全 文 ：针禾属植物羽毛针禾基因组 DNA提取方法的研究
邓必建1 , 2 ,张　霞1 ,王绍明1 , 2
(1.石河子大学 生命科学学院 ,新疆 石河子 832003;
2.新疆兵团 绿洲生态农业重点实验室 ,新疆 石河子 832003)
　　摘要:传统的 CTAB DNA 提取法步骤多.较烦琐 ,DNA 产率低 ,而且由于酚 、单宁 、色素 、多糖
很难完全去除 ,容易影响随机扩增多态 、微卫星等标记工作的效率. 采用 SDS 裂解法提取了针禾属
植物幼嫩叶片的基因组 DNA ,所获得的 DNA 可用于 PCR反应. 并且在针禾属植物的研究中得到
了较好的结果.
关键词:针禾属植物;羽毛针禾;SDS 法 DNA 提取;CTAB 法 DNA 提取;随机扩增多态
DNA;微卫星
中图分类号:Q 503　文献标识码:A　文章编号:1007 - 8754(2007)03 - 0064 - 05
收稿日期:2006 - 12 - 25
项目资助:国家重大基础研究前期研究专项(2004CCA02800);教育部“春晖计划”项目(Z2004 - 2 - 65048)
作者简介:邓必建(1973 -),男 ,湖南溆浦人 , 石河子大学生命科学学院植物学专业植物遗传方向硕士研究生;
通讯作者:王绍明(1963 -),男 ,湖北黄岗人 , 石河子大学生命科学学院教授 ,博士.
引言
由于分子生物学实验大都是从提取研究对象的基因组总 DNA 开始. 比如随机扩增多态 DNA(Random
Ampli fied Polymorphic DNA ,简称 RPAD )、[ 1 - 5] 微卫星(micro satelli te)[ 6 - 7] 标记等分子标记的研究工作都
离不开基因组总 DNA 的提取.随着这些技术的应用逐渐扩展到更多的植物种 ,那么对这些植物 DNA 的提
取就处于首要的地位.许多研究者[ 1 , 2 , 5 , 6 , 8 , 9] 发现 ,植物体内的许多次生代谢物质(如单宁 、酚类及色素等)影 
响 Taq-DNA 聚合酶的活性 ,从而导致扩增反应失败.因此能否得到高质量的基因组 DNA 自然成为分子生
物学实验中关键的第一步.然而 ,如果研究对象的组织中含有较多的纤维 、硅质或其他次生代谢产物如酚 、
酯 、萜等 ,提取高质量的 DNA 就会比较困难.
针禾属植物(S tipagrosi ts De Winter)羽毛针禾(S tipagrosi ts pennata)在国内主要分布于新疆准噶尔盆
地古尔班通古特沙漠南侧边缘 ,是该沙漠南侧边缘植被重要的建群种.羽毛针禾具有优异的沙漠保育功能 ,
沙生适应性能力强 ,在沙漠中 ,羽毛针禾种群在构成沙漠植被和影响 、保持植被群落的稳定性方面发挥着重
要的生态作用 ,具有重要的群落生态学意义. 而目前对于羽毛针禾这样一种适应沙漠环境固沙能力强的禾草
类植物的研究是不够的. 我们有必要对其进行深入研究 ,其中一个重要方面就是对其进行遗传结构多样性的
研究.要进行该研究就必须首先得到较纯 、较完整的基因组 DNA. 本研究就以针禾属植物羽毛针禾为材料 ,
参照禾本科植物基因组 DNA 的提取方法采取了 2种方法(SDS 法 、CTAB法)从针禾属植物羽毛针禾中提
取总 DNA ,并对 2种方法所提取的针禾属植物羽毛针禾 DNA的结果进行比较分析 ,希望能得到较纯 、较完
整 DNA 并能很好地用于 PCR扩增的提取方法.
1　材料和方法
1. 1　实验材料
针禾属植物(S tipagrosi ts De Winter) 羽毛针禾(S tipagrosits pennata)的幼嫩叶片采自新疆沙湾县
第 27卷　第 3期 广 东 教 育 学 院 学 报 2007年 6月
Vol. 27　No. 3 Journal o f Guangdong Educat ion Insti tute Jun. 2007
(sw)、阿尔泰(aet)、阜康(fk)、奇台(qt).
1. 2　主要仪器
高速冷冻离心机(TG L-16G ,Anke);PCR扩增仪(MyCyclerTM Thermal Cycler);GelDoc凝胶成像系统
(Quanti ty one);DYC-24A 槽式电泳仪;垂直平板电泳仪;DYY-4型稳压稳流电泳仪.
1. 3　主要试剂
1. 3. 1　SDS 裂解法试剂[ 10 , 11]
提取缓冲溶液:100 mmol /L Tris-HC1(pH8. 0);50 mmol /L EDTA(pH8. 0);500 mmo l /L NaC1;
10 mmol /L β -巯基乙醇. 10%的 SDS. 5 mo l /L Kac. TE缓冲液:10 mmol /L Tris-HC1(pH8. 0);l mmo l /L
EDTA.
1. 3. 2　CTAB法试剂[ 10]
2×CTAB提取缓冲溶液:100 mmol /L T ris-HCl(pH8),20 mmol /L EDTA ,1. 4 mmol /L NaCl , 2%
(质量浓度 , g /100 mL)CTAB ,40 mmol /L β-巯基乙醇. 10%(质量分数)CTAB:10%(质量分数)CTAB , 0. 7
mol /L NaC l. 1×CTAB沉淀缓冲:50 mmo l /L Tris-HCl(pH8),10 mmol /L EDTA , 1%(质量分数)CTAB ,
20 mmo l /L β-巯基乙醇. 1 mol /L 乙酸铵. 7. 5 mol /L 乙酸铵. TE缓冲液同上.
1. 4　基因组 DNA 的提取
1. 4. 1　SDS 裂解法[ 10 , 11]
(1)称取羽毛针禾鲜叶0. 2 g置于预冷的研钵中 ,加入1 ～ 2 PVP 和少许石英砂 ,用液氮冻脆研磨至粉末状.
(2)将粉末迅速转移到1. 5 mL 离心管中 ,加 900μL 提取缓冲液和 10μL β -巯基乙醇 ,振动混匀 ,65 ℃水浴保
温 10 ～ 15 min ,并不时摇动. (3)加入 160 μL KA c(5 mol /L),冰浴 30 min , 4 ℃、12 000 r /min离心 15 min.
(4)仔细吸取上清液移至新的 1. 5 mL 离心管中 ,加入等体积的苯酚 /氯仿 /异戊醇溶液 ,颠倒混匀 ,室温下静
置 5 ～ 10 min ,使水相和有机相分层. (5)4 ℃、8 000 r /min离心10 min ,小心吸取上清至另一离心管中 ,加等
体积的氯仿 /异戊醇 /乙醇溶液混匀 ,室温下静置 5 ～ 10 min ,使水相和有机相分层.(6)4 ℃、5 000 r /min离
心 5 min ,小心吸取上清至另一离心管 ,加入 2 /3上清液体积的- 20 ℃异丙醇 ,混匀 ,室温下放置片刻即出现
絮状 DNA 沉淀 ,并于- 20 ℃冰箱中放置 30 min. 3 000 r /min离心 5 min ,去尽上清 ,再加入 100 mL T E缓
冲液溶解 DNA 沉淀. (7)待DNA完全溶解后 ,加 2μL RnaseA ,37 ℃水浴 15 min ,除去 RNA.然后加 1体积
3 mol /L NaA c和 2倍体积冰无水乙醇 ,混匀 , - 20 ℃冰箱中放置 30 min左右 ,使 DNA 形成絮状沉淀. (8)4
℃、5 000 r /min离心 5 min , 沉淀 DNA ,70 %乙醇漂洗 ,再在干净吸水纸上吸干. (9)将 DNA 重新溶于 50
μL T E中 ,于 4 ℃冰箱保存备用.
1. 4. 2　CTAB法[ 10]
(1)称取羽毛针禾鲜叶 0. 2 g ,置于液氮中 ,充分研磨 ,成粉末状.(2)将粉末状材料转移到预冷的 1. 5 mL
离心管中 ,立即加入 500μL(质量浓度)的用 65 ℃预热的 2×CTAB提取缓冲溶液 ,充分混匀 ,在 65 ℃水浴
中保温 15 min ,其间不时摇动.(3)加入 500μL 氯仿 -异戊醇 ,轻轻颠倒离心管 , 混匀 ,室温下 12 000 r /min
离心 15 min. (4)把上清液转入另一洁净的离心管中 ,加入 1 /10上清液体积的 10%(质量分数)CTAB , 混
匀 , 加入等体积的氯仿 -异戊醇 ,轻轻颠倒离心管 , 混匀 ,在室温下 ,12 000 r /min 离心 10 min. (5)重复(4)
一次. (6)将上清液转入另一洁净的离心管中 ,加入 1倍体积的 1×CTAB沉淀缓冲液 , 混匀 ,室温下静置 30
min使沉淀生成. 4 000 r /min离心5 min ,取沉淀 ,晾干备用. (7)按照每克材料加入 0. 5 mL 1 mol /L 乙酸铵
溶液的标准加入后者 ,使沉淀完全溶解 ,再加入 7. 5 mol /L 乙酸铵溶液至终浓度为 2. 5 mo l /L .加入 2倍体
积预冷的异丙醇 , 混匀 ,室温下静置 30 m in. (8)10 000 r /min离心 5 min ,收集沉淀.或者直接用玻璃棒搅拌
缠出 DNA纤维. (9)用 70%(体积分数)乙醇漂洗沉淀 3 次 ,吹干 ,沉淀溶入适当体积的 TE 缓冲溶液中.
(10)加入 1μL 10 mg /mL Rnase ,4 ℃贮存备用.
1. 5　基因组 DNA 纯度 、浓度和分子量大小的鉴定[ 12]
将 DNA 样品和合适的分子量标记(D15 000 ,由北京天根生化科技提供)同时在 0. 7%的琼脂糖凝胶
(含 0. 5 μg /mL溴化乙啶)上进行电泳 ,在紫外灯下进行观察并在 Gel Doc 凝胶成像系统上拍照. 与标准分
65第 3期　　　　　　　　邓必建 ,等:针禾属植物羽毛针禾基因组 DNA 提取方法的研究
子量比较估测基因组 DNA 片段的分子量大小. DNA 纯度的鉴定是通过紫外分光光度计进行 ,分别测定
DNA 样品在波长为 260 nm 、280 nm 处的光密度值 ,计算 OD260 /OD280值. DNA 浓度按下列公式进行计算:
DNA 浓度=OD260 ×0. 05×稀释倍数(单位:μg /μL).
1. 6　DNA 的 RAPD扩增
1. 6. 1　反应体系
其反应体积为 20 μL ,其主要成分为 40 ng 模板 DNA ,0. 2 μmol /L 随机引物 , 1×T aqDNA 聚合酶反应
缓冲液 , 1 U Taq 聚合酶 , 2 mmol /LM gCl2 , 0. 2 mmo l /LdN TP. 扩增反应在 PCR 扩增仪(MyCyclerTM
Thermal Cycler)上进行.
1. 6. 2　扩增程序
95 ℃预变性3 min;然后进入 40个循环 ,每循环 94 ℃变性 1 min ,35 ℃退火 50 s ,72 ℃延伸 100 s;40个
循环结束后 72 ℃延伸 8 m in ,最后 4 ℃保存.扩增引物为 Sangon 公司的 S117(CACTCTCCTC).
1. 6. 3　1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物
点样体积 10 μL ,Marker 用 MassRulerTM DNA Ladder , Low Rang , ready - to - use Description(上海生
工), DNA 扩增产物在 1. 5%的琼脂糖凝胶(含 EB)上 ,电泳电压 120 V;时间 2 h左右.
1. 7　DNA 的 SSR扩增
由于对针禾属植物研究的甚少 ,直接利用其基因组 DNA进行微卫星引物的设计几乎是不可能. 而微卫
星引物大都在同科属植物间具有保守性.本研究就利用微卫星
引物这一特性进行 SSR-PCR实验.本研究中所用引物选自水稻
基因组 DNA 的微卫星引物[ 13] ,由上海生物工程公司合成 ,然后
进行筛选.筛选的标准就是能扩增出清晰的特异性谱带. 下面要
使用的引物 RM215就是经过筛选而来的.
1. 7. 1　SSR反应体系
其反应体积为 25μL ,其主要成分为 1×反应缓冲液 、Mg2+
2. 5 mmo l /L 、dN TPs 0. 1 mmol /L 、SSR 双引物 RM215(F:
caaaatg gagcagcaagagc , R:tgag cacctccttctctg tag)各 0. 4 μmo l/
L 、Taq DNA 酶 1. 0 U 、模板 50 ng 对多个试样进行扩增实验.
DNA 扩增在 PCR 扩增仪(MyCycle rTM Thermal Cycler)上
进行.
1. 7. 2　反应程序
94 ℃预变性5 min ,接着进行 94 ℃变性45 s ,50 ℃退火 45 s ,
72 ℃延伸 1 min ,反应 35个循环 ,最后 72 ℃链延伸 10 min. 　
1. 7. 3　10%聚丙烯凝酰胺胶电泳检测扩增产物
点样体积 6 μL. DNA 扩增产物在 10%的聚丙烯酰胺凝胶
上 ,以每泳道电流 1 mA电泳6 h左右. 分子量标准物(Marke r)
为 pUC19DNA /M spl M arker(上海生工).
2 　结果
2. 1　羽毛针禾叶基因组 DNA 的提取
按照 SDS 裂解法所提取的羽毛针禾基因组 DNA 经 0. 7%
琼脂糖凝胶电泳观察 ,主带明显 ,分子量大于 15 kb(如图 1).而
CTAB法提取针禾属植物叶片基因组 DNA.效果均极差.用该
法提取 DNA 时 ,有少量褐色沉淀 , 0. 7%琼脂糖凝胶电泳观察 ,
未得理想的结果 ,出现极度降解的现象(图 2).
66 广东教育学院学报 第 27卷　
图 3　DNA的 RAPD扩增产物的
1. 5%琼脂糖凝胶电泳
泳道 1 - 4引物 S117 扩增产物:1. sw , 2. aet ,
3. fk , 4. qt;M:分子量标准物(从上到下依次
为 1 031 bp , 900 bp , 800 bp , 700 bp , 600 bp ,
500 bp , 400 bp , 300 bp , 250 bp , 200 bp , 150 bp ,
120 bp , 80 bp)
2. 2　基因组 DNA 纯度鉴定
按照 SDS 裂解法所提取的针禾基因组 DNA ,用紫外分光光度
计测定所提取的DNA的 OD260和 OD 280值 ,计算 OD260 /OD280值 ,均
为 1. 8 ～ 1. 9 ,纯度较好.而 CTAB 法提取所得少量褐色沉淀 ,用紫
外分光光度计测定所提取的 DNA 的 OD 260和 OD280值 , 计算
OD260 /OD280值 ,在 1. 0 ～ 1. 3 ,纯度极差.
2. 3　DNA 的 RA PD扩增
将不同产地的羽毛针禾所提取的 DNA 作为模板进行 RAPD
反应.结果表明(图 3),SDS 裂解法提取的 DNA 能扩增出清晰的谱
带.而 CTAB法提取所得少量褐色沉淀 ,无法进行 RAPD扩增.
2. 4　DNA的 SSR扩增
将不同产地的羽毛针禾所提取的 DNA 作为模板进行 SSR反
应.结果表明(图 4), SDS 裂解法提取的 DNA 能扩增出清晰的谱
带.而 CTAB法提取所得少量褐色沉淀 ,无法进行 SSR扩增.
图 4　DNA的 SSR扩增产物的
10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳
泳道 1 - 4双引物 RM215 扩增产
物:1. sw , 2. aet , 3. fk , 4. qt;M :分
子量标准物(从上到下依次为
404 bp , 331 bp , 242 bp , 190 bp ,
147 bp , 111 bp , 110 bp)
3　讨论
在分子遗传学或基因工程中使用较多的植物 ,如小麦 、玉米 、水稻等细
胞内基因组 DNA 的提取已有许多成熟的方案 ,而对于象禾本科植物针禾
属虽然也属于禾本科 ,但针禾属植物的总 DNA 提取仍需不断摸索条件 ,因
为针禾属植物是一类野生的沙生类短命植物 ,研究的人较少 ,尤其是分子
生物学方面的研究.而且针禾属植物茎 、叶内存在较多纤维 ,叶内含有较高
含量的多酚类化合物和较多糖类.这些次生物质易与核酸形成复合物 ,所
提取的 DNA 是粘稠的胶状物 ,难以溶解并产生不同程度的褐变 ,所以提取
基因组 DNA 时 ,加入不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PV P),并在提取缓冲液中加
入 β -巯基乙醇 ,以抑制多酚的氧化. 另外 ,由于本实验受客观条件的影响 ,
所需试验材料需从野外采集 ,5 、6月时沙漠上的气候高温干燥极少雨 ,采集
的试验材料很容易缩水变干 ,这给 DNA 的提取造成了一定的难度. 所以 ,
在条件许可的情况下 ,应尽可能地采取保鲜措施 ,使叶片保持比较鲜嫩的
状态.本实验所提取的基因组 DNA 主带明显 ,且分子量大于 15 kb ,适合于
RA PD 、SSR等分析. 刘春林等[ 1] 指出 ,模板降解程度不大(绝大部分分子量
大于 10 kb)不会影响扩增结果 ,若模板严重降解(大部分分子量小于 10
kb)便影响扩增 ,为了避免 DNA严重降解 ,在提取时应尽量避免剧烈震动或不恰当的操作 ,以便获得大分子
量的模板 DNA .为此 ,在基因组 DNA 提取方法上又作了相应改进 ,即待鲜叶研磨之后才加入提取缓冲液 ,
因为提取缓冲液中含 SDS ,它能迅速破坏细胞 ,使 DNA 从胞内释放出来 ,若在此时进行研磨很容易使 DNA
断裂.
本实验中 ,我们使用了 SDS 裂解法和 CTAB法 ,结果我们发现对针禾属植物叶片提取基因组 DNA 来
讲 ,SDS 裂解法明显优于 CTAB法.一般认为植物基因组总 DNA 的提取方法采用 CTAB法. 然而由于该法
试验步骤多 ,操作繁琐且效率低.近年来 ,又提出了利用 SDS , T ris C1 EDTA 等直接裂解细胞 ,使其释放出
DNA ,从而直接进行 DNA 提取的方法 ,本试验方法(SDS 裂解法)就是利用这一原理进行的.本法与已往的
研究方法及 CTAB法相比.具有 3个显著特点:第一 ,我们在第(5)步采用了较大的离心力和较长的离心时
间.这样有利于杂质的彻底去除.克服了已往 SDS 法得到的 DNA 中有较多的糖类杂质的缺点.第二 ,用异丙
醇反复沉淀 ,有利于特异性地沉淀核酸 ,提高核酸的产量 ,常规方法一般每克鲜重可得到 DNA 40 ng /μL ,而
利用该法则可得到 50 ng /μL DNA;第三 ,用异戊醇代替酚抽提 ,由于氯仿 - 异戊醇易溶于异丙醇 ,易于挥
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发.由此克服了由于酚等的残留影响 DNA 的纯度. 一般用 SDS 法得到的 DNA 纯度不高 ,而我们利用这种
方法则提高了 DNA 的纯度.
针对针禾植物的特点 ,采取上述措施后 ,所提取的 DNA 质量有很大程度上的提高 ,能满足 RA PD 、SSR
扩增反应体系对模板 DNA的要求 ,毋需进一步采取纯化策略. 当然若进行更高级别的分子水平上的研究工
作 ,则应进行纯化工作.
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The Study on Extraction Method of
Genome DNA in Stipagrosits pennata
DENG Bi-jian1 , 2 , ZHANG Xia1 , WANG Shao-ming1 , 2
(1. College o f Life Sciences , Shihezi Universi ty , Shihezi , Xinjiang , 832003 , P. R. China;
2. Key Labo rato ry of Oasis Eco-Agricul ture , Xinjiang Const ruction Co rps , Shihezi ,
Xinjiang , 832003 , P. R. China)
Abstract:The tradi tional CTAB DNA extract me thod is troublesome w ith many steps and the g ross
Genomic DNA ex tracted by i t i s very low . High content of pheno lic terpenoids , tannin , pigments ,
po ly saccharide , etc. usually af fect the activity o f Taq and lead to the failure of PCR reaction. Genomic DNA
of tender leaf is ex tracted in SDS method. The genomic DNA can be applied as template DNA in PCR
reaction. T he resul ts suggested that SDS procedure w as sui table fo r St ipagrosi ts genome DNA ex tract ion.
Key words:S t ipagrosi ts De Winte r;St ipagrosits pennata;SDS DNA ex tract ion;CTAB DNA
extract ion;Random Amplified Po lymo rphic DNA;SSR
68 广东教育学院学报 第 27卷