全 文 ：扁穗牛鞭草 actin基因克隆及荧光定量 PCR的建立
陈永霞
（西昌学院动物科学系，四川 西昌 615000）
摘 要：搜索 GenBank 中禾本科植物 actin 基因序列进行同源性比对，选择保守区段设计简并引物，利用 RT-PCR 方法从扁穗
牛鞭草中克隆获得 actin 基因 cDNA 片段。 该基因片段长度为 773 bp，编码 257 个氨基酸残基。 根据此 actin 基因序列设计引物，建
立了基于 SYBR Green I 染料技术的实时荧光定量 PCR 方法。 该方法扩增效率高，检测范围广（R2=0.995，E=101.3%），为 actin 基因
作为内参基因进行扁穗牛鞭草功能基因的定量分析奠定了基础。
关键词：扁穗牛鞭草； actin 基因； 克隆； 荧光定量 PCR
中图分类号：Q185 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2012）16-0158-04
Clone actin gene and estiablishment of quantitative
real-time PCR from Hemarthria compressa
CHEN Yong-xia
（Department of Animal Science, Xichang College, Xichang 615000, China）
Abstract: Through homology comparison of actin gene sequences of gramineous plants from GenBank, conservative regions were
selected for the designation of primers. The partial cDNA fragment of actin gene was isolated and idenfied from H.compressa by reverse
transcript polymerase chain reaction (RT-PCR), which contained 773 bp and encoded 257 amino acid. According to the sequence of actin
gene above, a quantitative real-time PCR method based on SYBR Green I dye was developed ．The quantitative real-time PCR method
established in the study had the advantages of high efficiency, wide linear range (R2=0.995，E=101.3%). The results of this study might
provide a basis for actin used as a reference gene to analyze the H.compressa gene quantitatively．
Key words: H.compressa; actin gene; clone; quantitative real-time PCR
肌动蛋白（actin）普遍存在于真核生物中，是构成细胞
骨架的主要成分。 在高等植物体内，肌动蛋白主要参与细
胞结构、 细胞内运动和细胞分裂等主要细胞生理活动 [1]。
常规的植物肌动蛋白通常由 376~377 个氨基酸残基组
成，具有高度的保守性和表达稳定性 [2]。 其编码基因是目
前植物基因表达分析中常用的内参之一。 已有研究表明，
肌动蛋白是由多基因家族编码的， 有多种肌动蛋白的异
型体 [3]。 植物肌动蛋白异型体在一级结构上的同源性很
高，但时空表达调控方式不同，表达具有组织特异性，可
能执行不同的功能[4-5]。
迄今为止，在许多高等植物上已克隆到 actin 基因。但
有关扁穗牛鞭草（Hemarthria compressa）actin 基因的研究
尚未见报道。 扁穗牛鞭草是禾本科牛鞭草属多年生暖季
型草，具有生长速度快、青绿期长、抗寒、抗旱等特点，广
泛用于南方草地畜牧业，此外，在水土保持、生态治理中
也具有广阔的应用前景。 扁穗牛鞭草抗逆性的研究正在
开展，以扁穗牛鞭草为材料，用 RT-PCR 方法克隆扁穗牛
鞭草 actin 基因片段，以此基因为内标参照，为研究其他基
因在扁穗牛鞭草中的表达和调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
取扁穗牛鞭草幼嫩叶片进行总 RNA 提取 。 试剂
RNAiso -mate for Plant Tissue、TaKaRa PrimeScriptTM RT
reagent Kit （Perfect Real Time）、TaKaRa pMDTM 19 -T
Vector、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit
Ver.3.0、SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）、Marker
DL2000购自大连宝生物公司， 胶回收试剂盒购自爱思进
生物公司。
1.2 试验方法
1.2.1 引物合成 搜索 GenBank 数据库 ， 根据水稻
（NM_001062196）、玉米（BT039000）、高梁（XM_002456645）、
结缕草 （GU290545） 的 actin 基因序列的保守区， 使用
Primer 3.0 软件设计简并引物。 actin L1：CAATGGYACTGG
AATGGTCAAG；actinR1：AGVACCTCRGGGCAYCTDAAAC。
根据试验中克隆获得的扁穗牛鞭草 actin 基因片段， 使用
Primer3.0 软件设计 real-time PCR引物。 actin L2：CCCAA
TCTATGAAGGCTACGC；actin R2：CGGCAGTGGTTGTGAA
AGAGTA。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
1.2.2 总 RNA 提取 采用大连宝生物 RNAiso-mate for
Plant Tissue 试剂盒提取总 RNA，具体操作见说明书。
收稿日期：2012-07-06
基金项目：西昌学院引进人才项目（5063）
作者简介：陈永霞（1978-），女，博士，讲师，E-mail：chyongxia@
126.com
广东农业科学 2012 年第 16期158
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2012.16.056
图 1 总 RNA 电泳检测
图 2 RT-PCR 扩增结果
图 3 胶回收产物 PCR 扩增
图 4 质粒 PCR 鉴定
1.2.3 反 转 录 合 成 cDNA 第 一 链 使 用 TaKaRa
PrimeScriptTM RT reagent Kit （Perfect Real Time） 合成
cDNA。 10 μL 体系包括： 总 RNA 3 μL，5×PrimeScript R
Buffer 2 μL，Oligo dT Primer（50 μmol/L）0.5 μL，Random 6
mers （100 μmol/L）0.5 μL，RT Enzyme Mix I 0.5 μL，DEPC
水补足 10 μL。 反应程序为：37℃ 15 min，85℃ 5 s。
1.2.4 PCR扩增 20 μL体系包括：cDNA 2.0 μL，actin L
0.6 μL，actinR 0.6 μL，Taq 酶（2.5 U/μL）0.4 μL，2×reaction
mix 10.0 μL，ddH2O补足 20 μL。 反应程序为：94℃预变性
5 min；94℃变性 30 s、53℃复性 30 s、72℃延伸 1 min，40
个循环；72℃延伸 10 min；4℃保存。
1.2.5 RT-PCR 产物回收及克隆 PCR 产物经 1.2%
的琼脂糖凝胶电泳分离， 将目的 DNA 片段采用凝胶回
收试剂盒回收目的片段。 取 3 μL 回收产物与 pMD19-T
载体 16℃连接过夜， 连接产物转化大肠杆菌感受态细
胞，LB 培养基筛选，挑取白斑，提取质粒，PCR 验证插入
片段。
1.2.6 测序与序列比较 经 PCR 鉴定为阳性的质粒送至
大连宝生物公司测序。 多重序列比对和氨基酸序列的推
导使用 DNAMAN 软件完成，BLAST 同源性搜索在美国国
家生物技术信息中心（NCBI） 站点完成。
1.2.7 实时荧光定量 PCR 条件的优化 采用 SYBR
Green I 染料法，在 Mx3000P 实时荧光定量 PCR 仪上进行
扩增和数据分析，以最小的 Ct 值和最高的荧光值为标准，
分别对循环条件、退火温度、引物浓度进行优化。
1.2.8 标准曲线的建立 以总 RNA 反转录的 cDNA
为模板 ， 利用上述定量 PCR 引物对扁穗牛鞭草 actin
基因进行常规 PCR 扩增， 产物经琼脂糖凝胶电泳后，
EB 染色，利用胶回收试剂盒对目的电泳条带进行回收
纯化， 对纯化的目的片段进行 10 倍系列稀释。 25 μL
荧光定量 PCR 体系为：SYBR R Premix Ex TaqTM （2×）
12.5 μL，actin L2 （10 μmol/L）0.5 μL，actin R2 （10
μmol/L）0.5 μL，DNA 模板 2 μL，dH2O 9.5 μL。 反应程
序为：95℃预变性 2 min；95℃变性 20 s、59℃退火 25 s、
72℃延伸 30 s，共 40 个循环。
2 结果与分析
2.1 RNA提取
提取扁穗牛鞭草的叶片总 RNA， 样品的 OD260/OD280
比值约 1.8左右， 纯度达到试验要求。 总 RNA经 1.0%琼
脂糖非变性凝胶电泳鉴定 （图 1），28 S 和 18 S 两条带清
晰可见，且 28 S 约是 18 S 的两倍，表明提取的总 RNA 较
完整，未被 RNA酶污染而降解。
2.2 扁穗牛鞭草 actin基因片段的分离
经 RT-PCR 扩增， 获得 1个 750 bp 左右的片段 （图
2），回收这条片段（图 3），经连接转化，进行 PCR 鉴定，挑
取阳性克隆（图 4）测序。
2.3 actin基因的序列分析
测序结果表明，扁穗牛鞭草 actin 基因序列长 773 bp
（图 5），编码 257个氨基酸。将该基因命名为 HcACT，序列
已提交至 GenBank。
2.4 actin基因序列同源性比较
将扁穗牛鞭草 actin 基因核苷酸序列与 GenBank 中
其他植物 actin 基因序列进行氨基酸同源性比对 （图
6）。 扁 穗 牛 鞭 草 与 玉 米 （EU96279.1）、 结 缕 草
（GU290545.1）等禾本科植物 actin 基因的一致性为 84%
以上。 与杨树（XM_02331844.1）、芭蕉（AF246288.1）、木
兰 （AF281323）、 葡 萄 （XM_002282480）、 柿 子
（AB473616.1）等其他植物 actin 基因的一致性也达 83%
以上。 可见，不同植物肌动蛋白在氨基酸组成上是高度
保守的。
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图 5 扁穗牛鞭草 actin 基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
1：扁穗牛鞭草；2：芭蕉（AF246288.1）；3：结缕草（GU290545.1）；4：木兰（AF281323）；5：葡萄（XM_002282480）；
6：柿子（AB473616.1）；7：杨树（XM_002331844）；8.玉米（EU969279.1）
图 6 扁穗牛鞭草与其他植物 actin 氨基酸序列多重比对
160
25
20
15
10
1 2 3 4 5 6 7
Th
re
sh
ol
d
Cy
cl
e
Log Starting Quantity
图 7 标准曲线
Standard Unknown
SYBR:E=101.3% R2=0.995 Stope=-3.290
140
120
100
80
60
40
20
0
-d
（ R
FU
） /
dT
65 70 75 80 85 90 95
温度（℃）
图 8 熔解曲线
2.5 标准曲线
PCR 产物经回收纯化后作为标准品，进行 10 倍系列
稀释，采用优化的条件进行实时荧光定量 PCR，以 Ct值为
纵坐标、相对拷贝数的对数为横坐标，获得标准曲线（图
7）。 结果表明，该方法有很好的相关性，其 Ct值与模板浓
度的回归方程为 Y=-3.290Lg（x）+ 27.42，其决定系数 R2=
0.995，扩增效率 E=101.3%。
2.6 熔解曲线
扩增产物的熔解曲线（图 8）只有 1 个特异峰，表明产
物是唯一的，无引物二聚体和非特异性扩增产物，说明本
试验设计的定量 PCR 引物具有很好的特异性，PCR 反应
条件得到了较好的优化。
3 结语
实时荧光定量 PCR 技术是分析目标基因转录水平
最敏感的方法，与传统的定量方法，如 Northern blotting、
竞争性 PCR、RT-PCR 半定量检测相比， 具有重复性好、
灵敏度高、定量准确、速度快等优点，能对 mRNA 进行准
确定量 [6-8]。 为避免偏差，用荧光定量 PCR 方法测定目标
基因表达需要一个表达较为稳定的管家基因作为内参基
因 [9]。
为了获得更准确、 可靠的实时荧光定量 PCR 结果，
除了需要合理的试验设计与理想的引物之外， 试验过程
中的每一步要求都很严格，包括 RNA的提取质量、聚合酶
的扩增效率、cDNA的合成以及 PCR准备过程中的准确操
作和防止污染等[10]。
actin 基因被广泛用作内参基因， 是内参基因中使用
次数最多的。 本研究首次采用 pMD-19T载体克隆、测序，
获得编码 257个氨基酸的扁穗牛鞭草 actin 基因核苷酸序
列。 这为研究其他基因在扁穗牛鞭草中的表达和调控奠
定基础。
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