全 文 ：假高粱及其近似种同源性研究进展①
印丽萍1 　邓　晟2 　易建平1 　邬　宏1
(1.上海出入境检验检疫局　200135　2.南京农业大学植物保护系)
摘要　本文通过形态学 、细胞学以及分子生物学 3个层次对高粱属的假高粱及其近似种
的同源性研究进行了总结 ,同时归纳了 3个不同阶段具有重要影响的理论 、试验方法和试验成
果。
关键词　假高粱　同源性　近似种
　　高粱属(Genus Sorghum)中的许多种为抗
干旱作物 ,在世界各干旱地区有广泛的种植 ,
作为粮食 、饲料 、工业原料等具有很高的经济
价值。但由于该属种类繁多 ,也出现了许多
种杂草 ,它们具有极强的适应能力 ,其中 ,最
著名的就是假高粱(Sorghum halepense (L.)
Pers)。假高粱是危害大 、繁殖快 、难防治的
世界十大恶性杂草之一 ,被我国列为二类进
境植物危险性有害生物 。假高粱原仅在广
东 、福建 、台湾地区有引种分布 , 1997 年 ,深
圳口岸截获到一批假高粱的杂交种丝克高粱
(S .silk)的进口种子 ,后被强行退回[ 1] 。假
高粱 、丝克高粱 、黑高粱(S.almum)、光高粱
(S .nitidum)、拟高粱(S.propinquum)、苏丹
草(S.sudanense)、二色高粱(S .bicolor)等在
形态特征上极为近似 ,对它们的分类地位和
同源性进行研究 ,可加大对假高粱及其近似
种的检疫力度 ,从而防止假高粱及其近似种
进一步在我国范围内扩散 。
1　假高粱及其近似种同源性研究的阶段和
主要方法
1.1　形态学
形态学分类是高粱属分类的第 1 个阶
段 ,工作的理论基础为古典植物分类学和系
统植物分类学。古典植物分类主要是根据植
物的外部形态器官———营养和生殖器官的差
别 ,进行分类和命名 ,方法只限于描述和绘
图。系统分类学注意研究植物之间的相互关
系及分布规律 ,其中以斯诺顿的分类系统最
具代表性 。斯诺顿(1936)以高粱的小穗性
状 、花序性状和植株性状为依据将世界高粱
进行了详细的分类[ 3] ,当时他把 Sorghum 区
组分成两个组 ,即 Halepensia 和Anudinsia 。在
进行系统的研究之后 , de Wet(1978)在斯诺
顿的基础上提出 Sorghum 区组应包括 3个
种 ,即产生根茎的两个种假高粱和拟高粱 ,以
及含所有野生类型和栽培类型的二色高粱 ,
而光高粱属于区组 Parasorghum , 不在 Sor-
ghum 区组内 。另外 ,除苏丹草 、光高粱以外 ,
假高粱 、丝克高粱 、黑高粱 、拟高粱都具有根
状茎[ 4] 。
从形态学水平上看 ,我们可以得出这样
一个结论:假高粱与丝克高粱 、黑高粱 、拟高
粱的同源性很相近 ,苏丹草次之 ,因为它没有
根状茎 ,而光高粱最远 ,既不在 Sorghum 区组
内 ,同时又没有根状茎 。但值得提出的是从
许多种的分类我们发现 ,形态上相似的物种
其同源性不一定相近。
1.2　细胞遗传学阶段
细胞遗传分类学就是将细胞有丝分裂时
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染色体数目和形态 ,以及染色体在减数分裂
时的配对行为作为分类学的重要证据。该方
法作为研究分类的方法 ,在科 、族级类群 、属
级类群以及种级和种以下类群的划分中得到
了广泛的应用 。Carber(1950)对斯诺顿分类
系统进行了较大的修改 ,提出了以细胞遗传
学研究结果与形态学特征 、地理分布相结合
的分类系统 ,他把高粱属分为 6个亚属:其中
优高粱亚属(Eusorghum)包括染色体数为 2n=
20的二色高粱及其分布于非洲与亚洲的染
色体数为 2n=20 、2n=40的近亲野生种类;
拟高粱亚属(Parasorghum)包括分布于东半
球和中美洲的染色体数为 2n=10 、2n=20(个
别种染色体数为 2n=30或 2n=40)的种;蒴
柄高粱亚属(Chaetosorghum)和异高粱亚属
(Heterosorghum)均为单型属 ,各包含一个分
布于南太平洋的染色体数为 2n=40的种;有
柄高粱亚属(Stiposorghum)由5种发现于澳大
利亚北部的染色体数主要为 2n=10(只 S.
plumosum 为 2n=20)的种组成;假高粱亚属
(Sorghastrum)包括分布于非洲及热带美洲的
2n=10的野生种。在他以后 , Celarier 等经过
研究认为 Sorghastrum 应单独作为一属 ,因为
它与 Saccharum L.具有较近的亲缘关系[ 5] 。
根据以上的细胞分类特点以及假高粱等
几个近似种的发源地和染色体数目 ,我们将
它们进行如下归类:二色高粱 、拟高粱 ,产于
印度;苏丹草(2n=20)产于苏丹 ,它们是优高
粱亚属的 ,而由二色高粱和拟高粱杂交产生
的假高粱(2n=40)[ 6] ,以及由二色高粱和假
高粱杂交产生的黑高粱 ,假高粱与 S .arum-
dinaccum 的杂交种丝克高粱 ,也都属于该属。
而只有光高粱(2n=10),产于东南亚 ,是属于
拟高粱亚属[ 7] 。
细胞遗传学分类利用高粱的染色体数目
和形态及染色体在减数分裂时的配对行为在
一定程度上搞清了高粱属各类群的系统演变
关系 ,尤其是在野生种类的区分上与形态学
分类相比取得了较大的成功。但是 ,由于高
粱属内不同种的染色体数目变化较大 ,至今
仍有其染色体基数为 n=10或为 n=5之争 ,
所以极难对一些高粱种类所产生的多倍体复
合体进行划分 。另外 ,高粱属内某些种间杂
交也能产生可育后代 ,这就使人们对利用染
色体进行分类的方法产生了怀疑。于是采用
生物化学和分子生物学进行分类的方法出现
了。
1.3　生物化学和分子生物学水平
随着科技水平的不断发展 ,新的方法被
应用于物种的分类以及同源性研究中。主要
分为两个阶段:早期的生物化学分类时期和
20世纪 80年代末开始的分子分类时期 。
1.3.1　生物化学分类
这一时期工作的重点多为蛋白质的血清
鉴定及其电泳图谱和序列分析 ,另外还有同
工酶分析。许多学者用该方法对高粱属的一
些种作了同源性的研究。
J.R.C.Smith 等(1988)运用高效液相色
谱方法分析了 7个二色高粱近交系与假高粱
的高粱醇溶蛋白和醇溶谷蛋白的液相色谱峰
型 ,发现这两种蛋白在它们中的含量与它们
的基因型有密切的关系 ,近交系间有较近的
亲缘关系且都与假高粱的关系较远[ 8] 。
Morden等(1990)通过同工酶的研究 ,得
出了支持 de Wet和Huckabay(1967)及 de Wet
(1978)在斯诺顿(1936)的基础上提出 Sor-
ghum 区组包括 3个大种 ,即产生根茎的 ,包
含所有1年生的野生杂草的两个种假高粱和
拟高粱 ,以及栽培类型的 S.bicolor 这一划分
方法的结果。
1.3.2　分子生物学分类
20世纪 80年代产生了以核酸资料为基
础探讨生物类群间系统演化关系的新学科
———分子分类学[ 9] 。分子分类所依赖的手段
主要为 DNA分子标记技术 ,包括以电泳技术
和分子杂交技术为核心的 RFLP(Restriction
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Fragment Length Polymorphism)和 DNA指纹分
析 、以电泳技术和 PCR技术为核心的 RAPD
(Random Amplified Polymorphlic DNA)、SSR
(Simple Sequence Repeat)和 ARFP(Amplified
Restriction Fragment Polymorphism)以及以 DNA
序列为核心的 ITS(Internal Transcribed Spac-
ers)测序分析技术等 3大类[ 10] 。这几种简易
的DNA序列分析手段是用于检测属 、种级水
平基因多态性的行之有效的工具 ,用它们获
得的分子标记在生物学领域得到广泛应用。
RFLP , RAPD , ITS测序分析 3种方法在假高粱
及其近似种同源性分析方面的研究进展如
下。
1.3.2.1　RFLP———限制性片断长度多态性
分析法
RFLP 方法大量应用于作物的品种选育 ,
分子标记多样性分析以及遗传连锁图谱的和
绘制等方面。在高粱属研究工作方面 ,该方
法也作了许多重要贡献。
拟高粱被认为是区组 Sorghum 的最初遗
传物质来源[ 2] 。Chittenden 等用 337 个高粱
的低拷贝探针对高粱和拟高粱进行了 RFLP
分析 ,95%的探针检测到了种间的高度多态
性 ,认为这两个种从最近的共同祖先产生了
相当的分化[ 11] 。然而 , Y.Sun 等(1994)对高
粱及其近缘种的核糖体 DNA 的内转录间隔
子进行了研究 ,发现假高粱 、拟高粱 、二色高
粱和小种 aethiopicum 的 ITS序列相同[ 12] 。结
合形态学的相似性和杂交表现[ 2 , 11] 他们认为
拟高粱与二色高粱的关系很近 。
假高粱(2n=4x=40)被认为是二色高粱
内部产生的 , 其亲本是 ssp.verticilliflorum 的
小种 virga-tum和二色高粱或是二色高粱和拟
高粱的节段异源四倍体杂交后代[ 13] 。Pater-
son等(1995)对二色高粱和拟高粱的杂交后
代(BC1 和 F2)进行了 RFLP 分析 ,其结果支
持以上假说 ,认为假高粱中的控制根茎的基
因来自拟高粱。但 Ragab经 RFLP分析发现 ,
假高粱与拟高粱之间共有的片段显著少于与
双色高粱种之间的共有片段 ,说明假高粱中
含有更多双色种的成分[ 14] 。Deu等(1995)未
发现二色高粱和假高粱间的线粒体 DNA有
分化 ,据此认为前者是后者的母体[ 15] ,而且
黑高粱与以上两个种的线粒体 DNA也无分
化现象。由此可见 ,假高粱与拟高粱 、黑高粱
有着极为近似的同源性 ,同样 ,由假高粱杂交
产生的丝克高粱与它们的同源性的近似程度
亦是不言而喻的 。而相比之下 ,苏丹草与假
高粱的同源性较远 ,而光高粱的关系更远 。
这一结论刚好与形态学的分类结果相吻合。
1.3.2.2　RAPD———随机扩增多态性 DNA分
析法
RAPD技术利用 PCR原理 ,以随机引物
(一般为10个残基的寡聚核苷酸)扩增样品
总DNA ,扩增后的产物通过电泳 ,可检测出
从样品中扩增出的不同的 DNA片段带型[ 16] 。
RAPD标记是一类显性遗传标记 ,并以孟德
尔方式遗传[ 17] 。植物的遗传多样性的产生
最基本的形式是外源基因导入和基因突变 ,
在外源基因导入过程中 ,子代中所具有的基
因至少在双亲之一中存在 ,亦即子代中具有
的 RAPD标记 ,在亲本中应该能够发现 ,子代
综合了双亲各自的一些特异带 ,因此子代所
具有的 RAPD标记应不少于单个的父本或母
本[ 18] 。钟小仙等(2002)用苏丹草和拟高粱进
行远缘杂交试验 ,随机选取 20个引物对母本
苏丹草 、父本拟高粱和 3 株杂种 F1 代进行
PCR反应。经电泳检测显示 ,母本苏丹草 、父
本拟高粱和 3个杂种 F1 代表现出多态性条
带 ,其中有一对引物扩增的结果尤为突出 。
不仅条带清晰 ,而且 3 次重复均表现稳定 。
结果表明 , 3个杂种 F1 不仅具有母本特有的
条带A ,而且还有父本拟高粱特有的条带 B 。
另一对引物扩增结果也表明 ,3 个 F1 不仅具
有母本苏丹草特异条带 C ,而且具有父本拟
高粱的特异条带D[ 19] 。
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1.3.2.3　4ITS ———内转录间隔区间分析法
真核生物的 rDNA 为串联重复序列 ,每
一串联重复序列包含两个 ITS 区(ITS1 、ITS2)
和3个在种间非常保守的编码区(18S , 5.8S ,
28S)。两个 ITS 区在种间变异较大 ,而在种
内变异较小 ,故其成为当前研究同源性和遗
传关系的重要区段和主要分析对象之一 。
Sun 等(1994)以分属于高粱组(Sor-
ghum)、蒴柄高粱组(Chaetosorghum)、异高粱
组(Heterosorghum)、拟高粱组(Parasorghum)、
有柄高粱组(Stiposorhhum)的 15个种及亚种
为研究对象 ,运用 PCR技术特异扩增了它们
的 rDNA 内转录间隔区(ITS1 , ITS2),并对之
进行了测序。研究结果表明 ,高粱组中的拟
高粱 、假高粱及二色高粱的 1个亚种 arundi-
naceum 可能为二色高粱中与野生高粱亲缘关
系最近的种类;拟似高粱组中的光高粱可能
为基因组 2n=10 的类型中与二色高粱亲缘
关系最近的一种;蒴柄高粱组与异高粱组之
间彼此亲缘关系较近 ,并且两者比拟似高粱
组更靠近高粱;拟似高粱组非单源发生类型 ,
从而以分子水平的证据验证了以往基于形态
特征水平进行的推测[ 20] ,我们利用通用引物
扩增的黑高粱的 ITS 区段与假高粱的 ITS 区
段比较发现 ,其差异仅为 1个 bp。而扩增出
的光高粱 ITS区段与假高粱的差别就显得较
大 ,为 6个 bp(待发表)。
Sun 等(1994)建议把光高粱划到 Sor-
ghum 区组 ,或另立一区组 。但我们(2003)的
实验中 ,将扩增出的光高粱的 ITS 序列和与其
现在在同一区组 ,即拟高粱区组的 S.versicol-
or序列相比较发现 ,它们之间碱基的差异要明
显少于同 Sorghum 区组的假高粱的差异 ,认为
将光高粱保留在现有的区组内更合适 。
2　展望
通过形态学 、细胞学和分子生物学 3个
层次的比较 ,用分子生物学的分析方法鉴定
假高粱及其近似种时差异量化 ,因为它能从
事物的本质进行研究和作出客观的判断 ,避
免了许多人为因素的影响。但是 ,片面地依
赖于分子生物学的方法而摒弃形态学和细胞
学的研究方法是不可取的 ,因为当前在分子
生物学方面的研究还不够深入 ,由于采用的
方法不同 ,得出的结论也有可能不同 。只有
将形态学 、细胞学 、分子生物学 3 者结合起
来 ,才能从根本上解决问题 。目前的研究可
以发现 ,假高粱及其几个近似种在 ITS 区段
内很难找到合适的特异性引物能将其鉴定出
来 ,但是分子生物学的世界丰富多彩 ,还有许
多未知的领域等待人们去发现和探索。相信
经过广大检疫工作者的不懈努力 ,在不久之
后一定能找到准确 、简便 、快捷的鉴定假高粱
的方法。
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植物病毒检测新技术研究进展①
商明清　　　　　　　　　　魏梅生
(山东省植物保护总站　济南　250100)　　(国家质检总局动植物检疫实验所)
摘要　本文主要介绍了酶联免疫吸附测定 、快速免疫滤纸测定 、免疫胶体金技术 、毛细管
区带电泳 、免疫 PCR等血清学方法和 PCR 、分子信标 、实时 RT-PCR、核酸杂交等分子生物学方
法的原理及特点 ,并重点介绍了近几年发展起来的免疫胶体金技术 、毛细管区带电泳 、分子信
标和 TaqMan®实时 RT-PCR等植物病毒检测技术 。
关键词　植物病毒　检测　免疫胶体金技术　免疫毛细管区带电泳　分子信标　实时
PT-PCR
　　植物病毒病害是一类重要病害 ,几乎在
各类作物上都有发生 ,严重影响农作物的产
量和质量 ,用一般的方法难以防治 ,是生产上
的一大难题。种植无病毒种子 、苗木是一种
非常有效的防治措施。因而如何对种子 、苗
木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进
行快速准确地检测诊断就显得尤为重要 。最
初植物病毒检测主要依靠生物学性状 ,但生
物学方法费时费力 ,检测周期长 ,而且易受环
境条件的影响 ,反应不稳定 、重复性差。目前
植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外
壳蛋白为基础)和核酸检测 ,前者主要包括
ELISA 、快速免疫滤纸测定 、免疫胶体金技术 、
免疫毛细管区带电泳 、免疫 PCR等;后者主
要有 PCR、分子信标 、实时 RT-PCR和核酸杂
交等 。
1　血清学检测方法
1.1　酶联免疫吸附测定(ELISA)
酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主
要为聚苯乙烯酶联板)吸附 ,将免疫反应和酶
的高效催化反应有机结合的方法 ,其基本原
理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结
合。ELISA方法简单 ,灵敏度高 ,特异性强 ,
适于大量样品的检测 ,目前该方法已被广泛
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① 收稿日期:2004-01-18