全 文 ：羽毛针禾组织培养方法研究
张煜星1 ,2 ,杨 萍1 , 王 红1 ,王绍明1 ,祝建波1 ,周鹏2＊　(1.石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子
832003;2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室 ,海南海口 571101)
摘要　[目的]筛选适合于羽毛针禾种子发芽的培养基及愈伤组织诱导培养基。[方法] 以羽毛针禾种子为基础材料 ,以MS 培养基为基
本培养基 ,研究不同激素浓度配比条件下种子发芽率及愈伤组织的诱导效果。[ 结果] 6-BA对羽毛针禾种子的萌发作用不太明显 ,但加
入 6-BA后有利于种子个体的生长发育;GA3对羽毛针禾种子的萌发起着关键性的作用。种子发芽最适培养基为 1/2 MS+GA32.0 mg/L ,
可诱导出结构致密、绿色颗粒状胚性愈伤组织。较高浓度的 2 ,4-D可促进愈伤组织较快发生 ,但浓度过高对胚性愈伤组织的诱导有抑
制作用且容易导致愈伤组织的褐化现象 ,只有当 2 ,4-D浓度为 2.0 mg/L时 ,胚性愈伤组织的诱导率达最大值 ,得到最好的培养效果。种
子愈伤组织的诱导以MS+2 , 4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5 mg/L为宜。[结论]为完善羽毛针禾的高频再生体系和基因转化奠定了基础。
关键词　羽毛针禾;诱导愈伤组织;再生体系
中图分类号　S 5　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)17-07875-02
Study on the Tissue Culture of Stipagrosits pennata
ZHANG Yu-xing et al　(Laboratory of Agricultural Biotechnology , College of Life Science , Shihezi University, Shihezi , Xinjiang 832003)
Abstract 　[Objective] The media suitable for seed germination and callus induction of Stipagrosits pennata were tested and compared.[Method] The
germination rate of and callus induction of Stipagrosits pennata seeds in theMS medium with the different hormone concentrationswere studied.[ Results]
The 6-BA did not obviously affect the seeds germination rate but it was beneficial to the seed growth and development.The key role in the seeds germina-
tion was from theGA3.Themedium of 1/2 MS+GA3(2.0 mg/L)was most suitable for seeds germination , which induced the green granular embryogenic
callus with structural densification.The 2.4-D added in the medium could promote the callus growth but higher concentration of 2.4-Dwould have the in-
hibition role in embryogenic callus induction and result in the browning phenomenon of induced callus.While the concentration of 2.4-Dwas 2.0mg/L ,
the rate of embryogenic callus induction reached to the peak value.Themedium:MS+2.4-D(2.0mg/L)+6-BA(0.5mg/ L), was suitable for callus in-
duction.[ Conclusion] The study laid the foundation for high frequency regeneration system and gene-transformation of Stipagrosits pennata.
Key words　 Stipagrosits pennata;Regeneration system;Induction callus
基金项目　国家自然科学基金项目(30660031)863子项目“特殊植物耐
低温功能基因的开发与利用”(2007AA021401)资助。
作者简介　张煜星(1967-),男 ,河南永城人 ,在读博士 ,副教授 ,从事
植物基因工程研究。 ＊通讯作者 , 研究员 ,博士生导师 , E-
mail:zhqtw@public.hk.hi.cn。
收稿日期　2009-03-09
　　羽毛针禾(Stipagrosits pennata)喜生于流动半流动沙地 ,
在我国集中分布在新疆北部古尔班通古特沙漠。它抗旱 、耐
风蚀 、耐沙埋 ,是固定流沙地不可多得的一种固沙植物 ,常与
白皮沙拐枣 、白梭梭等适沙耐沙植物有机结合形成群落[ 1] 。
另外 ,羽毛针禾富含营养 ,是沙漠中一种优良的牧草。对其
应善加保护 ,合理利用 ,充分发掘其潜在的抗逆基因资源 ,并
将其用于农作物品质改良 ,具有巨大的学术和经济价值。羽
毛针禾再生体系的建立是实现这一目标的基础 ,但目前这方
面的研究在国内还是一片空白。笔者对羽毛针禾种子发芽
培养基及诱导愈伤组织培养基进行筛选 ,获取较高的种子发
芽率 ,并利用种子诱导愈伤组织 ,旨在为羽毛针禾再生体系
的建立奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料　供试材料为羽毛针禾(Stipagrosits pennata)干燥
成熟种子。种子采自石河子 150团梦驼铃。保存在-4 ～ 0
℃冰箱内 ,以打破种子休眠。在 2～ 3年内使用 。
1.2　方法
1.2.1　培养基的配制。
1.2.1.1　贮存液(母液)的配制。培养基基本成分母液的配
制分为无机大量成分 、无机微量成分 、铁盐和维生素类 4部
分 ,分别配制为 10、100 、100、100倍浓度的水溶液 ,4 ℃冰箱内
保存。使用时直接加入培养基后进行灭菌。
(1)0.5mg/ml 2 , 4-D母液的配制 。称取 2 , 4-D 50 mg ,用
2.5ml分析纯无水乙醇溶解后 ,蒸馏水定容至 100 ml 。4 ℃冰
箱内保存。使用时直接加入培养基后灭菌。
(2)0.5 mg/ml GA3母液的配制 。GA3 50 mg用 5 ml浓度
0.5 mol/L NaOH溶解后 ,用蒸馏水定容至 100 ml。在使用前
用0.22μm过滤膜过滤除菌。
(3)0.5 mg/ml 6-BA母液的配制 。称取 6-BA 50 mg ,用 5
ml浓度 0.5 mol/LHCl溶解后 ,用蒸馏水定容至 100 ml。4 ℃
冰箱内保存。使用时直接加入培养基后灭菌。
1.2.1.2　培养基的配制。试验中所有的培养基采用浓度 1
mol/L NaOH 和 1 mol/L HCl调节 pH值至 5.8左右。分装于
100 ml的阔口三角瓶中采用湿热高压灭菌法进行灭菌。
1.2.1.3　各种培养基成分和含量 。目前在国内羽毛针禾的
组织培养还是空白 ,所以羽毛针禾各阶段培养的培养基还处
于摸索阶段 ,该试验参考黑麦草 、小麦 、水稻 、冰草等禾本科
植物诱导愈伤组织培养基[ 2-8] 。种子发芽共设计 13个不同
浓度激素和营养成分的培养基(表 1),愈伤组织诱导共设计
12个不同激素浓度的培养基(表 2)。
1.2.2　材料处理。用肥皂水清洗种子 3 min后 ,再用自来水
冲洗干净 ,然后用蒸馏水冲洗种子 5遍以上 ,在超净工作台
换无菌瓶。用浓度 75%酒精浸泡 1 min ,再用浓度 0.1%升汞
浸泡 15 min ,浸泡过程中不断摇晃 ,经无菌水冲洗 5遍。
1.2.3　无菌苗的获得。将处理过的种子接种于出苗培养基
上 , 7 d后种子开始萌发。
1.2.4　诱导愈伤组织。将无菌苗剪去生长点 ,余下部分接
种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导 。
1.2.5　培养条件 。所有植物材料的培养过程均在恒温培养
室中进行 ,光照时间为 10 h/d ,光强为 2 000 lx左右。培养室
室温设定为(25±2)℃,以 1/2 MS 为基本培养基 , pH 值为
5.8。诱导愈伤组织以MS为基本培养基。
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009, 37(17):7875-7876, 7878　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　张杨林　责任校对　傅真治
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2009.17.094
表1　不同浓度激素和营养成分的发芽培养基
Table 1　The germinationmedium with different concentration of hormone
and nutrition components
培养基编号
No.of media
基本培养基
Basic medium
GA3
mg/ L
6-BA
mg/ L
1 1/ 2MS 　　　0 　　　0
2 1.5 0
3 2.0 0
4 2.5 0
5 MS(大量减半) 1.5 0
6 2.0 0
7 2.5 0
8 1/ 2MS 1.5 0.1
9 2.0 0.2
10 2.5 0.3
11 0 0.1
12 0 0.2
13 0 0.3
表 2　不同浓度激素的愈伤组织诱导培养基
Table 2　The calli induction medium with different concentration of
hormone mg/L
培养基编号 No.of medium 2, 4-D 6-BA
1 1.0 　　　　0
2 1.0 0.1
3 1.0 0.5
4 1.0 1.5
5 2.0 0
6 2.0 0.1
7 2.0 0.5
8 2.0 1.5
9 3.0 0
10 3.0 0.1
11 3.0 0.5
12 3.0 1.5
　注:基本培养基为MS 。
　Note:MS medium is the basic medium.
2　结果与分析
2.1　种子发芽培养基的筛选结果　试验结果表明 ,GA3 在羽
毛针禾种子发芽过程中起着至关重要的作用 ,而 6-BA 的影
响就小的多。1/2 MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L与 1/2
MS+GA3 2.0mg/L 2种培养基对种子发芽都很适合(图 1 ～
2),只是在种子发芽时间和个体发育情况上有所差别:前者
种子发芽时间长 ,大概在 7 d左右 ,但无菌苗壮;后者种子发
芽时间短 ,大概 5 d左右 ,但无菌苗相对前者要弱些。
2.1.1　6-BA对羽毛针禾种子发芽的影响。比较 2、3、4号培
养基与 8、9、10号培养基可以看出 ,2、3、4号培养基种子先萌
发 ,可见 6-BA对羽毛针禾种子的萌发作用不太明显 ,但加入
6-BA后有利于种子个体的生长发育。
2.1.2　GA3 对羽毛针禾种子发芽的影响。GA3对羽毛针禾种
子的萌发起着关键性的作用。加入GA3 的培养基 ,种子都有
不同程度的发芽 ,而未加入GA3 的培养基 ,除了 11号培养基
的发芽率为 30%,其余均未发芽 ,而且 11号培养基的幼苗长
势不好。因此推测GA3在种子萌发过程中是必不可少的 ,分
析试验结果可知 ,随着 GA3 浓度的增加 ,羽毛针禾种子的发
芽率有所上升 ,但当GA3 的浓度达到 2.5mg/L时 ,种子的发
芽率有所降低 ,因此可以得出 ,GA3 的浓度处于 1.5 ～ 2.0
mg/L时适于种子萌发。经试验得出羽毛针禾种子发芽的最
适培养基为:1/2 MS+GA3 2.0mg/L。
图 1　1/ 2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上种子发芽情况
Fig.1　The seed germination on the medium of 1/ 2 MS+1.5 mg/L
GA3+0.5 mg/L 6-BA
图2　1/ 2 MS+GA3 2.0 mg/ L培养基上种子发芽情况
Fig.2　The seed germination on themedium of 1/ 2 MS+2.0 mg/LGA3
2.2　愈伤组织的诱导结果　试验结果表明 ,生长素和细胞
分裂素对羽毛针禾外植体具有明显的作用。大量文献表明 ,
2 , 4-D是诱导禾本科植物愈伤组织形成的最有效的植物生长
调节剂 ,该试验在 2 , 4-D 2.0mg/L和 6-BA 0.5mg/L的激素组
合中 ,诱导出结构致密 、绿色颗粒状胚性愈伤组织(图 3)。在
图 3中可以看到 ,愈伤组织已有分化出芽的现象 。
图3　MS+2,4-D2.0mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上愈伤组织诱导结果
Fig.3　The callus induction results on themediumof MS+2.0 mg/L
2 ,4-D+0.5mg/L 6-BA
2.2.1　2 ,4-D浓度对愈伤组织诱导的影响。2 , 4-D对植物
体诱导胚性愈伤组织起主要作用。该试验结果表明 ,较高浓
度的 2 ,4-D(2.0mg/L)可促进愈伤组织较快发生 ,但过高浓度
(下转第 7878页)
7876 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
cm ,成为完整的再生植株。
2.4　移栽　将生根后的试管苗不开盖在温室中放置 6 d
表2　不同激素配比对棣棠花再生嫩茎增殖的影响
Table 2　Effect of different hormone proportion on the propagation of
regenerative tender stem of K.japonica
NAA
mg/ L 6-BAmg/L KTmg/ L
接种块数
Number of
inoculated plantlets
4周后苗数
Number of plant
lets after 4 weeks
增殖倍数
Proliferation
times
0.05 　0.5 　0 24 　　　69 　 2.86
0.10 1.0 0 24 187 7.78
0.10 2.0 0 24 199 8.31
0.05 0 0.5 24 52 2.16
0.10 0 1.0 24 103 4.27
0.10 0 2.0 24 196 8.15
0.05 0.5 0.5 24 141 5.85
0.10 1.0 0.5 24 285 11.87
0.10 0.5 1.0 24 200 8.33
0.20 1.0 1.0 24 158 6.57
表 3　不同生长素组合对棣棠花生根的影响
Table 3　Effect of different auxin combinations on the rooting of K.japonica
IBA
mg/ L NAAmg/L
接种数
Inoculated
number
平均根数
Average number
of roots
生根率∥%
Rooting
rate
0 　 0 24 1.9 　　　　68.8
0 0.5 24 2.7 82.4
0.5 0 24 3.2 85.7
0 0.1 24 4.3 100.0
0.1 0 24 3.2 97.8
0.1 0.1 24 2.6 95.5
后 ,逐渐开盖放置 3 d ,完全开盖后放置 3d ,然后移栽于蛭石∶
森林土为 1∶1(体积比)的基质中 ,用塑料薄膜覆盖 , 2周后检
查 ,成活率达 90%左右。20 d后将成活的幼苗移至森林土∶
田园土为 1∶1(体积比)的基质中 ,株行距为 15 cm×20 cm ,注
意湿度和遮阴 , 30 d后成活率达 96%。当移栽苗长至 20 ～ 25
cm时 ,带土移栽至大田里 ,灌足水 ,缓苗 1 周后开始旺盛
生长 。
3　小结与讨论
试验结果表明 ,细胞分裂素 6-BA和生长素 NAA的浓度
配比对外植体的诱导具有显著影响 ,在棣棠花分化培养阶
段 ,MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA对丛生芽的诱导率
较高 ,为 100.0%。在增殖培养阶段 ,细胞分裂素 6-BA是对
芽苗增殖产生明显影响的因素 ,但当浓度较高时会使芽苗出
现玻璃化现象 。
在整个试验中 ,生长素NAA对芽分化的影响并不十分
明显 ,但对根的发育有显著影响 ,再生嫩茎在 1/2 MS+0.1
mg/L NAA的培养基上生根率达 100%,且新根发育良好 。植
株苗外形美观 、色泽深绿 ,移栽后生长良好。移栽过程中最
重要的是要保持土壤湿润 ,对幼苗要遮阴 ,避免阳光直射 ,基
质的 pH 值不能超过 6.0 ,才能使幼苗有较高的成活率和较好
的长势。
参考文献
[ 1] 火树华.树木学[M] .2版.北京:中国林业出版社 ,1990:115.
[ 2] 姚德生 ,孛随文,靳百党 ,等.甘肃十五种野生花卉物候观测[ J] .甘肃林业科技 ,2004, 29(2):22-24.
[ 3] 巩振辉 ,申书兴.植物组织培养[M] .北京:化学工业出版社, 2007.
(上接第 7876页)
的 2 ,4-D对胚性愈伤组织的诱导有抑制作用且容易导致愈
伤组织的褐化现象 ,只有当 2 , 4-D浓度为 2.0mg/L时 ,胚性
愈伤组织的诱导率达最大值 ,得到最好的培养效果 。
2.2.2　6-BA浓度对愈伤组织诱导的影响。单独使用 6-BA
容易使外植体产生玻璃化 ,影响愈伤组织的形成 ,当在含一
定浓度的 6-BA与 2 , 4-D培养基上培养 30 ～ 40 d后 ,愈伤组
织即可发生 。
3　讨论
3.1　羽毛针禾组织培养中褐变问题　在羽毛针禾无菌苗
的叶片诱导愈伤组织时褐变现象非常严重 ,因此 ,该试验采
取了一些措施:①在培养的初期 , 间隔几天的时间将外植
体转移到新鲜的培养基上 , 以消除有毒物质的危害;②幼
龄材料一般都比成龄材料褐变轻 ,在羽毛针禾刚长出幼叶
时就进行试验;③采用暗培养 ,光照可以激活多酚氧化酶使
褐变加剧。以上措施都不能完全避免褐变 ,羽毛针禾组织
培养中褐变的克服还需进一步尝试 。
3.2　羽毛针禾愈伤组织培养的生长周期问题　在该试验
中 ,虽然由羽毛针禾的无菌苗成功诱导出了愈伤组织 ,但诱
导周期过长 ,达到 2个月左右 。这是目前该试验遇到的一
大难点 ,下一步将结合其他激素进行合理的激素配比试验 ,
以达到缩短诱导愈伤组织生长周期的目的 。
参考文献
[ 1] 买买提·依提.羽毛三芒草的生态生物学特性及其评价[ J] .干旱区研
究 ,1990(2):52-56.
[ 2] 王力.影响水稻愈伤组织植株再生频率的因素研究[ J] .云南大学学
报:自然科学版, 1999 ,21(2):113-115.
[ 3] 丁路明 ,龙瑞军.早熟禾再生体系建立的研究现状[ J] .草原与草坪 ,
2003(2):6-9.
[ 4] 王万军.小麦叶片愈伤组织及其再生植株的诱导[ J] .西北植物学报 ,
1998, 18(3):401-405.
[ 5] 李书平.春小麦愈伤组织诱导和植株再生的研究[ J] .沈阳农业大学学
报 ,1998, 29(4):297-301.
[ 6] 吴关庭 ,胡张华,陈锦清.高羊茅和其他羊茅植株再生与遗传转化研究
进展[ J] .植物学通报 ,2004, 21(2):146-155.
[ 7] 于家驹 ,安利民.小麦幼茎组织培养中植株再生[ J] .山东大学学报:自
然科学版 ,1990,25(4):515-521.
[ 8] 王大元.禾本科植物的组织培养和体细胞胚胎发生[ J] .细胞生物学杂
志 ,1984, 6(1):12-20.
7878 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年