全 文 ：　　收稿日期:2010-04-02
　　基金项目:陕西省重大科技攻关资助项目(2006Kz07-G2);陕西
省科技攻关资助项目(2008K02-06)
　　作者简介:张为民(1967-),男 ,副教授 ,博士生。
＊通讯作者 , E-mail:zhangym@nw suaf.edu.cn
朱砂七提取物体外抑菌和抗病毒活性部位筛选
张为民 ,张彦明＊ ,郭抗抗 ,胡　静　(西北农林科技大学 动物医学院 ,陕西 杨凌 712100)
摘要:为筛选朱砂七提取物体外抑制 9株临床分离致病菌和抑制新城疫病毒(NDV)的活性部位 , 采用琼脂扩散和
试管稀释法进行体外抑菌试验 ,M TT 法和鸡胚法测定了朱砂七提取物对 NDV 在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚内
增殖的影响。结果显示 ,朱砂七乙酸乙酯部位(PCE)对 9 株临床分离菌的 MBC 均小于 100 g/ L;朱砂七氯仿部位
(PCC)有一定的抑菌作用;大黄素对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡
萄球菌(奶牛)的 MBC 分别为 5 , 2.5 , 2.5 , 2.5 , 1.25 g/ L;PCE进一步分离部位 PCEA 对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、
无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌的 MBC 分别为 24 , 24 , 12 , 6 , 6 g/ L。 PCC 和大黄素对
NDV 在CEF 上增殖的抑制作用不明显;PCE 对 NDV 在CEF 上的抑制率为 39.12%(P<0.01), PCEA 对 NDV 在
CEF 上的抑制率为 72.33%(P<0.01);PCEA 对 NDV 在鸡胚中增殖具有抑制作用 , 其预防组和药毒混合组与病
毒对照组的血凝效价差异显著(P<0.05),而治疗组与病毒对照组差异不显著。由此可知 ,朱砂七提取物具有抑制
细菌作用 , PCE 和 PCEA 对 NDV 的增殖具有一定的抑制作用。
关键词:朱砂七提取物;新城疫病毒;体外抑菌;活性部位
中图分类号:S853.74　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-4545(2011)05-0710-05
Active site selection on of Polygonum taibaishanense Kung.extratives inhibiting
bacteria and NDV in vitro
　 ZHANG Wei-min , ZHANG Yan-ming＊ , GUO Kang-kang , H U Jing 　(College o f Veterinary Medi-
cine , Northwest A &F Universi ty ,Yang ling ,Shaanx i 712100 ,China)
Abstract:To select the activ e site of Polygonum taibaishanense Kung.ex tratives on inhibiting 9 kinds of pa thogenic
bacteria separ ated fr om clinical and anti-NDV , the antibacterial effect wa s observ ed by using agar diffusion and test
dilution methods.In addition , cellular pa tho lo gical change and M TT methods we re used to study the effect of Polyg-
onum taibaishanense Kung.ex tr atives on pro life ration o f NDV in bo th chick embryo fibroblast(CEF)and chick em-
bryo.The results showed tha t all the minimal bactericidal concentra tion (MBC) of ethyl aceta te site (PCE) to 9
kinds of bacte ria w ere lowe r than 100 g/ L.Chlo ro form site (PCC)owned some antibacterial effects.The MBC o f
emodin to Salmonella(chicken), Streptococcus(pig let), S treptococcus agalactiae(cow), S taphy lococcus epidermidis
(cow), and S taphy lococcus aureus(cow)we re 5 , 2.5 , 2.5 , 2.5 and 1.25 g/ L , respectiv ely.The MBC of A iso lates
from PCE(PCEA)to S almone lla(chicken), S treptococcus(pig let), S treptococcus agalactiae(cow), S tap hy lococcus
epidermidis(cow), and Staphy lococcus aureus(cow)we re 24 , 24 , 12 , 6 and 6 g/ L , respectively.No evident inhibito ry
action of PCC and emodin w ere obser ved on prolifera tion o f NDV in CEF.The inhibition ra te of PCE on NDV in
CEF w as 39.12%(P<0.01), and the inhibition rate of PCEA on NDV in CEF was 72.33%(P<0.01).PCEA had
inhibitory effect on prolifer ation o f NDV in chick embryo w ith a significant difference of hemagg lutination valency
betw een prevention g roup or herbal to xicity mixed g roup and virus contr ol g roup , but no difference could be seen be-
tw een tr eated gr oup and virus contro l.So Polygonum taibaishanense Kung.ex trativ es could inhibit several bacteria in
vitro.PCE and PCEA had inhibitory effect on prolifera tion of NDV.
Key words:Polygonum taibaishanense Kung.ex trativ es;NDV;antibacterial in vitro;activ e site
＊ Corresponding author , E-mail:z hangym@nwsua f.edu.cn
　　朱砂七(Polygonum ci l linerve),别名朱砂莲 、
红药子 ,始载于《图经本草》 ,为蓼科 Polygonum ci l-
l inerve (Nakai)Ohw l蓼属植物毛脉蓼的块根 ,其
味苦 、微涩 、性凉 、平 ,具有清热解毒 、活血凉血 、止血
710 　中 国 兽 医 学 报　2011年 5月　第 31 卷　第 5 期　Chin J Vet S ci 　May 2011　Vo l.31 　No .5 　
DOI :10.16303/j.cnki.1005-4545.2011.05.010
止泻 、去风湿 、强腰膝等功能。该药临床效果显著 ,
为重要的“太白七药”之一 ,且已被《陕西卫生志》列
为陕西地道名贵草药[ 1-3] 。有效活性成分分析显示 ,
朱砂七中含有大黄素(Emodin)、大黄素甲醚(Phy-
scion)[ 4] 、大黄素-8-β-D-葡萄糖甙(Emodin-8-β-D-
glucopy ranoside)[ 5] 、大黄素甲醚-8-β-D-葡萄糖甙
(Physcion-8-β-D-g lucopy rano side)和鞣质等[ 2] 。研
究表明 ,朱砂七水煎液和大黄素有较强的抑菌作
用[ 4] ,朱砂七水提液和总蒽醌及大黄素具有抗病毒
活性[ 4 , 6-7] , 总蒽醌具有抗炎和抗溃疡等药理活
性[ 8-9] ,朱砂七粗多糖具有一定的体外抗氧化能力和
体外抗肿瘤活性[ 10] 。本研究在前人研究工作的基
础上 ,对朱砂七活性成分进行了提取和分离 ,并对其
在体外抑制 NDV 及从患病畜禽临床分离的 9株致
病菌的活性部位进行了筛选 ,以期为朱砂七在畜禽
疾病防治中的应用提供依据。
1　材料与方法
1.1　主要试剂　朱砂七根茎(PC),由陕西省眉县
金渠药材分公司太白山草药研究所卫拉船中药师提
供并鉴定;大黄素(Emodin , 110756)和大黄素甲醚
(Physcion ,110758)标准品 ,购自中国药品生物制品
检定所;DMEM 培养基 、胰酶 、犊牛血清 ,购自西安
华美公司;四甲基偶氮唑盐(MT T)、二甲基亚砜
(DMSO)为 Sigma 公司产品;甲基纤维素 、琼脂糖 、
乙醇 、甲醇 、石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、正丁醇 、碳酸
钠 、碳酸氢钠和氢氧化钠等均为国产分析纯;蛋白
胨 、牛肉膏 、琼脂均由北京奥博星生物技术责任有限
公司生产;柱层层析和薄层层析硅胶购自青岛海洋
化工厂。
1.2　主要仪器　X-6显微熔点测定仪(未校正 ,北
京泰克仪器公司)、超纯水仪(Millopo re 公司)、混合
纤维脂微孔滤膜(0.22 μm)、组织培养倒置显微镜
(重庆普光)、酶标仪 、HPS-250 生化培养箱和细胞
培养板(Costar)等。
1.3　病毒 、菌种 、细胞和鸡胚　SPF 鸡胚和非免鸡
胚 ,由陕西杨凌绿方生物工程有限公司提供 ,参照文
献[ 11]的方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF),调整其
密度为 1×106/mL。鸡新城疫低毒力活疫苗(Laso-
ta 株 ,中牧股份南京药械厂生产 ,批号:S0812373),
用 9 日龄鸡胚传代复壮 , Reed-Meuench法[ 11] 测定
CEF 半数组织培养感染量 TCID50为 10-6.23 ;从不
同畜禽养殖场在不同时期临床患病动物临床分离的
10株分离菌 ,包括大肠埃希菌(E scherichia coli)2
株(1株分离于蛋鸡 , 1株分离于奶牛乳房炎);沙门
菌(Salmonel la)1株(分离于鸡);猪链球菌(Strep-
tococcus)1株(分离于仔猪);巴氏杆菌(Pasteurel la
mul tocida)1株(分离于山羊);无乳链球菌(Strep-
tococcus agalactiae)1株 、表皮葡萄球菌(S.epider-
midis)1株 、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄
球菌(S taphy lococcus aureus)和蜡样芽孢杆菌(Ba-
cil lus cereus)各 1 株(分离于奶牛乳房炎),均由西
北农林科技大学动物医学院动物疫病防治与畜产品
安全实验室分离 、鉴定并保存。
1.4　PC各提取部位的提取与分离　PC粉碎 ,称取
5 kg ,用 95%的乙醇冷浸提取 ,减压回收溶剂得到
95%乙醇浸膏(PCA)。蒸馏水捏溶 ,依次用石油醚 、
氯仿 、乙酸乙酯和正丁醇 4部位萃取 ,分别得到石油
醚部位(PCP)、氯仿部位(PCC)、乙酸乙酯部位
(PCE)、正丁醇部位(PCN)和水相部位(PCW)提取
物 。PCC 参照文献[ 12]方法进一步分离和纯化 ,与
标准对照品薄层层析检测(T LC)得到单体 1和单体
2[ 13] 。PCE 经硅胶柱色谱 、用氯仿-甲醇梯度洗脱 、
TLC 合并得到 3个分离物 PCEA 、PCEB 和 PCEC。
以上各分离部位或成分保存备用 。
1.5　溶剂的选择及药液的制备　比较不同溶剂及
助溶剂对 PC 各分离部位的溶解度 ,并结合试验需
要选择适合的溶剂或助溶剂 。选用的溶剂及助溶剂
有注射用水 、生理盐水 、甲醇 、二甲基亚砜 、吐温 80
等 ,通过筛选 ,以 2%吐温 80为溶剂的溶解性较好。
将各部位配制为 100 g/L 的中药悬液(试管法抑菌
时配制为 200 g/L),大黄素和大黄素甲醚配制成 10
g/L 的中药悬液 ,将 PCE 分离的 PCEA 、PCEB 和
PCEC 配制为 48 g/ L 的中药悬液 ,供抑菌试验用。
1.6　PC提取物对细菌的抑制作用
1.6.1　培养基和菌悬液的制备　普通肉汤 、血清肉
汤 、普通琼脂平板 、血清平板均按常规方法制备 。各
供试菌种用灭菌生理盐水稀释至 1×105 ～ 2×105
cfu/mL 后备用。
1.6.2　琼脂扩散法　在无菌条件下 ,用灭菌 L 型
玻璃棒将细菌均匀涂抹在直径为 90 mm 的琼脂平
板上 ,用直径 4 mm 的打孔器打孔 ,每个平板打 4个
孔 ,分别在孔内加满不同的药液和溶剂对照液。移
入 37 ℃培养箱培养 24 h 后 ,观察抑菌环大小并测
量抑菌环直径。每种药液重复 3次 ,结果取平均值。
1.6.3　最低抑菌浓度(M IC)测定和最低杀菌浓度
(MBC)测定　采用试管二倍稀释法。根据琼脂扩
散法体外抑菌试验结果 ,在无菌条件下 ,取无菌试管
10支(15 mm×100 mm),每管加入肉汤 2 mL ,在第
1管加入药物原液 2 mL ,连续倍比稀释至第 8管 ,
711　中 国 兽 医 学 报　2011 年 5 月　第 31卷　第 5期　Chin J Vet Sci　M ay 2011 　Vol.31 　No.5　
并从第 8管中吸取 2 mL 弃去 ,第 9管为细菌生长
对照 ,第 10管为药物对照(不加细菌和肉汤)。在每
管内加入制备好的各种菌悬液 0.1 mL。接种完毕
后 ,置于 37 ℃恒温培养箱培养 18 ～ 24 h ,重复3次 。
结果判定:肉眼观察 ,不发生混浊变化的最高提取物
稀释倍数即为该提取物的 M IC 。
吸取已经定出 M IC 的各组试管培养液各 100
μL ,加入到适宜的琼脂培养基上 ,用灭菌 L 型玻璃
棒涂布均匀 ,置 37 ℃恒温培养箱中培养 18 ～ 24 h ,
试验重复 3 次。结果判定:菌落数不超过 5个的最
低提取物浓度即为该提取物的 MBC 。
1.7　PC提取物对 NDV在 CEF增殖的抑制作用
1.7.1　PC 提取物对 CEF 最大无毒质量浓度的测
定　PCP 、PCC 、PCKE 和 PCN 各部位先用适量体
积分数 2%吐温 80溶解后 ,再用维持液配制成质量
浓度为156μg/L 溶液 ,大黄素和大黄素甲醚分别配
制成质量浓度为 70 μg/L 溶液 , PCEA 、PCEB 和
PCEC分别配制成质量浓度为 500 μg/L 溶液 ,微孔
滤膜滤过 ,二倍稀释法加入 CEF 已基本长成单层的
96孔细胞板内 ,每孔 100 μL ,每浓度重复 4孔 ,同时
设正常细胞对照 。在 37 ℃、5%CO 2 条件下培养 ,
每隔 12 h镜下观察细胞 ,记录病变情况 ,与正常细
胞相比无退变 、变形和脱落。96 h 后每孔加入 5 g/
L MT T 30 μL ,37 ℃孵育 4 h后 ,吸弃孔内液体 ,每
孔加入 100 μL DMSO ,振荡 10 min ,静置 10 min ,
用酶标仪测 D630值 ,确定 PC 提取物对 CEF 的最大
无毒浓度 。
1.7.2　PC 提取物对 NDV 的抑制作用　先将 100
TCID50病毒液 50 μL 加入 CEF 已基本长成单层的
96孔细胞板内 ,再加入 2 倍量的最大无毒浓度 PC
提取物 50 μL ,重复 4孔;同时设细胞对照组 ,仅加
细胞维持液;病毒对照组 ,病毒 37℃吸附1.5 h后洗
涤 ,再加入细胞维持液;药物对照组 ,加入各最大无
毒浓度的 PC 提取物;无细胞孔为测定时的空白调
零孔 。在 37℃、5%CO 2 条件下培养 ,每隔12 h镜下
观察 ,记录细胞病变情况。72 h 后 , 每孔加 5 g/ L
MTT 30 μL , 37 ℃孵育 4 h后 ,吸弃孔内液体 ,每孔
加入 100μL DMSO ,振荡 10 min ,静置 10 min ,用
酶标仪测 D630值 。
1.8　PCEA提取物对NDV在鸡胚内增殖的抑制作用
1.8.1　PCEA 对鸡胚的安全性试验　选 9日龄鸡
胚 ,采用尿囊腔接种法注入 PCEA 0.2 mL ,以生理
盐水作为溶剂 ,使其质量浓度依次为 0.2 ,0.4 , 0.8 ,
1.2 , 2.4 g/L ,每个质量浓度组 6 枚。移入 37℃温
箱中培养 ,每日在检卵灯下观察鸡胚情况 ,弃去 24
h内死亡的鸡胚 ,以 24 ～ 72 h 内鸡胚全部存活作为
该药对鸡胚无急性毒性的浓度。
1.8.2　PCEA 对 NDV 在鸡胚内增殖的抑制试验
　选择 9日龄鸡胚 ,随机分为以下 4组 ,每组 6枚。
预防组:尿囊腔接种药液 0.2 mL ,37℃1 h后 ,接种
病毒 0.1 mL ;治疗组:尿囊腔接种病毒 0.1 mL ,
37℃1 h 后 ,接种药液 0.2 mL;药毒混合组:病毒
0.1 mL 、药液 0.2 mL 混合 ,室温 1 h ,接种尿囊腔;
病毒对照组:尿囊腔接种病毒 0.1 mL ,37℃1 h后 ,
接种生理盐水 0.2 mL。以上各组鸡胚接种完毕后 ,
用石蜡封孔 。放入37.5℃温箱孵育 96 h ,每12 h照
蛋 1次 ,弃去 24 h 内死亡的鸡胚 。收集余胚尿囊
液 ,测定其血凝(HA)效价 。
1.9　统计学处理　利用 SPSS 软件对组间病毒抑
制率的差异性及药物剂量对数和病毒抑制率进行相
关性分析 。抑制率=[(药物处理组平均 D630值-病
毒对照组平均 D630值)/(细胞对照组平均 D630值-
病毒对照组平均 D630值)] ×100%。
2　结果
2.1　PC各分离物 TLC检测　用展开剂石油醚(30
～ 60℃)∶甲酸乙酯∶甲酸(体积比 15∶5 ∶1)的上
层溶液将 PCC分离的单体 1 和单体 2通过硅胶 H
薄板层析板展开 ,与大黄素和大黄素甲醚标准品对
照在紫外光灯和氨水熏蒸显色与标准品比较 , Rf 值
相同 ,混合点样展开完全重合 ,单体 1为橙红色针状
结晶 , mp.256 ～ 257℃, 鉴定为大黄素(Rf 值为
0.33),单体 2为砖红色针状结晶 ,mp.206 ～ 207℃,鉴
定为大黄素甲醚(Rf 值为 0.64)。用展开剂氯仿∶甲
醇(体积比 4∶1)将 PCE进一步分离物进行 TLC检
测 ,在紫外光灯和 5%的硫酸乙醇显色 , PCEA 成分复
杂 ,最少含5个以上化合物(Rf 值分别为 0.33 ,0.41 ,
0.45 ,0.48 , 0.61), PCEB显示 1 点(Rf 值为 0.48),
PCEC显示 2点(Rf 值分别为 0.87 ,0.97)。
2.2　PC提取物琼脂扩散法体外抑菌结果　由表 1
可知 ,PCA对 9株分离菌均有一定的抑菌作用;4部
位分离后 ,其中 PCC 和 PCE 对供试各菌均有抑制
作用 ,而 PCA 、PCN 和 PCW 的抑菌效果较差;除从
山羊分离的巴氏杆菌外 ,大黄素对其他各菌均有抑
菌作用;大黄素甲醚效果较差;除巴氏杆菌(山羊)
外 ,大黄素对 8株分离菌均有抑菌作用;除大肠埃希
菌(奶牛)和巴氏杆菌(山羊)外 ,PCEA 对其他各菌均
有抑菌作用 ,而 PCEB和 PCEC的抑菌效果差 。大黄
素和 PCEA对敏感细菌的抑菌环直径均大于 10 mm 。
712 　中 国 兽 医 学 报　2011年 5月　第 31 卷　第 5 期　Chin J Vet S ci 　May 2011　Vo l.31 　No .5 　
表 1　PC 提取物琼脂扩散抑菌试验结果 d/ mm
药物 ρ/(g· L -1)大肠埃希菌 沙门菌 链球菌 巴氏杆菌 无乳链球菌 表皮葡萄球菌 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌 蜡样芽孢杆菌
PCA 100 12.0 15.0 20.1 10.2 12.0 25.0 10.0 25.2 12.0
PCP 100 12.1 17.2 - 7.6 16.0 24.2 - 26.3 -
PCC 100 11.3 10.3 27.3 8.8 30.0 29.0 16.5 28.7 17.5
PCE 100 13.3 17.8 32.2 11.3 21.1 34.6 18.4 >40.0 21.7
PCN 100 7.0 12.4 18.4 - 22.4 24.0 - 22.0 8.9
PCW 100 - - - - - - - 15.0 -
大黄素 10 10.3 12.4 14.6 - 15.6 18.4 14.4 25.0 24.2
大黄素甲醚 10 7.7 10.1 10.4 - - 17.8 - 18.4 10.4
PCEA 48 - 13.6 29.8 - 13.9 29.3 20.5 35.0 19.6
PCEB 48 - 6.5 - - - 7.0 - 9.0 12.7
PCEC 48 - - 7.5 - - 14.0 - 24.0 9.4
　　注:“ -”表示未出现抑菌现象
2.3　PC提取物最低抑菌浓度(MIC)测定和最低杀
菌浓度(MBC)测定结果　由表 2可知 ,PCE对 9株
临床分离菌的 MBC 均小于 100 g/ L。大黄素对沙
门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡
萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌(奶牛)的 MBC 分
别为 5 ,2.5 , 2.5 , 2.5 , 1.25 g/L 。PCEA 对沙门菌
(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球
菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌的 MBC分别为 24 ,24 ,
12 ,6 ,6 g/L 。
表 2　PC 提取物 MIC 和 MBC 测定结果 g/ L
药物 大肠埃希菌
MIC MBC
沙门菌
MIC M BC
链球菌
MIC MBC
巴氏杆菌
MIC MBC
无乳链球菌
MIC MBC
表皮葡萄球菌
M IC M BC
绿脓杆菌
MIC MBC
金黄色葡萄球菌
MIC MBC
蜡样芽孢杆菌
MIC M BC
PCP 25 >100 12.5 25 12.5 100 12.5 >100 12.5 50 1.56 6.25 1.56 6.25
PCC 12.5 50 25 >100 6.25 12.5 6.25 >100 3.16 6.25 6.26 12.5 50 100 6.26 12.5 50 100
PCE 50 50 50 50 3.16 3.16 12.5 100 3.16 3.16 3.16 12.5 50 100 3.16 12.5 50 100
PCN 50 >100 50 >100 6.25 25 6.25 12.5 6.26 50 1.56 12.5 3.16 25
大黄素 5 >5 5 5 2.5 2.5 2.5 2.5 1.25 2.5 5 >5 1.25 1.25 2.5 >5
PCEA 12 24 3 24 6 12 0.75 6 24 >24 1.5 6 6 >24
2.4　PC提取物对 CEF的最大无毒质量浓度的测
定结果　PCP 、PCC 、PCE和 PCN 对 CEF 的最大无
毒质量浓度分别为 9.8 , 4.9 , 19.5 ,4.9 μg/ L;大黄
素对 CEF 的最大无毒质量浓度为 8.75 μg/L;大黄
素甲醚最大溶解质量浓度为 70 μg/L 时未测出毒
性;PCEA 、PCEB和 PCEC对 CEF 的最大无毒质量
浓度分别为 62.5 ,250.0 ,250.0 μg/L。
2.5 　PC 提取物对 NDV 的抑制结果 　PCE 对
NDV 在 CEF 上的抑制率为 39.12%, PCEA 对
NDV 在 CEF 上的抑制率为 72.33%,与病毒对照
组(0.0%)相比差异极显著(P <0.01),表明 PCE
部位具有抑制 NDV 作用 ,进一步分离物 PCEA 抑
制 NDV 效 果 更好;而 PCP (12.22%)、 PCC
(4.40%)、PCN(3.42%)、大黄素(10.35%)、大黄素
甲醚(4.64%)、PCEB(11.22%)和 PCEC(10.50%)
对 NDV 在 CEF 上的抑制效果均很差(P >0.05),
说明没有抑制 NDV 在 CEF 上增殖的作用 。
2.6　PCEA对鸡胚的安全性　鸡胚接种药物后 , 72
h内 1.2 g/ L 组鸡胚全部存活 ,判断为鸡胚无毒剂
量 。
2.7　PCEA对 NDV在鸡胚内增殖的抑制　结果见
表 3。对不同途径组血凝效价进行方差分析 ,结果
显示 PCEA预防组及药毒混合组与病毒对照组的
血凝效价差异显著(P <0.05),而治疗组与病毒对
照组差异不显著;说明 PCEA 在预防组及药毒混合
组对 NDV 的增殖有显著的抑制作用 。
表 3　PCEA 对 NDV 鸡胚内增殖的抑制作用
组　别 胚数/枚 血凝效价(x—±s)
预防组 6 4.75±1.71＊
治疗组 6 8.75±0.50
药毒混合组 6 3.25±0.96＊
病毒对照组 6 9.20±0.45
　　注:＊示与病毒对照组相比差异显著(P<0.05)
3　讨论
朱砂七水提液对金黄色葡萄球菌 、白色葡萄球
菌 、福氏痢疾杆菌 、大肠埃希菌 、绿脓杆菌有抑制作
713　中 国 兽 医 学 报　2011 年 5 月　第 31卷　第 5期　Chin J Vet Sci　M ay 2011 　Vol.31 　No.5　
用[ 4] ,大黄素-8 -β-D-葡萄糖甙和大黄素是抗菌的有
效成分[ 5] 。本研究对朱砂七采用经典的 4部位提取
法 ,得到 PCP 、PCC 、PCE 和 PCN 。前期研究表明 ,
朱砂七 4部位对实验室保存的 5 株教学用菌株(大
肠埃希菌 、金黄色葡萄球菌 、沙门菌 、多杀性巴氏杆
菌和无乳链球菌)均有一定的抑制作用 ,其中 PCE
对5株细菌的MBC 均小于50 g/ L[ 14] 。本次选用从
临床分离于不同种类动物的 9株致病菌进行抑菌试
验 ,包含革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌 、表皮葡萄
球菌 、链球菌 、芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠埃希
菌 、绿脓杆菌 、巴氏杆菌 、沙门菌)。结果表明 , PCC
和 PCE对供试各菌均具有很好的抑菌活性 , PCE
对 9株临床分离菌的 MBC 均小于 100 g/ L。大黄
素对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、
表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌的 MBC 分
别为 5 , 2.5 , 2.5 , 2.5 , 1.25 g/L , PCEA 对沙门菌
(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球
菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌的 MBC 分别为 24 ,24 ,
12 ,6 ,6 g/ L。结果表明 , PCA 对各分离菌具有较强
的活性 ,说明朱砂七具有广谱抑菌作用 ,4部位分离
中以 PCC 和 PCE 抑菌效果明显 ,进一步分离物以
大黄素和 PCEA 抑菌效果好 ,但其抑菌种类有所减
少。结合 T LC 检测 , PCE 5%硫酸乙醇显色后 ,共
显示出 11个点 ,提示可能含有 11种以上的化合物 ,
PCEA 、PCEB及 PCEC 这 3 个部分 TLC 检测及显
色后 ,斑点减少 ,可能是由于 PCE 在分离合并时丢
失了一些成分 ,导致了 PCE分离物的抑菌活性的降
低;亦有可能是由于 PCE 中各成分之间的协同作
用 ,使其抑菌活性强于单个成分的活性 。
蓼属(Polygonum)是蓼科植物中的一个药用大
属 ,具有多种药理活性[ 15] ,对其抑菌和抗病毒相关
研究一直受到重视。资料显示:大黄乙醇提取物具
有明显的抗 NDV 作用[ 16] ,虎杖(Polygonum cuspi-
datum Sieb.et Zucc.)乙醇浸出物也具有抑制乙型
肝炎病毒作用[ 17] 和显著抑制链球菌的作用[ 18] ,蓼蓝
(Polygonum tinctorium Ait.)具有抑制 HIV-1 的
作用[ 19] ;前人的研究已表明朱砂七水提液对多种病
毒具有有效的抑制作用 ,而朱砂七大黄素对甲型流
感病毒(京科 68-1株)和 Ⅰ型副流感病毒(仙台株)
没有抑制作用 ,其抗病毒成分应在除去大黄素之外
的有效成分中进行探索[ 4] 。朱砂七中总蒽醌对流感
病毒 A 在狗肾细胞内的增殖具有抑制作用 ,而朱砂
七大黄素则无抑制作用[ 7] 。大黄素具有抑制乙肝病
毒[ 20-21] 、非典病毒[ 22] 和人类疱疹病毒第四型[ 23-24] 等
作用 。本研究表明 ,PCE 和进一步分离物 PCEA 具
有抑制 NDV 在 CEF 内的增殖作用 ,而大黄素没有
抑制作用。对分离物 PCEA 采用不同给药方法进
行鸡胚内抑制 NDV 试验 , PCEA 与 NDV 混合感作
后接种鸡胚组 NDV 的抑制率较高 ,表现出较强的
抗病毒活性 ,说明可能通过直接杀灭病毒来保护细
胞;而先加药后染病毒组和先接种病毒后加药组的
NDV 抑制率较低 ,说明 PCEA 无法保护鸡胚和杀
灭病毒;先加药后染病毒组比先接种病毒后加药组
NDV 抑制率高 ,说明 PCEA 对 NDV 感染细胞具有
早期预防作用 。大黄素 、大黄素甲醚 、PCEB 和
PCEC 对NDV均没有抑制作用 ,说明朱砂七的抗病
毒成分富集于 PCEA部分 ,基于 PCEA成分较为复
杂 ,其中主要由哪种成分起作用或者是几种成分协
同作用 ,尚有待于进一步研究。
参考文献:
[ 1] 　刘西京.朱砂七研究概况[ J] .陕西中医学院学报 ,
2003 , 5(3):62-63.
[ 2] 　《中华本草》编委会.中华本草(第二卷)[ M ] .上海:上
海科学技术出版社 , 1999:1347-1348.
[ 3] 　彭　洁 , 乔　逸 ,耿增岩 ,等.“太白七药”的历史沿革及
研究概况[ J] .辽宁中医药大学学报 , 2009 , 11(2):65-
66.
[ 4] 　马振亚.中药抗病毒抗菌作用研究[ M] .北京:中国医
药科技出版社 , 2005:50-54.
[ 5] 　韩公羽.朱砂七抗菌有效成份的研究[ J] .第二军医大
学学报 , 1985 , 6(1):27-29.
[ 6] 　郭惠玲 ,邓亚莉 , 楚雍烈.朱砂七总蒽醌及朱砂七大黄
素体外抗甲型流感病毒实验研究[ J] .陕西中医学院
学报 , 2005 , 28(5):63-64.
[ 7] 　郭惠玲 ,赵　琦 , 田小平.朱砂七抑制流感病毒 A 的试
验研究[ J] .陕西中医 , 2006 , 27(3):351-353.
[ 8] 　卫　昊 ,刘西京 , 郭　洁 ,等.朱砂七总蒽醌抗炎作用的
实验研究[ J] .陕西中医学院学报 , 2004 , 27(1):30-31.
[ 9] 　袁鲜云 , 武希桃.朱砂七抗炎及抗溃疡作用的实验研究
[ J] .陕西中医学院学报 , 2003 , 26(23):48-49.
[ 10] 　崔军见 , 原江锋 ,张志琪.朱砂七粗多糖的提取及生物
活性的研究[ J] .天然产物研究与开发 , 2007 , 19(6):
960-964.
[ 11] 　殷　震 , 刘景华.动物病毒学[ M] .2 版.北京:科学出
版社 , 1997:204-206.
[ 12] 　裴月湖.天然药物化学实验指导[ M] .2 版.北京:人
民卫生出版社 , 2007:159-169.
[ 13] 　中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国
药典中药薄层色谱彩色图集[ M ] .广州:广东科技出
版社 , 1993:22-24.
[ 14] 　张为民 , 张彦明 ,邢福珊 , 等.太白山 7 种中草药体外
(下转 719页)
714 　中 国 兽 医 学 报　2011年 5月　第 31 卷　第 5 期　Chin J Vet S ci 　May 2011　Vo l.31 　No .5 　
利用 EK 切割融合蛋白可以保证重组蛋白 N
端的氨基酸不被改变 ,从而不影响重组蛋白的活性 。
本研究利用酵母成功地表达了猪 EKL 基因 , 表达
产物具有生物活性 ,这为将来通过融合策略制备重
组抗菌肽 ,规模化生产具有生物活性抗菌肽提供了
实验依据 。
参考文献:
[ 1] 　Kitamo to Y , Yuan X ,Wu Q , et al.Ente rokinase , the in-
itiato r of intestinal dig estion is a mosaic pr otease com-
posed of a distinc tive assor tment of domains [ J] .
PNAS , 1994 , 91:7588-7592.
[ 2] 　L iepnieks J J , L ight A.The preparation and propertie s
o f bovine enterokinase[ J] .J Biol Chem , 1979 , 254:
1677-1683.
[ 3] 　H uang L , Ruan H , Gu W , e t al.Functional expression
and purification of bovine enterokinase light chain in
recombinant Escherichia coli[ J] .P rep Bio chem Bio-
techno l , 2007 , 37(3):205-217.
[ 4] 　L ight A , Fonseca P.The prepara tion and proper ties of
the cataly tic subunit of bov ine enterokinase[ J] .J Bio l
Chem , 1984 , 259:13195-13198.
[ 5] 　Cregg J M , Vedvick T S , Raschke W C.Recent ad-
vances in the expr ession of fo reign genes in Pichia
pastoris[ J] .Bio technolog y (N Y), 1993 , 11(8):905-
910.
[ 6] 　La Vallie E R , McCoy J M , Smith D B , et al.Enzyma tic
and chemical cleavage of fusion pro teins[ J] .Cur r P ro-
toc Mol Biol , 2001 , 16:16-20.
[ 7] 　La Vallie E R , DiBlasio E A , Kovacic S , et al.A thio re-
doxin gene fusion expre ssion sy stem that circumvents
inclusion body fo rmation in the E.coli cytoplasm[ J] .
Biotechno log y , 1993 , 11:187-193.
[ 8] 　Sav ithri H S , Light A.Retention of enzyma tic activ ity
of bovine ente rokinase after a limited reduction o f di-
sulfide bonds [ J] .Biochem Biophy s Res Commun ,
1980 , 94:360-365.
[ 9] 　Zhu J , Gao F , Yi Y , et al.P rog ress on antimicrobial
peptides[ J] .Chin Bulletin Life Sci , 2008 , 20(4):605-
610.
[ 10] 　靳慧君 , 仲　飞 , 吴凌娟 , 等.犬 β 防御素-1 真核表达
载体的构建及其在 HEK293T 细胞中的表达[ J] .动
物学报 , 2008 , 54(5):897-902.
[ 11] 　解　民 ,仲　飞 , 吴凌娟 , 等.重组猪 β 防御素 2 在毕
赤酵母中的表达及其鉴定[ J] .中国兽医学报 , 2010 ,
30(8):1028-1031.
(上接 714页)
　　 抑菌活性部位的筛选[ J] .中兽医学杂志 , 2009(增
刊):47-50.
[ 15] 　王开金 ,张颖君 , 杨崇仁.蓼属植物的化学成分与生物
活性研究进展[ J] .天然产物研究与开发 , 2006 , 18:
151-164.
[ 16] 　王志玉 ,许　斌 , 宋艳艳 , 等.大黄乙醇提取物的体外
抗新城疫病毒作用[ J] .山东医科大学学报 , 2002 , 40
(1):26-28.
[ 17] 　Chang J S , Liu H W , Wang K C , et al.Ethanol ex-
tract o f Polygonum cuspidatum inhibits hepatitis B
virus in a stable HBV-producing cell line[ J] .Antivi-
ral Res , 2005 , 66:29-34.
[ 18] 　Song J H , Kim S K , Chan K W , et al.I n vitro inhibi-
tory effects of Polygonum cuspidatum on bacterial
viability and virulence facto rs o f S treptococcus mu-
tans and S treptococcus sobrinus[ J] .Arch O ral Biol ,
2006 , 51:1131-1140.
[ 19] 　Zhong Y , Yoshinaka Y , Takeda T , et al.Highly po tent
anti-H IV-1 activity isola ted f rom fe rmented Polygo-
num tinctorium Aiton[ J] .Antiv ir al Res , 2005 , 66:
119-128.
[ 20] 　党双锁 ,张正国 , 张　欣 ,等.大黄素 、黄芪多糖在体外
对乙型肝炎病毒的抑制作用[ J] .西安交通大学学
报:医学版 , 2005 , 28(5):521-525.
[ 21] 　Buchetti B , Paziani A S , Alisi A , et al.Emodin inhibits
cell invasiv eness induced by HCV[ J] .Oral Commun/
European J Int Med , 2008 , 19:42.
[ 22] 　H o T Y , Wu S L , Chen J C , et al.Emodin blocks the
SARS co ronavirus spike protein and angio tensin-con-
ve rting enzyme 2 inte raction[ J] .Antiviral Res , 2007 ,
74:92-101.
[ 23] 　Junko K , Yu N , Izumi M , e t al.Co rrelation between
reduction po tentia ls and inhibitions of Epstein-Barr
v ir us activ ation by anthraquinone deriv ative s [ J] .
Bioorg anic Med Chem Le tt , 2008 , 18:4106-4109.
[ 24] 　Junko K , Mune taka I , Izumi M , et a l.Cor relation be-
tw een reduction po tentials and inhibitory effects on
Epstein-Bar r virus ac tivation by emodin derivatives
[ J] .Cancer Lett , 2006 , 241:263-267.
719　中 国 兽 医 学 报　2011 年 5 月　第 31卷　第 5期　Chin J Vet Sci　M ay 2011 　Vol.31 　No.5