全 文 ：网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／４６．１０４９．Ｒ．２０１３０１２１．１６４７．００２．ｈｔｍｌ
［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３１１６００３０）。
［作者简介］高新征（１９７８－），女，山东郯城人 ，讲师，电话：０８９８－６６８９３７４８，电子信箱：ｇｏｏｄｌｕｃｋｇｘｚｈ＠１２６．ｃｏｍ。
［通讯作者］蔡望伟，电话：０８９８－６６９６８７５３，电子信箱：ｃａｉｗｗ５９１０２０＠１６３．ｃｏｍ。
［收稿日期］２０１３－０１－１４　　［修回日期］２０１３－０１－２０　　网络出版时间：２０１３－０１－２１　１６：４７
夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因片段的克隆及表达分析
高新征１，刘　嫱２，邬　强３，唐历波１，李　栎１，蔡望伟１＊
（海南医学院１．理学院，２．药学院，３．热带医学与检验医学院，海南 海口　５７１１０１）
　　［摘要］目的：克隆夏侧金盏花中Ａｃｔｉｎ基因片段并分析其组织部位表达，为以Ａｃｔｉｎ基因为内参研究夏
侧金盏花中其它基因的表达和调控奠定基础。方法：通过比较其它植物中Ａｃｔｉｎ基因序列，设计夏侧金
盏花Ａｃｔｉｎ基因片段的ＰＣＲ引物，扩增产物经克隆和测序，获得序列信息；根据获得的序列设计半定量
ＲＴ－ＰＣＲ引物，分析Ａｃｔｉｎ基因在夏侧金盏花不同组织部位的表达。结果：克隆获得一长度为１　００９ｂｐ
的夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因片段，命名为ＡｄＡＣＴ，并在ＧｅｎＢａｎｋ注册，登录号为ＪＸ４３６１６２；半定量ＰＣＲ
研究发现其在不同组织部位的表达无显著差异。结论：本研究初步表明其可作为研究夏侧金盏花基因
表达的内参基因。
［关键词］夏侧金盏花；Ａｃｔｉｎ基因；基因克隆；基因表达
［中图分类号］Ｑ３４４．１３　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００７－１２３７（２０１３）０３－０２９３－０３
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ
ＧＡＯ　Ｘｉｎ－ｚｈｅｎｇ１，ＬＩＵ　Ｑｉａｎｇ２，ＷＵ　Ｑｉａｎｇ３，ＴＡＮＧ　Ｌｉ－ｂｏ１，ＬＩ　Ｌｉ　１，ＣＡＩ　Ｗａｎｇ－ｗｅｉ　１＊
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｉｎａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ；２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｉｎａｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ；３．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈａｉｎａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈａｉｋ－
ｏｕ　５７１１０１，Ｈａｉｎａｎ　Ｃｈｉｎａ）
［Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｊｅｃｔ］：Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（ｇｒａｎｔ　Ｎｏ．３１１６００３０）
［Ａｕｔｈｏｒ］：ＧＡＯ　Ｘｉｎ－ｚｈｅｎｇ （１９７８－），Ｆｅｍａｌｅ，Ｔａｎｃｈｅｎｇ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｌｅｃｔｕｒｅｒ，Ｔｅｌ：０８９８－６６８９３７４８，
Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｏｏｄｌｕｃｋｇｘｚｈ＠１２６．ｃｏｍ．
［Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ｔｏ］：ＣＡＩ　Ｗａｎｇ－ｗｅｉ，Ｔｅｌ：０８９８－６６９６８７５３，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃａｉｗｗ５９１０２０＠１６３．ｃｏｍ ．
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０１３－０１－１４　　Ｒｅｖｉｓｅｄ：２０１３－０１－２０　 ＪＨＭＣ，２０１３；１９（３）：０２９３－０２９５
Ｖｉｅｗ　ｆｒｏｍ　ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ：Ｉｔ　ｉｓ　ｃｒｅａｔｉｖｅ，ａｎｄ　ｏｆ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄ　ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ　ｖａｌｕｅ．
［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｆｏｒ
ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｄｅｓｉｇｎ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｃｔｉｎ
ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｌｉｇｎ　Ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ　ａｓ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｆｔｅｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｔｈｅｎ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａ－
ｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　Ａｄｏｎｉｓａｅｓｔｉｖａｌ
ｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｎ　Ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ　ｗｉｔｈ　１　００９ｂｐ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ａｓ
ＡｄＡＣＴ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　ｔｏ　Ｇｅｎｂａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＪＸ４３６１６２）；ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｓ－
ｓａｙｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆｆｅｒ－
ｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　ＡｄＡＣＴ　ｃａｎ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ．
［ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ］Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ；Ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ；Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
３９２
海南医学院学报　２０１３，１９（３）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｉｎａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　
DOI:10.13210/j.cnki.jhmu.2013.03.001
　　夏侧金盏花，又名福寿草，学名Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａ－
ｌｉｓ，毛茛科植物，其干燥全草可入药，具有强心、利尿
功效，可用于治疗心悸、水肿、癫痫等疾病［１，２］。夏
侧金盏花一个特别之处是，其花中具有较高含量的
虾青素［３，４］。虾青素是类胡萝卜素合成中的最高级
别产物，具有极强的抗氧化活性，在保健品、药品、高
档化妆品等方面均有很大需求和应用前景［５－６］。高
等植物一般不含虾青素，但作为特例，夏侧金盏花的
花瓣中有较高含量虾青素，因此夏侧金盏花成为研
究植物虾青素合成途径及机理的理想材料［７］。
肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）是广泛存在的组成型表达蛋
白质，它是构成细胞骨架的主要成分。Ａｃｔｉｎ基因
不论在核苷酸还是氨基酸水平上都具有高度的保守
性和同源性，在各种组织中表达相对稳定，因而常被
作为研究其他基因的表达模式及调控机制的分子内
标，在半定量和定量ＰＣＲ研究中用作内参，以确定
目标基因的相对表达量［８］。迄今为止，已在许多高
等植物中克隆到了 Ａｃｔｉｎ基因［９］，但夏侧金盏花中
Ａｃｔｉｎ基因的克隆未见报道。本研究克隆了夏侧金
盏花中Ａｃｔｉｎ基因片段，并验证了其在不同组织部
位的稳定表达，初步表明其可作为内参基因，为研究
其他基因（比如虾青素合成相关基因）在夏侧金盏花
中的表达和调控奠定基础。
１　材料与方法
１．１　实验材料
夏侧金盏花种子点播于营养土，在光照培养箱
中于２３℃、长日照条件（１６ｈ光照，８ｈ黑暗）下培
养。ＴＡ克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ、反转录酶、Ｔａｑ　ＤＮＡ
聚合酶、凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公司。引
物合成和序列测定由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提供。
１．２　引物设计
通过比对 ＧｅｎＢａｎｋ 上拟南芥 （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ）、甜菜（Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、陆地棉（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ
ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、蒺藜苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、牡丹
（Ｐａｅｏｎｉａ　ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ）、蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）和
细叶榕（Ｆｉｃｕｓ　ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ）的 Ａｃｔｉｎ基因序列，在保
守区设计扩增夏侧金盏花 Ａｃｔｉｎ基因片段的引物，
其上游引物序列 ＡｃｔｉｎＦ：ｃｔｔｇｔｇｔｇｔｇａｃａａｔｇｇａａｃ，下
游引物序列 ＡｃｔｉｎＲ：ａｔｃｃａｃａｔｃｔｇｔｔｇｇａａｇｇｔ。经克隆
和测序后，根据获得的 Ａｃｔｉｎ基因片段序列设计半
定量 ＲＴ－ＰＣＲ引物，其上游引物ｒｔＦ：ｃｃｃｃｔｇａａｇａａ－
ｃａｃｃｃａｇｔａ，下游引物ｒｔＲ：ｃａａｇｇｔｃｃａａａｃｇｇａｇｇａｔａ。
１．３　ＲＮＡ提取和反转录
采用天根生物公司（北京）的ＲＮＡｐｒｅｐ　ｐｕｒｅ植
物总ＲＮＡ提取试剂盒提取夏侧金盏花植株的根、
茎、叶、花四个组织部位的总ＲＮＡ，并通过琼脂糖凝
胶电泳和紫外分光光度计测量 ＯＤ值检测ＲＮＡ的
完整性、纯度和浓度。使用大连宝生物公司的
ＳＹＢＲ®ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ™ ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ　ＩＩ试剂盒的
反转录试剂将 ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，作为基因扩
增和表达分析的模板。
１．４　ＲＴ－ＰＣＲ扩增Ａｃｔｉｎ基因片段
使用大连宝生物公司的ＬＡ　Ｔａｑ酶，按下列组
份配制 ＰＣＲ 反应液：引物 ＡｃｔｉｎＦ 和 ＡｃｔｉｎＲ（２０
μＭ）各１μＬ，ｃＤＮＡ模板２μＬ，ｄＮＴＰ（２．５μＭ）４
μＬ，ＬＡ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ，ＬＡ　Ｔａｑ酶０．５μＬ，加入
ｄｄＨ２Ｏ补足到５０μＬ。ＰＣＲ 反应条件为：９５℃ ３
ｍｉｎ预变性后９５℃３０ｓ、５４℃３０ｓ、７２℃６０ｓ，３０
个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物电泳后回
收目的条带，与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接后转化大肠杆
菌。
１．５　半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析Ａｃｔｉｎ基因表达
分别以夏侧金盏花植株的根、茎、叶、花四个组
织部位的总ＲＮＡ反转录成的ｃＤＮＡ为模板，按照
下列组份配制 ＰＣＲ 反应液：引物ｒｔＦ和ｒｔＲ（２０
μＭ）各０．５μＬ，ｃＤＮＡ模板２μＬ，ｄＮＴＰ（２．５μＭ）２
μＬ，ＬＡ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，ＬＡ　Ｔａｑ酶０．２５μＬ，加
入ｄｄＨ２Ｏ补足到２５μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９５℃３
ｍｉｎ预变性后９５℃３０ｓ、５６℃３０ｓ、７２℃６０ｓ，２８
个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ。
２　结果与分析
２．１　Ａｃｔｉｎ基因片段的扩增和克隆
以夏侧金盏花总ＲＮＡ反转录得到的ｃＤＮＡ为
模板，使用在序列保守区设计的引物ＡｃｔｉｎＦ和Ａｃ－
ｔｉｎＲ进行ＰＣＲ扩增。扩增产物经凝胶电泳结果如
图１所示，在１　０００ｂｐ左右处有一条亮带，且上下
无杂带，与预期的目标片段大小一致。回收此片
段，与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接后转化大肠杆菌。挑取
单菌落进行ＰＣＲ鉴定，获得了６个阳性克隆（图
１）。送其中３个克隆进行测序，获得了一个大小为
１　００９ｂｐ的夏侧金盏花 Ａｃｔｉｎ基因片段的序列，命
名为ＡｄＡＣＴ，并将其在 ＧｅｎＢａｎｋ注册，登录号为
ＪＸ４３６１６２。
Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲ扩增片段；２－７：６个克隆的ＰＣＲ
鉴定
图１　夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因片段的扩增和克隆
４９２ 　海南医学院学报 Ｖｏｌ．１９Ｎｏ．３Ｍａｒ．２０１３
２．２　Ａｃｔｉｎ基因片段的序列分析
将获得的夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因片段的核酸序
列及其所编码的蛋白序列在 ＮＣＢＩ网址上进行
ＢＬＡＳＴ 比对分析 （ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），结果显示，夏侧金盏花 Ａｃｔｉｎ基因
片段的核酸序列与细叶榕（Ｆｉｃｕｓ　ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ）、毛果
杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）以及蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕ
ｎｉｓ）的 Ａｃｔｉｎ基因序列相似性最高，均为８７％（表
１）；其编码的蛋白序列与油桐（Ｖｅｒｎｉｃｉａ　ｆｏｒｄｉ）、甜
叶菊（Ｓｔｅｖｉａ　Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）、陆地棉（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒ－
ｓｕｔｕｍ）、苹果 （Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、牡丹 （Ｐａｅｏｎｉａ
ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ）等多种植物的 Ａｃｔｉｎ蛋白序列均具有
９９％的相似性（表２）。这表明本研究克隆的序列为
夏侧金盏花的Ａｃｔｉｎ基因序列。
表１　夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因片段的核酸序列的ＢＬＡＳＴ比对结果
Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｍａｘ
ｓｃｏｒｅ
Ｔｏｔａｌ
ｓｃｏｒｅ
Ｑｕｅｒｙ
ｃｏｖｅｒ
Ｅ
ｖａｌｕｅ
Ｍａｘ
ｉｄｅｎｔ
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｆｉｃｕｓ　ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ　ａｃｔｉｎ　１ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ　 １　１３６　 １　１３６　 ９９％ ０　 ８７％ ＪＱ８２０２４３．１
Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ　ａｃｔｉｎ　ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ　 １　１２５　 １　１２５　 ９９％ ０　 ８７％ ＥＦ４１８７９２．１
Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ　ａｃｔｉｎ，ｐｕｔａｔｉｖｅ，ｍＲＮＡ　 １　１１２　 １　１１２　 ９９％ ０　 ８７％ ＸＭ＿００２５２２１４８．１
Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ　ａｃｔｉｎ　７ｂｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ　 １　０９２　 １　０９２　 ９９％ ０　 ８６％ ＨＱ３９５７
Ｍｏｒｕｓ　ａｌｂａ　ａｃｔｉｎ　１（ＡＣＴ１）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ　 １　０９０　 １　０９０　 ９９％ ０　 ８６％ ＨＱ１６３７７６．１
Ｖｅｒｎｉｃｉａ　ｆｏｒｄｉ　ａｃｔｉｎ７ａ（ＡＣＴ７ａ）ｍＲＮＡ，ｐａｒｔｉａｌ　ｃｄｓ　 １　０８１　 １　０８１　 ９９％ ０　 ８６％ ＪＱ６８００３５．１
Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ　ａｃｔｉｎ（ＡＣＴ９）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ　 １　０８１　 １　０８１　 ９８％ ０　 ８６％ ＡＹ３０５７３７．１
表２　夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因片段编码的蛋白序列的ＢＬＡＳＴ比对结果
Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｍａｘ
ｓｃｏｒｅ
Ｔｏｔａｌ
ｓｃｏｒｅ
Ｑｕｅｒｙ
ｃｏｖｅｒ
Ｅ
ｖａｌｕｅ
Ｍａｘ
ｉｄｅｎｔ
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ａｃｔｉｎ７ａ，ｐａｒｔｉａｌ［Ｖｅｒｎｉｃｉａ　ｆｏｒｄｉ］ ６９２　 ６９２　 １００％ ０　 ９９％ ＡＦＪ０４５１３．１
ａｃｔｉｎ［Ｓｔｅｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］ ６９２　 ６９２　 １００％ ０　 ９９％ ＡＡＮ４０６８５．１
ａｃｔｉｎ［Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ］ ６９１　 ６９１　 １００％ ０　 ９９％ ＡＡＰ７３４５７．１
ａｃｔｉｎ，ｐａｒｔｉａｌ［Ｍａｌｕｓ　ｘ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ］ ６９１　 ６９１　 １００％ ０　 ９９％ ＢＡＬ１４２７１．１
ａｃｔｉｎ［Ｌｉｔｃｈｉ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ］ ６９１　 ６９１　 １００％ ０　 ９９％ ＡＤＶ１７４６０．１
ａｃｔｉｎ［Ｐａｅｏｎｉａ　ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ］ ６９１　 ６９１　 １００％ ０　 ９９％ ＡＥＫ７０３３１．１
ａｃｔｉｎ　１［Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ］ ６９１　 ６９１　 １００％ ０　 ９９％ ＸＰ＿００２２９８７１０
２．３　Ａｃｔｉｎ基因的表达分析
分别提取夏侧金盏花植株的根、茎、叶、花四个
组织部位的总ＲＮＡ，并反转录成ｃＤＮＡ，以此为模
板通过半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因
的组织部位表达。结果如图２所示，夏侧金盏花
Ａｃｔｉｎ基因在４个组织部位的表达相对稳定。
１：根；２：茎；３：叶；４：花
图２　夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因的组织部位表达分析
３　讨论
肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）普遍存在于真核细胞中，目前
许多高等植物中都已克隆到了 Ａｃｔｉｎ基因，结果发
现Ａｃｔｉｎ基因无论是在核酸序列水平还是氨基酸序
列水平上，都具有高度保守性［９］。本研究克隆获得
的夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因片段的核酸序列及其编码
的蛋白序列与其它植物中的Ａｃｔｉｎ的核酸序列和蛋
白序列的最高相似性分别为８７％和９９％，再次证明
了Ａｃｔｉｎ基因是一种高度保守的看家基因。
植物Ａｃｔｉｎ基因不仅在序列结构上具有高度的
保守性和同源性，并且在各种组织部位中表达相对
稳定，因而在半定量和定量ＰＣＲ实验中常被选为内
参基因，以确定目标基因的相对表达量。由于夏侧
金盏花中Ａｃｔｉｎ基因的克隆未见报道，因此尚不能
以它为内参基因进行基因表达分析。本研究克隆了
（下转第２９９页）
５９２高新征等．夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因片段的克隆及表达分析
参考文献
１　宛丰，黄梅，吕衍文．银丹心脑通软胶囊对急性脑梗死患
者神经功能及ｓＩＣＡＭ－１、ＩＬ－１、ＩＬ－６的影响［Ｊ］．中西医
结合心脑血管病杂志，２０１２，１０（８）：９４６－９４７．
２　张隆梅．依达拉奉联合血栓通对急性脑梗死患者血清
ｈｓ－ＣＲＰ和ｓＩＣＡＭ 的影响［Ｊ］．中国实用医药，２０１２，７
（１９）：１６－１８．
３　黄兴友．脑梗死患者血清ｓＩＣＡＭｌ、ｓＶＣＡＭｌ和Ｂｃｌ－２的
表达水平及临床意义［Ｊ］．中国现代医生，２０１２，５０
（２１）：９４－９６．
４　凌芳，李强，聂德云．调脂治疗对急性脑梗死患者血清
ｈｓ－ＣＲＰ、ＩＬ－１８及 ＭＭＰ－７水平的影响及颈动脉斑块的
干预作用［Ｊ］．中华脑血管病杂志（电子版），２０１２，６
（３）：２９－３４．
５　朱卫香，刘彦敏，韩亚军，等．缺血性脑卒中患者血清
ＭＭＰ－９、Ｈｓ－ＣＲＰ与脑梗死体积及神经功能缺损的关系
［Ｊ］．中国免疫学杂志，２０１２，２８（４）：３４１－３４３．
６　Ｌｉｎ　ＣＪ，Ｙｕ　Ｍ，Ｈｕｎｇ　ＳＣ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ－ｒｏｏｍ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ
ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｖｏｌｕｍｅ　ｆｏｒ　ｇｕｉｄａｎｃｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｉｎｔｒａ－ａｒｔｅｒｉａｌ
ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｖ　Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ，２０１２，１８
（４）：４６３－４６８．
７　李强，凌芳，肖家平，等．ＰＡＳ三联疗法对急性脑梗死患
者血脂、血清ｓＣＤ４０Ｌ及 ＭＭＰ－９水平及颈动脉易损斑
块稳定性的影响［Ｊ］．中风与神经疾病杂志，２０１１，２８
（１２）：１０９０－１０９３．
８　Ｓｏｂｏｌｅｗｓｋｉ　Ｐ，Ｓｌｅｄｚｉńｓｋａ　Ｍ，Ｓｚｃｚｕｃｈｎｉａｋ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ－
ｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｃｕｔｅ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ
ｓｔｒｏｋｅ：ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１００ｃａｓｅｓ．Ｐａｒｔ　Ｉ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒ－
ｉｓｔｉｃ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．
Ｐｒｚｅｇｌ　Ｌｅｋ，２０１２，６９（６）：２３７－２４１．
９　王霞，田义龙，韩淑芬，等．脑梗死大鼠 ＭＭＰ－９、ＴＮＦ－α
的动态变化及含植物雌激素中药复方的脑保护作用
［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１１，３１（２３）：４６２６－４６２７．
１０　王鹏军，宋荣蓉，张卓伯，等．急性脑梗死患者溶栓治疗
前后血浆基质金属蛋白酶－９含量的变化及意义［Ｊ］．中
国危重病急救医学，２０１０，２２（１０）：６２１－６２３．
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
（上接第２９５页）
一个长度为１　００９ｂｐ的夏侧金盏花 Ａｃｔｉｎ基因片
段，并通过半定量ＲＴ－ＰＣＲ研究发现其在不同组织
部位的表达相对稳定，初步表明其可作为内参基
因，为研究其它基因（比如虾青素合成相关基因）在
夏侧金盏花中的表达和调控奠定了基础。由于本
研究只是初步采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ的方法研究夏
侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因在不同组织部位的表达，而要
进一步确认其完整的表达模式，则在后续研究中有
必要采用实时定量ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交等技术对
不同发育时期以及不同环境条件下（激素、温度等）
夏侧金盏花Ａｃｔｉｎ基因的表达进行分析。
综上所述，本研究克隆了夏侧金盏花的 Ａｃｔｉｎ
基因片段，分析了其序列结构的保守性，并验证了
其在不同组织部位的稳定表达，初步表明其可作为
内参基因，为研究夏侧金盏花中其它基因的表达和
调控奠定基础。
参考文献
１　俄丽单，贾慧颖，李贵．桂竹糖芥与黄花夹竹桃及福寿
草药理临床研究对比［Ｊ］．黑龙江医药，１９９８，（０６）：
３３３－３３４．
２　傅翔，张汉明．侧金盏花属植物成分及药理研究进展
［Ｊ］．植物资源与环境，１９９５，（０３）：５６－６０．
３　Ｍａｏｋａ　Ｔ，Ｅｔｏｈ　Ｔ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ　ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｅｓｔｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｅｔａｌｓ　ｏｆ　Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ
［Ｊ］．Ｊ　Ｏｌｅｏ　Ｓｃｉ，２０１１，６０（２）：４７－５２．
４　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　Ｆ　Ｘ，Ｇａｎｔｔ　Ｅ．Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｉｎ　ｓｃａｒｌｅｔ：ｅｎ－
ｚｙｍｅｓ　ｏｆ　ｋｅｔｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ｏｆ
Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２００５，４１（３）：４７８－４９２．
５　杨艳，周宇红，徐海滨，等．虾青素抗氧化作用动物实
验研究［Ｊ］．现代预防医学，２００９，１３：２４３２－２４３３．
６　Ｈｕｓｓｅｉｎ　Ｇ，Ｓａｎｋａｗａ　Ｕ，Ｇｏｔｏ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ，ａ
ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｗｉｔｈ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ
［Ｊ］．Ｊ　Ｎａｔ　Ｐｒｏｄ，２００６，６９（３）：４４３－４４９．
７　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　Ｆ　Ｘ，Ｇａｎｔｔ　Ｅ．Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｗａｙ
ｔｏ　ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ｏｆ　Ａｄｏｎｉｓ　ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２０１１，２３：３０５５－３０６９．
８　Ｔｈｅｌｉｎ　Ｏ，Ｚｏｒｚｉ　Ｗ，Ｌａｋａｙｅ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ
ｇｅｎｅｓ　ａｓ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ：ｕｓｅ　ａｎｄ　ｌｉｍｉｔｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏ－
ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，７５：２９１－２９５．
９　张少斌，刘国琴．植物肌动蛋白异型体研究进展［Ｊ］．
植物学通报，２００６，（０３）：２４２－２４８．
９９２袁勇等．脑梗死患者溶栓前后的多项炎性因子及ＶＥＧＦ、ｓＩＣＡＭ－１、ｓＶＣＡＭ－１、ＭＭＰ的变化规律研究