全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食品开发
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年 第卷 第期
收稿日期：2014-07-15 *通讯作者
基金项目：国家自然基金项目(31271827)；2014年北京市大学生创新训练项目(2014bj061)。
作者简介：韦云路(1991—)，女，研究方向为食品微生物。
韦云路，张丽末，唐虞木子，郭秀锋，王 洋，李平兰*
(中国农业大学食品科学与营养工程学院，
教育部-北京市共建功能乳品重点实验室，北京 100083)
摘要：为制备活菌型双歧杆菌合生元饮品，以富含双歧因子的胡萝卜、雪莲果为主要原料，
采用动物双歧杆菌RH进行发酵。动物双歧RH来源于中国长寿老人肠道，可产活性多糖。通过
Plackett-Burman从多种碳源、氮源及生长因子中筛选对活菌数贡献较大的因素，进一步通过最
陡爬坡试验确定各因素的水平。最后利用旋转中心组合试验(Central Composite Design)得到因素
水平与活菌数方程，并经验证试验得到最佳果汁配方为：雪莲果汁体积分数20.00%、果糖添加
量0.50 g/L、脱脂乳粉添加量13.88 g/L、番茄汁添加量8.28%。最佳配方条件下发酵果汁中双歧
杆菌的活菌数可以达到3.35×108 cfu/mL，多糖含量为1220 mg/L。
关键词：双歧杆菌；合生元；雪莲果；胡萝卜；胞外多糖
中图分类号：TS 275.5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2014)12-0121-07
Manufacture of fermented smallanthus sonchifolius and
carrots juice with Bifi dobacterium animalis RH
WEI Yun-lu, ZHANG Li-mo, TANG Yu-mu-zi, GUO Xiu-feng, WANG Yang, LI Ping-lan*
(Key Laboratory of Function Dairy, Co-constructed by Ministry of Education and Beijing City,
College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing
100083)
Abstract: Fermented juice was manufactured with smallanthus sonchifolius (yacon) and carrots by
Bifi dobacterium animalis RH. B.animalis RH with exopolysaccharides producing ability were derived from
centenarians faeces. Factors signifi cantly affecting the viable count of bifi dobacteria were selected from
a variety of carbon, nitrogen sources and bifi dus factors by Plackett-Burman test. And the level of each
factor were determined subsequently by steepest ascent test. The formulars of the fermented juice were
finally optimized with a central composite design involving the above 4 factors at 5 levels. The results
showed that the optimum juice formula is: smallanthus sonchifolius juice 20.00%, fructose content 0.50 g/
L, skim milk 13.88 g/L and tomato juice 8.28%. In the optimal formula, the viable count of Bifi dobacterium
could reach up to 3.35×108 cfu/mL, and content of polysaccharide was 1220 mg/L.
Key words: bifi dobacteria; synbiotic; smallanthus sonchifolius; carrot; exopolysaccharide
动物双歧RH发酵雪莲果胡萝卜
复合饮料的研制
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2014.12.026
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双歧杆菌是人体肠道的最主要益生菌之一，
最早在1899年由法国学者Tissier从母乳营养儿的粪
便中分离得到，是一种定殖于健康人肠道内且数
量占优势的益生菌[1-2]，它分布在胃肠道内，在人
体肠道内起着调节肠道菌群平衡、降低胆固醇、
抗肿瘤、延缓衰老及营养和促进消化吸收等保健
功效[3]。目前，双歧杆菌多用于酸乳的生产，双歧
杆菌活菌制剂也多以粉质、固态为主。另外，双
歧杆菌和功能性低聚糖等双歧因子复合制成的合
生元制剂，因其具有可有效增强活的微生物制剂
在胃肠道内存活和定殖，并可选择性刺激肠道有
益菌生长或增强其活性、增强机体健康等[4]优势，
受到越来越多的关注。而目前市场上的液态型双
歧杆菌合生元饮品种类缺乏，因此，亟需研究和
开发此类产品。
双歧杆菌发酵果蔬汁作为一种新型的益生菌
饮料。同时具备果汁饮料的形态和发酵饮品的感
官品质以及活的双歧杆菌。在功能型的果蔬中，
胡萝卜所含的营养素很全面，富含糖类、脂肪、
蛋白质、胡萝卜素、VB1、VB2、花青素、钙、铁等
多种营养成分，素有“小人参”之称。其中，β-
胡萝卜素是一种抗氧化物，能转变成大量VA，有
效地预防肺癌的发生[5-6]。雪莲果属菊科葵花属植
物，果肉汁多，晶莹剔透，香甜脆爽，果糖和食
物纤维含量高，几乎不含淀粉，属低热量食品，
在营养功能方面表现出极大优势，特别适合糖尿
病患者及减肥者食用。同时，雪莲果中含有人
体必需的氨基酸达20种，并含有丰富的矿物质及
钙、镁、铁、锌、钾、硒等微量元素，以及可溶
性纤维，能清理肠胃，有效降低血糖、血脂和血
压，抑制胆固醇和糖尿病，增强机体免疫，抗癌
等功效[7-9]。雪莲果中所富含的低聚果糖，还可以
促进肠道双歧杆菌增殖[10-11]，保持活菌数量。
本研究所采用的双歧杆菌在前期研究中已被
证实具有多种益生功能。所采用的动物双歧杆菌
RH分离自世界第5长寿村中国广西巴马百岁老人
的粪便。RH可以合成2种活性的胞外多糖，中性
的EPSa和酸性的EPSb，具有抗氧化活性[12-13]。动
物双歧杆菌RH的基因组信息(Gene bank登录号：
CP007755.1)(文章未发表)显示了它的益生特性。
双歧杆菌发酵胡萝卜雪莲果复合果蔬汁活菌
饮品，兼具双歧杆菌、胡萝卜和雪莲果三者的营
养功能，可以满足益生菌饮品的要求。
1 材料与方法
1.1 材料与菌种
动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis RH)：
广西巴马长寿老人肠道菌群；新鲜胡萝卜、新鲜
雪莲果：市售。
1.2 培养基
改良MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，
酵母提取物5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸二铵2 g，
乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，硫酸镁0.58
g，硫酸锰0.25 g，玉米浆0.1%和0.04% L-半胱氨
酸盐酸盐(最后加入)，蒸馏水1000 mL。调节pH至
6.8~7.0，充高纯氮，121 ℃灭菌15 min。
1.3 仪器与设备
天平，打浆机，均质机，厌氧发酵管，量
筒，烧杯，三角瓶，移液器，无菌注射器，pH
计，紫外分光光度计，恒温培养箱，高压蒸汽灭
菌锅等。
1.4 方法
1.4.1 菌种的活化 在无菌条件下将备用的双歧
杆菌接种到改良的MRS培养基中，放置培养箱中
培养，在37 ℃条件下培养18~24 h，活化2~3代后
使用。
1.4.2 果蔬汁原料液的制备 胡萝卜原汁制作：优
质胡萝卜原料清洗、去皮、称重、切片、热烫至
软后加水用打浆机制成匀浆，备用。
雪莲果原汁制作：选择新鲜、成熟的雪莲
果，清洗去皮，并切成小块状后放入沸水中，预
煮15 min灭酶。然后取出趁热打浆，将打好的雪莲
果浆液进行粗过滤，备用。
设计配制果蔬汁，调节pH至7.4，均质后装
瓶，充高纯氮后，108 ℃灭菌15 min，备用。
1.4.3 果蔬汁种子培养基优化试验设计 将活化好
的双歧杆菌接种于不同配方的果汁中，37 ℃厌氧
发酵30 h，测定双歧杆菌的活菌数，并以双歧杆
菌活菌数为响应值，首先利用Plackett-Burman试
验(如表1)确定影响发酵果汁活菌数的关键因素，
进一步采用最陡爬坡试验确定关键因素的水平范
围，以发酵果汁双歧杆菌活菌数对数值为响应
值，用Design Expert 7.0软件进行旋转中心组合设
计(CCD)，并进行结果分析，得到二次线性回归方
程，预测最优配方并验证。
1.4.4 发酵果蔬汁的指标检测 双歧杆菌活菌数量
检测采用亨盖特厌氧滚管法[14-15]；pH值：用pH计
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表1 Plackett-Burman试验因素水平设计
因素 低水平 高水平
胡萝卜汁/% 5 30
雪莲果汁/% 5 25
蔗糖/(g/L) 0 5
葡萄糖/(g/L) 0 5
果糖/(g/L) 0 5
脱脂乳粉/(g/L) 2 10
大豆蛋白胨/(g/L) 2 10
蛋白胨/(g/L) 2 10
半胱氨酸盐酸盐/(g/L) 0.1 0.4
番茄汁/% 2 10
Vc/(g/L) 0.1 0.4
直接测量；多糖含量：先用70%乙醇沉淀后，离
心取上清液，采用苯酚-浓硫酸法测定。
2 结果与讨论
2.1 Plackett-Burman试验筛选对双歧杆菌活菌
数影响较大的因素
根据对双歧杆菌生长特性的了解和复合果蔬
汁原料的考虑，从其生长所需要的碳源、氮源、
无机盐和生长因子中选择可能影响其活菌数的
因素，选用N=12的Plackett-Burman试验设计，对
胡萝卜汁(X1)、雪莲果汁(X2)、蔗糖(X3)、葡萄糖
(X4)、果糖(X5)、脱脂乳粉(X6)、大豆蛋白胨(X7)、
蛋白胨(X8)、半胱氨酸盐酸盐(X9)、番茄汁(X10)和
Vc(X11)这11个因素进行分析和考察。每个因素分别
取低水平和高水平2个水平，以OD600作为响应值。
每组3个平行，具体试验设计及结果如表2所示。
表2 Plackett- Burman试验设计与结果
实验
号
因素 OD600X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11
1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1.005
2 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 0.153
3 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1.079
4 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 0.59
5 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 1.173
6 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 1.527
7 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 0.842
8 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1.055
9 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 0.823
10 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 0.824
11 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 0.663
12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0.877
由表3的结果得出，X1、X4、X6、X8、X9、
X10对双歧杆菌活菌数产生正效应，X2、X3、X5、
X7、X11对双歧杆菌活菌数产生负效应，整个11个
因素对双杆菌活菌数产生的影响大小依次是：X10
>X5>X2>X6>X3>X9>X4>X7>X8>X11>X1。
表4 Plackett- Burman试验显著性分析
来源 均方和 自由度 均方 F值
P-值
Pro6＞F
显著
性
0.93 5 0.19 3.42 0.0834 显著
X1-胡萝卜汁 8.69E-03 1 8.69E-03 0.16 0.7034
X2-雪莲果汁 0.24 1 0.24 4.48 0.0787
X5-果糖 0.26 1 0.26 4.73 0.0725
X6-脱脂乳粉 0.16 1 0.16 2.88 0.1404
X10-番茄汁 0.26 1 0.26 4.83 0.0703
残差 0.33 6 0.054
矫正总和 1.26 11
从表4结果可知，该模型的F值为3.42，P值为
0.0834，说明该模型的可信度为91.66%>90%，因
此可以采用该模型对果蔬汁培养基进行进一步优
化。其中，雪莲果汁、果糖和番茄汁这3个因素的
可信度都在90%以上，胡萝卜汁和脱脂乳粉的可
信度相对低一些。
2.2 最陡爬坡
响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充
分近似真实情形，要先逼近最佳值区域后才能建
立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法以试验值
变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值
的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳
值区域[16]。
根据Plackett-Burman试验结果设计主要因素
的最陡爬坡路径，其中脱脂乳粉、番茄汁有显著
正效应，应增加；雪莲果汁和果糖有显著负效应，
应减小。根据这4个因素效应大小的比例设定它们
模型
表3 Plackett- Burman试验设计的各因素水平及影响
因素
水平
效应 均方和影响/%
低水平 高水平
X1-胡萝卜汁/% 5 30 0.05 0.01 0.69
X2-雪莲果汁/% 5 25 -0.29 0.24 19.40
X3-蔗糖/(g/L) 0 5 -0.20 0.12 9.24
X4-葡萄糖/(g/L) 0 5 0.13 0.05 3.88
X5-果糖/(g/L) 0 5 -0.29 0.26 20.50
X6-脱脂乳粉/(g/L) 2 10 0.23 0.16 12.49
X7-大豆蛋白胨/(g/L) 2 10 -0.10 0.03 2.25
X8-蛋白胨/(g/L) 2 10 0.09 0.02 1.76
X9-半胱氨酸盐酸盐/(g/L) 0.1 0.4 0.18 0.09 7.32
X10-番茄汁/% 2 10 0.30 0.26 20.92
X11-Vc/(g/L) 0.1 0.4 -0.08 0.02 1.55
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的变化方向及步长进行试验，设计及结果如表5所
示。模型中还包括胡萝卜汁体积分数，根据表3中
结果可知，胡萝卜汁对响应值产生正效应，故选
取胡萝卜汁的体积分数为30%进行接下来的优化
设计。可见，最优发酵条件可能在试验3与试验5
之间，故以试验4的条件为响应面试验的中心点。
表5 最都爬坡试验设计及试验结果
编号雪莲果汁/% 果糖/(g/L) 脱脂乳粉/(g/L) 番茄汁/% OD600
1 0 0.3 17 12 0.778
2 5 0.4 16 11 0.887
3 10 0.5 15 10 0.901
4 15 0.6 14 9 0.935
5 20 0.7 13 8 0.896
6 25 0.8 12 7 0.823
2.3 响应面旋转中心组合设计
依据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验的
结果确定的因素和水平，采用旋转中心组合设计
(CCD)法对复合果蔬汁配方进行响应曲面分析试
验，试验设计如表6所示。
表6 响应面旋转中心组合设计因素水平表
因素
水平
-2 -1 0 1 2
雪莲果汁/% X1 5 10 15 20 25
果糖/(g/L) X2 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
脱脂乳粉/(g/L) X3 12 13 14 15 16
番茄汁/% X4 7 8 9 10 11
根据旋转中心组合设计的原理，进行4因素5
水平的响应面优化试验，共30个试验点，其中中
心点重复5次。结果如表7所示。
以双歧杆菌活菌数OD值为响应值，利用
Design Expert 7.0软件对表7结果进行二次多元回归
拟合，得到二次多项回归方程：
Y= 0 . 9 6 - 0 . 0 0 9 5 8 3 A + 0 . 0 0 0 0 8 3 3 3 B -
0.001167C+0.003167D-0.007375AB-0.00775AC-
0.016AD-0.0065BC+0.011BD+0.003125CD-
0.011A2-0.006437B2-0.019C2-0.017D2
式中：Y为双歧杆菌活菌数OD值；
A为雪莲果汁体积分数；
B为果糖添加量；
C为脱脂乳粉添加量；
D为番茄汁体积分数。
由表8可知，所选模型的P值=0.0004<0.05，
即模型的不同处理间差异显著，说明用回归方程
描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与
全体自变量之间的线性关系显著，即该试验方法
可靠。失拟项=0.0607>0.05，失拟项差异不显著，
说明该方程对试验拟合情况好，试验误差小。
R2=0.8592，方程拟合度较好。
2.4 CCD试验结果分析及果蔬汁配方优化及验证
利用Design-Expert 7.0软件以及上述二次多元
回归拟合方程、回归模型方差分析表，得二次回
归方程的响应曲面图和等高线见图1~图6。所得
等高线呈圆形说明2因素交互作用不显著，呈椭圆
或者马鞍形则表明作用显著，可以看出雪莲果汁
体积分数、果糖添加量、脱脂乳粉添加量和番茄
汁添加量这4个因素，两两之间对响应值的交互作
用均为显著。根据回归方程，预测双歧杆菌发酵
胡萝卜雪莲果复合发酵果蔬汁的配方为雪莲果汁
表7 响应面旋转中心组合(CCD)设计与试验结果
试验号
因素 OD600X1 X2 X3 X4
1 -1 -1 -1 -1 0.892
2 1 -1 -1 -1 0.925
3 -1 1 -1 -1 0.914
4 1 1 -1 -1 0.91
5 -1 -1 1 -1 0.923
6 1 -1 1 -1 0.935
7 -1 1 1 -1 0.901
8 1 1 1 -1 0.861
9 -1 -1 -1 1 0.915
10 1 -1 -1 1 0.868
11 -1 1 -1 1 0.94
12 1 1 -1 1 0.889
13 -1 -1 1 1 0.934
14 1 -1 1 1 0.864
15 -1 1 1 1 0.969
16 1 1 1 1 0.874
17 -2 0 0 0 0.902
18 2 0 0 0 0.918
19 0 -2 0 0 0.928
20 0 2 0 0 0.928
21 0 0 -2 0 0.885
22 0 0 2 0 0.867
23 0 0 0 -2 0.863
24 0 0 0 2 0.905
25 0 0 0 0 0.939
26 0 0 0 0 0.965
27 0 0 0 0 0.959
28 0 0 0 0 0.963
29 0 0 0 0 0.962
30 0 0 0 0 0.965
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体积分数20.00%、果糖添加量0.50 g/L、脱脂乳粉
添加量13.88 g/L、番茄汁添加量8.28%。预测值为
0.948。按照此配方进行验证试验，得到双歧杆菌
发酵果蔬汁OD值达0.946，活菌值达3.35×108 cfu/
mL，所得结果与预测模型值基本符合。
2.5 对优化后的发酵果蔬汁的评价
优化后发酵果蔬汁的各项指标结果如表9所示。
表9 发酵前后优化果蔬汁指标
检测指标 pH值 多糖 OD600 双歧杆菌活菌数
发酵前 7.44 1101 mg/L 0 0
发酵后 3.89 1220 mg/L 0.998 3.35×108 cfu/mL
从发酵前后果蔬汁的各项指标变化，可以看
出发酵前后果蔬汁的pH值降低，发酵过程中双歧
杆菌发酵产生的乳酸pH下降；多糖的增加量由双
歧杆菌代谢产生；发酵终点的活菌数可达到108
cfu/mL以上，符合活菌饮料的活菌数要求。
3 讨论
双歧杆菌是严格的厌氧菌，对营养要求严
格，在营养丰富的培养基中生长活菌数可达到
108~109 cfu/mL。如动物双歧杆菌乳亚种Bb-12
表8 响应面旋转中心组合(CCD)试验回归模型方差分析
来源 均方和 自由度 均方 F值
p-值
Pro6＞F
显著
性
模型 0.029 14 2.08E-03 6.54 0.0004 显著
A-雪莲果汁 2.20E-03 1 2.20E-03 6.94 0.0188
B-果糖 1.67E-07 1 1.67E-07 5.25E-04 0.982
C-脱脂乳粉 3.27E-05 1 3.27E-05 1.00E-01 0.7529
D-番茄汁 2.41E-04 1 2.41E-04 0.76 0.3978
AB 8.70E-04 1 8.70E-04 2.74 0.1186
AC 9.61E-04 1 9.61E-04 3.03 0.1024
AD 4.36E-03 1 4.36E-03 13.71 0.0021
BC 6.76E-04 1 6.76E-04 2.13 0.1652
BD 2.03E-03 1 2.03E-03 6.38 0.0233
CD 1.56E-04 1 1.56E-04 4.90E-01 0.4938
A2 3.28E-03 1 3.28E-03 10.33 0.0058
B2 1.14E-03 1 1.14E-03 3.58 0.078
C2 0.01 1 0.01 32.63 <0.0001
D2 8.34E-03 1 8.34E-03 26.26 0.0001
残差 4.77E-03 15 3.18E-04
失拟项 4.27E-03 10 4.27E-04 4.29 0.0607 不显著
纯误差 4.97E-04 5 9.94E-05
矫正总和 0.034 29
图1 雪莲果汁体积分数和果糖添加量交互作用的响应面图和等高线图
图2 雪莲果汁体积分数和脱脂乳粉添加量交互作用的响应面图和等高线图
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图6 脱脂乳粉添加量和番茄汁添加量交互作用的响应面图和等高线图
图3 雪莲果汁体积分数和番茄汁添加量交互作用的响应面图和等高线图
图4 果糖添加量和脱脂乳粉添加量交互作用的响应面图和等高线图
图5 果糖添加量和脱脂乳粉添加量交互作用的响应面图和等高线图
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在MRS中培养，活菌数最高可达4.07×108 cfu/
mL[17]；两双歧杆菌与其他乳酸菌混合发酵胡萝卜
汁，活菌数可达6.5×107 cfu/mL[18]；长双歧杆菌
R0175在牛乳和豆浆中培养24 h，活菌数分别可达
3.6×108 cfu/mL和4.7×108 cfu/mL[19]；另外，王洋
等研制的双歧杆菌发酵雪莲果饮料的活菌数可达
1.69×108 cfu/mL[20]，活菌数量还有进一步提升的
空间。雪莲果的主要成分是低聚糖，虽然可以促
进双歧杆菌增殖，但营养成分较单一，并缺乏氮
源。因此本研究在雪莲果的基础上，增加了富含
氨基酸和多种维生素的胡萝卜汁，同时补充脱脂
乳粉以丰富氮源，加入番茄汁以降低氧化还原电
位，为双歧杆菌的生长创造了更好的厌氧环境。
最终制得的复合发酵果蔬汁双歧杆菌活菌数可以
达到3.35×108 cfu/mL，并且含有1220 mg/L多糖。
4 结语
本文主要通过响应面优化试验，优化了双歧杆
菌发酵胡萝卜雪莲果复合型果蔬汁的工艺参数，活
菌数达3.35×108 cfu/mL。与之前研究的单纯雪莲果
发酵饮料相比，其活菌数有所提高，对后期进一步
开发复合型双歧杆菌发酵果蔬汁饮料具有一定的参
考价值。
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