全 文 ：中兽医医药杂志 JTCVM 2005年第 2期
调查研究
石香薷挥发油体外抗病毒作用研究
葛　冰 ,卢向阳 ,蒋红梅 ,方　俊 ,莫　瑾 ,谢馥交
(湖南农业大学生化与发酵工程实验室 , 湖南长沙　410128)
　　摘　要:　采用有机溶剂法提取了石香薷挥发油 , 采用体外细胞培养的方法研究石香薷挥发油对新城疫病毒
(NDV)感染的拮抗作用 ,测定其对鸡胚成纤维细胞的最大无毒浓度(TD
0
)、半数细胞中毒浓度(TD
50
)、抑制 50%
细胞病变的药物浓度( IC50)、治疗指数(T I)及体外抗 NDV效果。 试验结果表明:石香薷挥发油的 TD 0、 TD50、
IC50 、T I分别为 1.56 g /l、3.13 g /l、0.20 g /l、15.65, 石香薷挥发油 0.79 g /l对 NDV所致的 CPE有明显的抑制作
用 , 证明石香薷挥发油具有明显的抗 NDV作用 , 提示石香薷挥发油可以作为一种新的抗 NDV感染的药物。
　　关键词:　石香薷挥发油;新城疫病毒;体外抗病毒作用
　　中图分类号:S852. 65　　　　　文献标识码:A　 　文章编号:1000 - 6354(2005)02 - 0003 - 03
　　新城疫是对养鸡业造成严重危害的病毒病 , 目前疫苗免
疫尚不完善 ,抗病毒化学药物对本病效果不显著 , 至今尚无
有效治疗药物 [ 1] 。从植物中发现天然抗病毒有效活性成分
是开发高效低毒的抗病毒药物的重要途径。
石香薷 ,又名华荠苧(MCM), 全草具有祛暑 、活血理气 、
化湿止痛等功效 , 可用于治疗暑热感冒 、腹痛泄泻 [ 2]等。曾
有研究证明 ,石香薷挥发油具有广谱抗菌作用 , 有提高实验
动物免疫应答力 [ 3]和体内外抗病毒 [ 4]作用。笔者旨在研究
石香薷挥发油对新城疫病毒的抑制作用 ,已取得了较好的效
果 ,现报道如下 。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　试剂　细胞生长液:RPM I1640, 内含 10%新生犊牛
血清;细胞维持液:除含 2%新生犊牛血清以外 , 余同细胞生
长液 , pH 值为 7.4。消化液为 0. 25%胰蛋白酶。
1. 1. 2　药物　石香薷购自湖南省药材公司 , 符合药典规定;
病毒唑(三氮唑核苷注射液)为山东鲁抗制药集团有限公司
产品。
1. 1. 3　病毒　鸡新城疫病毒(NDV)F48E8, 购自中国兽医药
品监察所。
1. 1. 4　仪器　RE - 52A型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器
厂);倒置显微镜(Le ica);MCO - 15AC型 CO
2
培养箱 (日本
SANYO);96孔细胞培养板(costar)。
1. 2　方法
1. 2. 1　石香薷挥发油提取及配制　按参考文献 [ 5]所介绍的
方法 ,将石香薷干品切段 、粉碎 、过筛。用石油醚提取 , 提取
液减压蒸馏得膏状物质。在粗膏中加入无水乙醇使其充分
溶解 , 然后减压蒸馏除去溶剂得到精制浸膏。将无水乙醇加
入浸膏中 , 减压蒸馏除去乙醇得到石香薷挥发油 , 称重 , 并
计算萃取率。然后称取一定量的石香薷挥发油 , 加少量吐温
- 80乳化 ,配制 200 g /l的溶液备用。
收稿日期:2004 - 10 -12
作者简介:葛　冰(1977 - ),男 ,硕士生 ,主要从事天然产物开发利用
研究。
1. 2. 2　鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 [ 6]　选 9 ～ 11日龄鸡
胚 ,用碘酊消毒蛋壳后打开 , 取出鸡胚 , 剪去头 、爪和内脏 , 用
H ank′s液清洗 3次 ,剪碎 。加入 0. 25%胰蛋白酶溶液 3 m l,
37 ℃消化 8 m in, 800 r /m in离心 10 m in。去上清 , 沉淀加适
量细胞生长液稀释 , 四层纱布过滤 ,细胞计数。以 2×106 /m l
的细胞悬液接种于细胞培养板 , 每孔 200 μl, 置 37 ℃、 5%
CO
2
培养箱培养 24 h。
1. 2. 3　病毒滴定 [ 7]　将病毒悬液用 1640培养液作 10倍梯
度稀释 ,放入冰箱冷藏。 在 96孔微量培养板中加入鸡胚成
纤维细胞(2×105)100 μl, 37 ℃、 5% CO 2培养 24 h, 生长
成单层细胞。将微量培养板的培养液倾去 , 倒扣在消毒的
滤纸上 , 使残留培养液流尽。每个病毒稀释度接种 4孔 ,
每孔 100 μl, 摇匀 , 37 ℃吸附 1 h, 弃去病毒液 , 在消毒滤
纸上控干。用 H ank′s液洗 3次 , 最后一次控干 , 加维持液 ,
每孔 100 μl, 置 5% CO2孵箱培养 。每天在倒置显微镜下
检查 , 以最高稀释度不再出现新病变作为终点 。用 Reed
andM uench法计算组织培养半数感染量 (TC ID50)。
1. 2. 4　药物毒性的测定 [ 8]　采用形态法。在 96孔微量培
养板中加入鸡胚成纤维细胞(2×105)100 μl, 37 ℃、5% CO
2
培养 24 h,生长成单层细胞。将石香薷挥发油用维持液作倍
比稀释 , 使其终浓度为:100 g /l、 50 g /l、 25 g /l、 12. 5 g /l、
6.25 g /l、 3.12 g /l、1.56 g /l、0. 78 g /l、0. 39 g /l。病毒唑用维
持液稀释为 10. 0 g /l、 5. 0 g /l、 2. 5 g /l、 1. 25 g /l、 0.62 g /l、
0.31 g /l、0.16 g /l。弃生长液 ,控干 , 再分别加入不同稀释度
的药物 -细胞维持液 100 μl, 每个浓度 3孔 , 37 ℃继续培养
(5% CO2温箱孵育)。每天在倒置显微镜下观察细胞形态 ,
以 “ +”号表示发生形态变化细胞之百分率 , +为 25%以下 ,
++为 25% ～ 50%, +++为 50% ～ 75%, ++++为 75%
以上。以 ++为终点 , 计算各个稀释度之毒性细胞发生率 。
再按 Reed andM uench法计算半数细胞中毒浓度(TD50)和最
大无毒浓度(TD0)。
1. 2. 5　药物抗病毒活性的测定 [ 8]　采用细胞病变法 (cy to-
pa th ic e ffec t, CPE)。在 96孔微量培养板中加入鸡胚成纤维
细胞(2×105)100 μl, 37 ℃、5% CO 2培养 24 h, 生长成单层
3
DOI牶牨牥牣牨牫牳牪牫牤j牣cnki牣j tcvm牣牪牥牥牭牣牥牪牣牥牥牨
2005年第 2期
调查研究 中兽医医药杂志 JTCVM
细胞。弃生长液 ,控干。用 100倍 TCID50病毒悬液感染宿主
细胞(100μl), 37℃吸附 1 ～ 2 h,弃病毒液 ,再加含有不同浓
度药物的维持液 100μl,每个浓度 3孔 , 37 ℃继续培养(5%
CO2温箱孵育)。另设正常细胞对照 、药物病毒对照 、病毒对
照 、吐温 -80对照及病毒 TC ID50滴定。每天在倒置显微镜下
检查及记录细胞病变 ,直到病毒对照孔(不加药物)出现 4个
加号的细胞病变时为实验终点。用 Reed andM uench法计算
抑制 50%细胞病变的药物浓度( IC50)。
1. 2. 6　药物体外抑制 NDV分组试验 [ 9]　取长成单层的鸡
胚成纤维细胞进行分组试验。 Ⅰ组:预防性给药 ,即感染前
24 h, 每孔加入 100 μl含药物的维持液;吸出药液 , 用 H ank′s
液洗 3次 ,然后每孔加入 100 μl NDV液。 Ⅱ组:感染后给
药 , 即先在细胞单层中每孔加入 100 μl NDV液 , 置 37 ℃吸
附 2 h,弃病毒液 , 用 H ank′s液洗 3次 , 每孔加含药物维持
液 100 μl。 Ⅲ组:等量的药物与 NDV液同时加入细胞单
层。 Ⅳ组:等量的药物与 NDV液混合后置 37 ℃作用 2 h,
再加入细胞单层 。以上各组均设细胞对照 、药物对照和病
毒对照 ,每对照设 4个重复孔 , 所用 NDV液的终剂量为 100
TC ID50 ,各药物的终浓度为 1 /2 TD0和 1 /4 TD0 , 每浓度均设
4个重复孔 。
2　结果与分析
2. 1　石香薷挥发油提取率
石香薷挥发油的提取率为 2. 0%。
2. 2　半数感染量测定结果
测定所得鸡新城疫病毒 (NDV)的 TC ID50为 10- 5.6 /0.1
m l(Reed andM uench法计)。
2. 3　药物细胞毒性及抗病毒活性( IC50)测定结果
石香薷挥发油 3.12 g /l以上浓度均出现细胞脱落 、变圆
等中毒现象 ,病毒唑在 10 g /l时引起细胞大面积固缩 、脱落
等中毒表现 , 5 g /l组中毒现象略轻 。石香薷挥发油和病毒
唑的细胞毒性及抗病毒活性测定结果见表 1。
表 1　药物细胞毒性及抗病毒活性( IC50)测定结果
　药　物 TD0 /g l- 1 TD 50 /g l- 1 IC50 /g l- 1 T I
石香薷挥发油 1. 56 3. 13 0. 20 15. 65
病毒唑 2. 00 4. 00 0. 50 8
　　注:TI=TD
50
/IC
50
。
2. 4　药物体外抑制 NDV分组试验结果
正常的鸡胚成纤维细胞单层完整 , 细胞形态呈良好的星
形 、梭形 , 排列规则 ,细胞内颗粒物少(见图 1)。 Ⅰ组和 Ⅲ组
两个浓度抑制细胞病变作用均较弱 , 其中 1 /2 TD0浓度细胞
死亡 、变圆 , 仅可见少数梭形细胞 (见图 2和图 4);Ⅱ组和Ⅳ
组石香薷挥发油 1 /2TD0浓度完全抑制细胞病变 , 细胞单层
完整 ,大部分细胞呈正常的梭形 (见图 3和图 5), 1 /4TD
0
浓
度明显抑制细胞病变 ,但有少数细胞死亡 、脱落 、变圆。病毒
对照组细胞单层崩解 、脱落 、形成合胞体(见图 6)。 4个试验
组抗病毒效果均比病毒唑显著增强 , 观察结果详见表 2。
图 1　正常细胞对照组(10×10)
图 2　抗病毒试验Ⅰ组(10×10)
图 3　抗病毒试验Ⅱ组(10×10)
图 4　抗病毒试验Ⅲ组(10×10)
图 5　抗病毒试验Ⅳ组(10×10)
4
中兽医医药杂志 JTCVM 2005年第 2期
调查研究
图 6　病毒对照组(10×10)
表 2　药物体外抑制 NDV分组试验结果
药物
名称
Ⅰ
1 /2 1 /4
Ⅱ
1 /2 1 /4
Ⅲ
1 /2 1 /4
Ⅳ
1 /2 1 /4
病毒
对照
细胞
对照
药物
对照
石香薷
挥发油 + ++ - - + + - - ++++ - -
病毒唑 +++++ - + +++++ - - ++++ - -
　　注:-表示无细胞病变 , +～ ++++表示不同程度的细胞病
变。 1 /2代表 1 /2 TD0 浓度 , 1 /4代表 1 /4 TD0 浓度。
3　小结
病毒的致病作用分体内( in vivo)与体外( in vitro)致病作
用两部分。体内致病作用即病毒感染机体使之产生各类疾
病 ,体外致病作用即病毒对培养细胞的致病变效应。与之相
对应 ,研究抗病毒药物是否有效往往从这两方面下手。体外
细胞实验具有简便 、迅速 、价廉和受非特异性因素影响较小
等优点。
该实验结果表明 ,石香薷挥发油 0.7g /l和 0. 39 g /l剂量
组均有抗 NDV作用 , 且作用均强于 1.0 g /l的病毒唑。 Ⅱ 、
Ⅳ组抗病毒作用组比 I、Ⅲ组显著 ,提示石香薷挥发油体外抗
病毒机制可能是通过直接灭活病毒及进入细胞内影响病毒
的繁殖而发挥抗病毒作用 , 而且其抗病毒效果在安全剂量范
围内 ,并随着药物浓度的增加而增加。严银芳等 [ 3]研究表
明 ,石香薷挥发油具有体内外抗流感 A3型病毒活性 , 流感
A3型病毒属正黏病毒科的 RNA病毒 ,而 NDV属于负黏病毒
科 RNA病毒 , 提示石香薷挥发油具有广谱的抗病毒作用。
石香薷为常用中药 , 是我国药典收载的正品香薷之一 。
临床广泛应用于治疗暑湿感冒 、恶寒发热 、腹痛吐泻 、小便不
利 、风湿关节痛等疾病。本实验用石油醚提取 , 后经乙醇纯
化 ,挥发去掉乙醇 , 再用少量吐温— 80乳化后配制成溶液 。
主要成分经检验含有单萜烯类 、倍萜烯类及其含氧化物和酚
类如百里香酚 、香荆芥酚等。据报道石香薷挥发油的抗菌成
分是百里香酚和香荆芥酚 , 国内外均未对石香薷挥发油的抗
病毒有效成分进行追踪研究 [ 10] 。究竟何种成分起作用及其
含量 、作用机制等 ,还有待于进一步研究。
参考文献:
[ 1] 王学林 ,刘文森 ,王承宇. 五种中草药抗鸡新城疫病毒作
用研究 [ J] . 中兽医医药杂志 , 2003(5):5 ～ 8.
[ 2] 葛　冰 , 卢向阳 ,蒋红梅 , 等. 石香薷研究概况 [ J] . 中药
材 , 2004, 27(4):302 ～ 305.
[ 3] 刘　静 ,黄　鹤 ,陈　殊. 石香薷挥发油抑菌和免疫应答
作用 [ J] . 中南民族学院学报 (自然科学版 ), 1996, 15
(4):52 ～ 55.
[ 4] 严银芳 , 陈　晓 ,杨小清 , 等.石香薷挥发油对流感 A3病
毒的抑制作用 [ J] . 微生物学杂志 , 2002, 22(1):32 ～ 34.
[ 5] 肖崇厚. 中药化学 [M ] . 上海:上海科学技术出版社 ,
1997, 93 ～ 103.
[ 6] 薛庆善. 体外培养的原理与技术 [ M ] . 北京:科学出版
社 , 2001, 448 ～ 449.
[ 7] 殷　震 , 刘景华. 动物病毒学 [M ] . 北京:科学出版社 ,
1997, 329 ～ 331.
[ 8] 张均田. 现代药理实验方法 [M ] . 北京:北京医科大学中
国协和医科大学联合出版社 , 1998, 1430 ～ 1449.
[ 9] 罗　军 , 陈安慎 , 杨占秋 , 等. 中药大黄抗单纯疱疹病毒
作用的实验研究 [ J] . 中华传染病杂志 , 1991, 9(3):150
～ 153.
[ 10] 严银芳 , 陈　晓 , 杨小清 , 等. 石香薷挥发油抗流感病毒
活性成分的初步研究 [ J] . 青岛大学医学院学报 , 2002,
38(2):155 ～ 157.
Antiv iral effect of volatile o il fromMosla ChinensisMaxmi on NDV in v itro
GE Bing, LU Xiang - yang, JIANG Hong -m e i, FANG Jun, MO Jin, X IE Fu - jiao
(Labo ra to ry o f B iochem istry＆ Fe rmenta tion Enginee ring, H unan Agricultural University, ChangshaH unan 1410128, Ch ina)
Abstac t:Vo latile oilw as ex tracted from Mosla ChinensisM axim w ith petro leum ethe r, and ce ll culturew as utilized to inve sti-
gate the anti-NDV e ffect o f vola tile o il from Mosla ChinensisM axim. I ts TD0 , TD50 , IC50 , T I and antiv ira l effec t in vitro to ch ick
em bryo fibrobast(CEF) w ere tested. The results show ed tha t the TD0 , TD50 , IC50 and T I of vo latile oil o fMosla ChinensisM ax im
was 1. 56 g /l, 3. 13 g /l, 0. 20 g /l and 15. 65. Its inhib ition effect on CPE caused by NDV w as obvious a t the do se o f 0. 79 g /.l
This proved vo la tile o il ofMosla Ch inensisM ax im had obv ious an ti -NDV e ffec.t The re fo re, it is a prom ising drug o f anti -NDV in-
fec tion.
Key words:vo la tile o il o fMosla ChinensisM ax im ;NDV;antiv iral e ffect in vitro
5