [ 5] 、光合磷酸化 [ 6] 、光形态建成 [ 7] 、种子萌发[ 7] 、
根的生长发育 [ 8] 、果实组织的成熟和衰老 [ 9-10]等生
理过程都有作用 .但总体来说 ,植物中 NO的研究
与动物中的研究相比差距很大 ,大多数领域的研究
仍处于起步阶段 [ 11-12] ,很多问题 ,诸如 NO在植物
生长发育中的作用 、NO与植物抗逆性 、NO与植物
内源激素的关系 、NO的分子作用机制等 ,都有待
进一步探讨 .
以分布广泛的小浮萍为材料 ,研究了正常情
况 、UV-B照射及 UV-B照射加 NO对抗氧化酶活
性的影响 .通过测定小浮萍叶内叶绿素含量 、蛋白
质含量 、过氧化氢酶 (CAT )活性 、过氧化物酶
(POD)活性 、超氧物歧化酶 (SOD)活性变化来探
讨小浮萍的抗逆性机制 ,旨在探讨 UV-B对小浮萍
生长的影响 、NO以及抗氧化酶系在防御 UV-B对
细胞伤害中的作用 ,并为抗逆生理育种提供依据 .
　收稿日期:2007-04-18;修订日期:2007-08-10;*. 通讯联系人 , E-ma il:xsux ia@yahoo. com. cn
　基金项目:国家自然科学基金项目(30470276)
　作者简介:任长江(1970-), 男 ,河南通许人 , 编辑 ,主要从事编辑学与环境生物学研究 .
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信阳师范学院学报:自然科学版 Journa l o f X inyang Norm a lUniversity
第 20卷　第 4期　2007年 10月 Na tura l Science Ed ition Vo .l 20 No. 4 Oc.t 2007
1　材料与方法
1. 1　实验材料
小浮萍:中国科学院水生生物研究所.
药品试剂:市售国产分析纯或化学纯商品 .
SNP (硝普纳 ,一氧化氮供体)来源 S igma公司 .
1. 2　实验方法
1. 2. 1　材料处理
本实验是在室内开放的环境条件下进行的 .
浮萍用 Hunte r培养基培养 ,生物量大量扩增后用
作试验材料.在玻璃缸中配制 10 L小浮萍培养基 ,
然后接种 ,置于室内自然温度及自然光照下静止培
养 .培养条件:温度 26 ℃,光照 60 μmo l m - 2
s
- 1 ,光暗时间比为 16 h∶8 h.UV-B照射强度为 0.
2 mW /cm
2
.处理后 ,各取几片小浮萍 ,用滤纸吸干 ,
放在液氮中固定 ,将上述冷冻的材料放入预冷的研
钵中 ,加入 pH7. 8磷酸缓冲液 (0. 05 mo l /L)少许 ,
冰浴下研磨成匀浆用 A llegre 64R Centrifuge高速
离心机离心 , 15 000 r /m in低温离心 15 m in.上清
液即为所需酶液 ,用 PBS定容至 5 mL, 4 ℃保存待
用 .
1. 2. 2　叶绿素含量测定
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收 ,利
用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度 ,即可
用公式计算出提取液中各色素的含量 .根据朗
伯 —比尔定律 ,某有色溶液的吸光度 A与其中溶
质浓度 C和液层厚度 L成正比(式 1),
A=αCL . (1)
式 (1)中:α为比例常数 .当溶液浓度以百分浓度
为单位 ,液层厚度为 1 cm时 , α为该物质的吸光系
数 .各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数
可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸
光度而求得 .如果溶液中有数种吸光物质 ,则此混
合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应
波长下吸光度的总和 .这就是吸光度的加和性 .
要测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a、b和类
胡萝卜素的含量 ,只需测定该提取液在 3个特定波
长下的吸光度 A ,并根据叶绿素 a、b及类胡萝卜素
在该波长下的吸光系数即可求出其浓度 .在测定
叶绿素 a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰 ,所用单
色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰 .
1. 2. 3　蛋白质含量的测定
用考马斯亮蓝 G-250法测定酶液的蛋白质含
量 .
1. 2. 4　CAT活性的测定
过氧化氢酶 (CAT)属于血红蛋白酶 ,含有铁 ,
它能催化过氧化氢分解为水和分子氧 ,过氧化氢则
既是氧化剂又是还原剂 .可根据 H2O 2的消耗量
或 O2的生成量测定该酶活力大小 .
在 3 mL的反应体系中 ,包括 0. 2% H2O2 1
mL;H2O
1. 9mL;酶液 0. 1mL.
测定 240 nm波长处的 OD降低速度 ,将每分
钟 OD减少 0. 01定义为 1个活力单位 (单位:U /
mg).
1. 2. 5　POD活性的测定
过氧化物酶 (POD)催化过氧化氢氧化酚类 ,
产物为醌类化合物 ,此化合物进一步缩合或与其他
分子缩合 ,产生颜色较深的化合物 .本实验以邻甲
氧基苯酚 (即愈创木酚 )为过氧化物酶的底物 ,在
过氧化物酶存在下 , H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化
成红棕色的 4-邻甲氧基苯酚 .
在 3 mL的反应体系中 ,包括 0. 2% H2O2 1
mL;0. 2%愈创木酚 0. 95 mL;pH =7. 0 PBS 1
mL;酶液 0. 05 mL.在 H2O2存在条件下 ,过氧化
物酶能使愈创木酚氧化 ,生成茶褐色的 4-邻甲氨
基苯酚 .可用分光光度法测定生成物的含量来测
定 POD活性 .测 470 nm处 OD的降低速度 .以每
分钟 A470的变化值 0. 01为一个相对酶活单位 ,
计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小 (单位:
U /mg).
1. 2. 6　SOD活性的测定
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑
(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小 .
NBT氧化还原法 [ 13] .SOD能抑制氮基四唑
(NBT)的光化还原 ,其抑制强度与酶活性在一定范
围内成正比 .以 SOD抑制率达 50%时所对的 SOD
量为一个活性单位 .用 V IS-7220分光光度计读出
560 nm处的 OD值(单位:U /mg).
SOD活性按 G iannopo litis[ 14]等的方法加以改
进 ,在 3 mL的反应混合液中含甲硫氨酸 2. 5 mL,
NBT 0. 25mL,核黄素 0. 15 mL,磷酸缓冲液 0. 10
mL,加入经适当稀释的酶液 ,以不加酶液 (以缓冲
液代替)的试管为最大光化还原管 ,用缓冲液作空
白管 ,然后将各管在光下照约 20 m in,测反应液
560 nm的光密度 .
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任长江 ,等:一氧化氮对紫外线-B辐射下小浮萍保护作用
2　结果与分析
2. 1　紫外线对叶绿素含量的影响
由图 1可见 ,在 UV-B的辐射下 ,小浮萍内的
叶绿素含量有所降低 ,加入 SNP(即外源 NO)后 ,
叶绿素含量又呈现上升趋势 .表明在外源 NO的
存在下 ,植物抗紫外线辐射能力有所提高 .
图 1　紫外线-B对叶绿素含量的影响
F ig. 1　Chl con ten t caused by UV-B rad iated
2. 2　紫外线对可溶性蛋白质含量的影响
由图 2可知 ,经过 UV-B照射后 ,小浮萍的可
溶性蛋白质含量呈现出一种下降趋势 .经 UV-B
辐射后加入 SNP可溶性蛋白没有下降现象 .可溶
性蛋白的这种下降趋势说明酶活性的提高可能源
于酶原的加工 、激活 ,而不是存在于翻译与转录等
基础上 .蛋白质是生物体内重要大分子物质之一 ,
它在组织器官形成及生物体结构中担任重要角色 ,
在各种生理功能代谢过程中起着重要作用 [ 15] .所
以 ,在植物体处于紫外线胁迫时 ,会有下降趋势 ,是
适应植物体的生理生化性能发生改变的需要 .
图 2　蛋白质含量
F ig. 2 Protein con ten t
2. 3　紫外线对 CAT活性的影响
由图 3可以看出 , UV-B照射后 ,小浮萍的 CAT
活性明显高于日光照射下的小浮萍 CAT活性 .随
着 SNP加入 , CAT活性呈现上升趋势 .CAT普遍存
在于植物的所有组织中 ,是清除 H2O 2的重要保护
酶 ,使机体免受 H2O2的毒害作用 .其活性与植物
的抗逆性密切相关 ,并且与植物的代谢强度及抗
寒 、抗病能力有一定关系 .
图 3　CAT活性变化
F ig. 3　CAT activities change
2. 4　紫外线对 POD活性的影响
由图 4可以看出 ,经过 UV-B照射后 , POD活
性上升 .随着 SNP加入 , POD活性呈现上升趋势 .
在紫外线照射下 ,小浮萍中 H2O2处于急剧积累状
态 , H2O2的积累可导致破坏性的氧化作用 .所以
POD的活性上升 , POD是清除 H2O2的重要保护
酶 ,使机体免受 H2O 2的毒害作用 .POD活性的维
持和提高是植物耐受不利因素胁迫的物质基础之
一[ 16] .SOD、POD协同作用 ,排除 O2 -和 H 2O 2这些
自由基对植物细胞膜结构潜在氧伤害的可能性 .
图 4　POD活性的变化
F ig. 4 POD activities change
2. 5　紫外线对 SOD活性的影响
由图 5可以看出 ,在 UV-B的胁迫下 , SOD活
性呈现上升趋势 ,这是相应于小浮萍体内阴离子自
由基含量增加的应急解毒措施 .随着外源 NO加
入 , SOD活性继续上升 .SOD是一种重要的活性氧
防御酶 ,在消除超氧物自由基 、减轻脂质过氧化作
用和膜伤害方面起重要作用 [ 17] .正常的植物细胞
的叶绿体在光合作用过程中会产生自由基 ,而
SOD能清除超氧化物的阴离子自由基(O2 - ).SOD
作为一种诱导酶 ,紫外线胁迫下 ,植物体内阴离子
自由基含量一定程度的增加 ,能诱导酶活性的上
升 ,保持植物体清除自由基的正常功能 ,加强植物
对逆境的适应能力 [ 18] .
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第 20卷　第 4期 信阳师范学院学报:自然科学版 2007年 10月
图 5　SOD活性的变化
Fig. 5 SOD act ivitie s change
3　结论
小浮萍经过 UV-B照射后 ,叶片中的叶绿素 、
可溶性蛋白含量有所下降 ,而 CAT、POD、SOD活性
则有所上升 .说明小浮萍具有一定的抵抗紫外线
的机能 ,它可以通过改变酶活性 ,来提高植物对膜
脂过氧化作用的保护能力 ,增加膜的稳定性 ,保护
膜结构的完整性 .NO作为信号分子 ,通过诱导细
胞内多种抗氧化酶的活性或相关编码基因的表达 ,
以及提高具有清除自由基能力的活性物质含量 ,来
间接清除自由基 ,从而提高植物的适应能力 .
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责任编辑:张建合
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