全 文 ：朱砂七总蒽醌抗肿瘤的实验研究
赵 勤, 郭惠玲,郭 玲,张晓双,胡 悦,刘继平,张恩户
(陕西中医学院药理教研室,陕西 咸阳 712046)
摘 要: 目的:研究朱砂七总蒽醌的体内外抗肿瘤作用。方法: 通过朱砂七总蒽醌对 S180、和 H22荷瘤小鼠瘤重的研
究, 观察朱砂七总蒽醌的体内抗肿瘤作用。应用 MTT法检测朱砂七总蒽醌对 HL -60细胞的生长抑制作用, G iem sa染色
法从形态上观察朱砂七总蒽醌对 HL - 60细胞凋亡的影响。结果: 朱砂七总蒽醌具有抑制小鼠肿瘤 S180和 H22的作用,抑
制率在 40%以上, 与对照组比较差异有显著性意义 ( P < 0. 01); 朱砂七总蒽醌能明显抑制 HL - 60细胞的增殖, 半数抑
制浓度 ( IC50)为 3. 2m g /m L;形态学观察显示朱砂七总蒽醌作用 HL - 60细胞后, 可见典型的凋亡细胞的形态学特征。
结论: 朱砂七总蒽醌在体内对小鼠肿瘤 S180和 H 22均有抑制作用; 体外试验证实:能抑制 H L - 60细胞的增殖, 诱导细
胞凋亡可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。
关键词: 朱砂七总蒽醌;荷瘤小鼠;抗肿瘤作用; 细胞调亡
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 1000 -1719( 2008) 08 - 1222 - 03
收稿日期: 2008 - 03 - 09
基金项目:陕西省教育厅资助项目 ( 04 JK150 ) ;陕西省中医管理局资助
项目 ( 95)
作者简介:赵勤 ( 1970 - ) ,女,陕西咸阳人,副教授,学士, 研究方向为抗
肿瘤中药的研究。
朱砂七, 别名朱砂莲, 为蓼科植物毛脉蓼
Po lygonum ciliinerve ( Nakai) ohw .l的块根, 产于陕西
省秦岭和大巴山区, 为 /太白七药0之一, 天然资源十
分丰富。其味苦,性凉,能清热解毒、止痛止血,主治扁
桃体炎、胃肠炎、尿路感染等感染性疾病。由于疗效显
著被5陕西卫生志6列为陕西地道名贵草药。现代研
究表明, 朱砂七含有大量蒽醌类衍生物 ( 5% ~
13. 4% ),主要为大黄素 ( emod in )、大黄素甲醚 ( phy-
scion)及其葡萄糖苷。近年来研究发现蒽醌类化合物
具有抑制肿瘤的发生、促进肿瘤凋亡的作用。朱砂七
与大黄同为蓼科植物, 都含有蒽醌类化合物, 且含量
高。但是关于朱砂七总蒽醌的研究, 国内只有少量的
动物实验和细胞培养实验进行观察验证性研究朱砂七
总蒽醌具有抗炎、镇痛、抗病毒的作用, 而对于抗肿瘤
效果未见有报道,为此笔者选择从体内和体外对其抗
肿瘤作用进行研究, 以期为把朱砂七总蒽醌开发为抗
肿瘤药物以及为蒽醌类化合物抗肿瘤研究奠定理论基
础。
1 实验材料
1. 1 药品
朱砂七总蒽醌 ( ZSQ,由本实验室提取 ) ,用 1%羧
甲基纤维素钠 ( CMC -N a)配成 10%混悬液或溶于无
血清的 DMEM培养液中配成 64mg /mL的储存液, 分
装, 4e 保存。环磷酰胺 ( CTX ) , 批号 04101921, 江苏
恒瑞医药股份有限公司生产。
1. 2 主要试剂与仪器
DMEM培养基 ( Hyclone) ; EDTA、EB、PFA、柠檬酸
钠 (国产 ); MTT、姬姆萨 ( S igm a); 四氮哇盐 (M T)和二
甲基亚砜 ( D M SO ), Sigma公司; CO 2培养箱 ( 3111型,
美国 ); 酶联免疫检测仪 ( DG - 5031型, 国营华东电子
管厂 ); 分析天平 ( A120S型,德国 ); 净化工作台 ( ZYJ
- L型, 富康集团安泰公司 ) ; 倒置显微镜 ( XDS - 1
型,重庆光学仪器厂 )。
1. 3 瘤株和细胞株
S
180
、H
22
, 陕西省中医研究院定期传代瘤株。HL -
60细胞 (人粒系白血病细胞株 )、由第四军医大学口腔
生物实验室提供。
1. 4 实验动物
昆明系小鼠,雌性, 18~ 22g,由第四军医大学动物
中心提供,合格证书号: scxk(军 ) 2002 - 005。
2 实验方法
2. 1 体内抑瘤实验
取接种 7天生长良好的 S180、H22小鼠,无菌条件下
用注射器抽取腹水, 以灭菌的生理盐水 1B4稀释, 调
节细胞数为 2. 5 @ 107个 /mL, 取 0. 2mL接种于小鼠右
侧腋窝皮下。接种 24h后称重, 随机分为朱砂七总蒽
醌高剂量组 ( 1. 2g /kg )、中剂量组 ( 0. 6g /kg )、低剂量
组 ( 0. 3g /kg)、CTX组 ( 20mg /kg )和空白对照组 5组,
每组 10只,分别每天灌胃给药 1次,每次 0. 4mL,空白
对照组灌胃等量的生理盐水, CTX组腹腔注射, 连续
给药 10天, 每 3天称体重 1次, 第 11天处死全部小
鼠,剥取肿瘤称重, 按下式计算抑瘤率, 以 t检验方法
进行统计学处理。
抑瘤率 (% ) =对照组平均瘤重 -给药组平均瘤重对照组平均瘤重 @ 100%
2. 2 体外抑瘤实验
2. 2 1 细胞形态学观察 以 1 @ 105个 /mL的细胞密
度,将对数生长期的 HL - 60细胞接种于 50mL培养瓶
中, 24h后加 ZSQ储备液使其终浓度分别为 1、10mg /
mL,空白对照加等量的培养液; 37e , 5% CO
2
, 培养
48h,收集细胞, PBS漂洗, 滴片, 自然晾干; 用甲醇固
定; G iem sa染色,二甲苯透明,以树脂封片,镜下观察。
2. 2. 2 M TT实验 取对数生长期的 HL - 60细胞,
调整细胞密度 3 @ 104个 /mL,接种于 96孔培养板中,
100LL /孔; ZSQ 设 32、10、3. 2、1、0. 32、0. 1、0. 032、
0. 01mg /mL 8个药物组和空白对照组 (为等体积培养
液 ) , 每个浓度设 4个复孔。 24h后给药, 37e , 5%
#1222# 辽宁中医杂志 2008年第 36卷第 8期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2008.08.106.zhaoq.057
CO2培养 24h, 48h, 72h, 96h; 实验结束前 4h每孔加入
MTT( 5mg /mL) 20LL, 37e , 5% CO2继续培养 4h后吸
去上清液, 每孔加入 150LLDMSO,振荡 10m in使甲攒
完全溶解,用酶联免疫检测仪在 490nm波长下测各孔
吸光度,按下列公式计算细胞增殖抑制率。
抑制率 = ( 1 -试验组光吸收值 ( A)对照组光吸收值 ( A) ) @ 100%
3 实验结果
3. 1 朱砂七总蒽醌对小鼠移植瘤 S180 H22的抑制作用
结果表明朱砂七总蒽醌对 S180 H22瘤株有明显抑
制作用,各剂量组的抑瘤率均在 40%以上, 经统计学
处理 P < 0. 01。结果见表 1。
表 1 朱砂七总蒽醌对 S180 H22小鼠的抑瘤作用 ( €x ? s )
瘤株 组别 剂量
( g /kg)
瘤重 ( g)
( €x ? s )
抑瘤率
(% )
S180 对照组 1. 47 ? 0. 54
CTX组 0. 012 0. 47 ? 0. 12* * 68. 00
小剂量组 0. 3 0. 78 ? 0. 24* * 41. 41
中剂量组 0. 6 0. 69 ? 0. 42* * 46. 90
大剂量组 1. 2 0. 86 ? 0. 42* * 41. 50
H22 对照组 3. 26 ? 0. 62
CTX组 0. 012 1. 50 ? 0. 45* * 53. 99
小剂量组 0. 3 1. 91 ? 0. 50* * 41. 41
中剂量组 0. 6 1. 86 ? 0. 48* * 42. 95
大剂量组 1. 2 1. 79 ? 0. 73* * 45. 09
注:与对照组比较, * * P < 0. 01。
3. 2 朱砂七总蒽醌对 HL - 60细胞的形态学影响
经朱砂七总蒽醌处理过的 HL - 60细胞, 经 G iem-
sa染色后,在光镜下观察发现:对照组 HL - 60细胞其
细胞形态完整,有规则,胞膜完整, 光滑, 细胞核完整、
胞浆丰富、未见明显的染色体聚集,经朱砂七总蒽醌处
理后可以看到的 HL - 60细胞渐进退变性的凋亡性
变,凋亡细胞皱缩,胞膜完整,胞浆稀少或缺乏,染成淡
红色,染色质浓缩,染成深紫色, 细胞核固缩碎裂成数
个圆形颗粒,凋亡小体形成。结果见图 1。
图 1 HL - 60细胞经过 48 h的培养 G iem sa染色结果
3. 3 朱砂七总蒽醌对 HL - 60细胞增殖的影响
MTT比色实验结果显示, 朱砂七总蒽醌处理 HL
- 60细胞 1~ 4天后, OD490 ( A值 )值分别比未经处理
的 HL -60细胞显著下降 ( P < 0. 01) , 对细胞增殖的
抑制率随着剂量的增加和时间的延长显著升高。朱砂
七总蒽醌在 48h的 IC50约为 3. 2mg /mL。结果见表 2、
图 2。
表 2 朱砂七总蒽醌对 HL -60生长的影响 ( €x ? s )
药物浓度
(m g /m L)
24h
A值 抑制率
(% )
48 h
A值 抑制率
(% )
72h
A值 抑制率
(% )
96h
A值 抑制率
(% )
0 1. 809 ? 0. 053 - 1. 952 ? 0. 058 - 1. 987 ? 0. 012 - 2. 197 ? 0. 238 -
0. 01 1. 767 ? 0. 115* * 3. 32 1. 602 ? 0. 136* * 17. 93 1. 516 ? 0. 017* * 23. 71 1. 406 ? 0. 146* * 36. 05
0. 032 1. 734 ? 0. 033* * 4. 15 1. 549 ? 0. 128* * 20. 65 1. 417 ? 0. 133* * 28. 69 1. 377 ? 0. 135* * 37. 32
0. 1 1. 688 ? 0. 076* * 6. 63 1. 498 ? 0. 172* * 23. 26 1. 317 ? 0. 090* * 33. 72 1. 281 ? 0. 128* * 47. 69
0. 32 1. 606 ? 0. 249* * 1. 22 1. 438 ? 0. 049* * 26. 23 1. 255 ? 0. 094* * 36. 84 1. 145 ? 0. 037* * 47. 79
1 1. 547 ? 0. 998* * 14. 58 1. 323 ? 0. 162* * 30. 69 1. 101 ? 0. 079* * 44. 59 0. 893 ? 0. 061* * 59. 35
3. 2 1. 141 ? 0. 551* * 32. 91 0. 962 ? 0. 041* * 50. 46 0. 720 ? 0. 071* * 63. 76 0. 563 ? 0. 028* * 74. 37
10 0. 515 ? 0. 512* * 71. 53 0. 451 ? 0. 080* * 76. 84 0. 474 ? 0. 080* * 76. 14 0. 474 ? 0. 081* * 78. 43
32 0. 456 ? 0. 034* * 74. 79 0. 357 ? 0. 126* * 81. 71 0. 386 ? 0. 081* * 80. 57 0. 440 ? 0. 029* * 79. 73
注:与对照组比较, * * P < 0. 01。
图 2 朱砂七总蒽醌对 HL - 60细胞增殖的抑制作用
4 讨 论
本实验选用小鼠 S
180
和肝癌 H
22
的动物移植性肿
瘤模型作为朱砂七总蒽醌抗肿瘤作用的研究对象。结
果表明,朱砂七总蒽醌具有抑制小鼠 S180、H22移植性肿
瘤的生长作用, 抑制率在 40%以上,与对照组比较差
异有显著性意义 ( P < 0. 01), 表明朱砂七总蒽醌具有
一定的抗肿瘤作用。以 HL - 60细胞为靶细胞, 研究
了朱砂七总蒽醌对 HL - 60细胞增殖的影响, 结果表
明,朱砂七总蒽醌具有明显抑制 HL - 60细胞增殖的
作用,其 IC50为 3. 2mg /mL。其抑制作用呈明显的剂量
依赖关系。因此,朱砂七总蒽醌可望成为新的抗肿瘤
药物。细胞凋亡受抑与肿瘤发生密切相关,如何有效
地诱导肿瘤细胞的凋亡成为目前肿瘤治疗的新方向。
因此,朱砂七总蒽醌是否通过诱导细胞凋亡而发挥抗
肿瘤作用,是否可以逆转肿瘤细胞耐药,是否可以与其
他抗肿瘤药物发挥协同作用,尚需进一步深入探讨。
参考文献
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#1223# 辽宁中医杂志 2008年第 36卷第 8期
收稿日期: 2008 - 03 - 19
作者简介:周现军 ( 1969 - ), 男,河南安阳人, 讲师,学士,研究方向:中
医药教学新方法及中药的现代应用。
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满山红及其制剂中满山红油的含量测定
周现军
(河南省安阳市中医药学校,河南 安阳 455000)
摘 要: 目的:测定满山红及其制剂中有效成分满山红油的含量, 以探索满山红及其制剂的质量标准。方法: 用
HPLC法测定不同产地的满山红及消咳喘胶囊中满山红油的含量。结果: 不同产地的满山红中挥发油含量差别较大,满
山红油是消咳喘胶囊中的主要活性成分之一。结论:此方法稳定可靠, 重现性好, 适用于满山红及其制剂中挥发油的测
定提取, 为满山红及其制剂的质量评价提供了一定的科学依据。
关键词: 满山红 ;挥发油 ; HPLC法;活性成分
中图分类号: R284. 1 文献标识码: A 文章编号: 1000 -1719( 2008) 08 - 1224 - 02
Determ ination ofO leum Rhododendr iDaurici-Content
in Folium Rhododendr iDaur ici and its Preparations
ZHOU X ian - jun
(H enan Chinese Med ical Schoo l o f Anyang, Anyang 455000, H enan, China )
Abstrac t: Ob jective: T o de te rm ine the active ingredient -O leum Rhododendri Dau rici - contrent in Fo lium Rhododend ri
Daurici and its p repa ra tions so as to explore the qua lity standa rds of Fo lium Rhododendri Dauric i and its prepara tions. M ethods :
D e term ine the O leum Rhododendri Dauriciconten t in X iaokechuan capsules and Fo lium Rhododend riDaurici from diffe rent habi-
tats by HPLC m ethods. Results : The vo la tile o il - conten ts in Folium RhododendriDaurici from diffe rent habita ts d iffe rw ide ly and
O leum Rhododendri Daurici is one o f the m ain active ing redients o f X iaokechuan capsu le s. Con clus ion: The m e thod adopted is
stable and dependable w ith em phasis oriented, being availab le for the de te rm ina tion and abstraction o f the vo latile o il in Fo lium
Rhododendri Daurici and its preparations and providing som e scientific references fo r the quality eva lua tion on Fo lium Rhododen-
dri Daurici and its preparations.
K ey words: folium rhododendri dauric ;i vo la tile o i;l H PLC m ethod; ac tive ingredient
满山红为杜鹃花科植物兴安杜鹃 Rhoclo -
dendron dauricum L. 的干燥叶, 其味苦性寒, 主入肺
经,具有镇咳、祛痰、消炎等作用,临床常用于治疗慢性
气管炎与支气管炎等疾病, 消咳喘胶囊是以满山红为
主要原料的胶囊制剂,具有清热、消炎、化痰、止咳等功
效。用于治疗口腔炎、扁桃体炎以及痰多咳喘等疾病。
满山红油是满山红的主要活性成分之一, 在药材
中的含量较高, 其镇咳祛痰作用明显。据报道, 160mg
满山红油与 60mg可待因作用相当, 其作用部位在脑
干,能抑制呼吸中枢, 另外,还具有抗菌消炎等作用,有
效地检测满山红药材及其制剂中挥发油的含量, 对于
保证临床疗效具有积极意义。本实验采用 HPLC法,
对满山红药材及其制剂中的挥发油进行测定, 结果表
明,该方法操作简便、准确,重现性良好。
1 仪器与材料
高效液相色谱仪 Agilen t 1100 Se ries; 甲醇为色谱
纯;水为蒸馏水; 其它试剂均为分析纯; 满山红药材分
别出自黑龙江等 5个产地, 经河南省安阳市中医药学
校中药鉴定室主任师东琴鉴定,符合药典规定;满山红
油对照品为河南省药品生物制品鉴定所提供 (批号:
1365 -0809);消渴喘胶囊为自制。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱 Shimadzu VP -ODS ( 150mm
@ 4. 6mm, 5Lm ), 柱温: 45e ,流动相:氯仿 - 70%乙醚
( 25B75),体积流量: 1. 0mL /m in,检测波长: 300nm, 理
论板数按满山红油计算应不低于 5000。
2. 2 对照品溶液的制备 精密称取满山红油对照品
0. 3500g,置 150mL量筒中,加 70%甲醇 50mL, 超声处
理 2h,过滤,蒸干, 残渣加 70%甲醇溶解,转移至 10mL
量瓶,稀释至刻度,摇匀,即得。
2. 3 满山红药材供试品溶液的制备 将满山红药材
研细,精密称取 0. 5000g, 置 200mL锥形瓶中, 加 70%
甲醇 50mL, 超声处理 2h,过滤,蒸干,残渣加 70%甲醇
适量溶解,并转移至 10mL量筒中, 稀释至刻度, 摇匀,
即得。
2. 4 消咳喘胶囊供试品溶液的配制 取不同批号的
#1224# 辽宁中医杂志 2008年第 36卷第 8期