全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 12 期 2011 年 12 月

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硫酸化人参皂苷体外抗新城疫病毒作用
高 焕，韩立秋，胡 林，张亚宁，王德云*
南京农业大学 中兽医学研究室，江苏 南京 210095
摘 要：目的 观察硫酸化人参皂苷（sGS）抗新城疫病毒的活性。方法 采用氯磺酸-吡啶法制备 sGS，红外光谱仪对 sGS
结构进行分析，MTT 法检测硫酸化修饰前后人参皂苷（GS）预先给药、接种病毒后给药、与病毒同时给药 3 种不同给药方
式的抗新城疫病毒活性。结果 硫酸化修饰后人参皂苷在 1 144、807 cm−1 有 2 个特征吸收峰，表明硫酸基已经和糖链结合
成酯。预先给药或病毒接种后给药，加入一定质量浓度范围内的 GS 和 sGS 的 CEF 培养液的 A570值均显著大于未给药的病
毒组（P＜0.05），且 GS 与 sGS 的抗病毒活性无显著差异（P＞0.05）；GS 和 sGS 与病毒同时给药，两药在一定质量浓度范
围内的 A570 值也均显著大于未给药的病毒组（P＜0.05），且 sGS 的最大病毒抑制率显著高于 GS。结论 GS 经硫酸化修饰
后可提高其抗新城疫病毒活性，主要表现为提高其直接杀灭病毒的作用。
关键词：人参皂苷；硫酸化人参皂苷；抗病毒；新城疫病毒; 氯磺酸-吡啶法
中图分类号：R282.710.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)12 - 2492 - 05
Antiviral activity of sulfated ginsenoside on Newcastle disease virus in vitro
GAO Huan, HAN Li-qiu, HU Lin, ZHANG Ya-ning, WANG De-yun
Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Objective In order to observe the antiviral activity of sulfated ginsenoside (sGS) on Newcastle disease virus (NDV).
Methods sGS was prepared by cholorsulfonic acid-pyridine method and the structure of sGS was analyzed by FTIR spectra. Then, the
antiviral activity of ginsenosides (GS) and sGS was determined with MTT by three modes. Results The results showed that two
characteristic absorptive peak presented at 1 144 and 807 cm−1, respectively, which proved that the sulfated group had linked with
polysaccharide to form sulfate ester. In pre-adding drug and post-adding drug modes: the A570 values of GS and sGS in CEF culture
medium were significantly higher than those of virus control at some concentration (P<0.05), but it was not significant difference
between GS and sGS (P>0.05). In simultaneous adding drug and NDV, the A570 values of GS and sGS were significantly higher than
those of virus control at some concentration (P<0.05) and the maximum virus inhibitory rate of sGS was significantly higher than that
of GS. Conclusion The antiviral activity of GS on NDV could be improved with sulfation, which appears to improve the effect on
directly killing the virus.
Key words: ginsenoside (GS); sulfated ginsenoside (sGS); antivirus; Newcastle disease virus (NDV); cholorsulfonic acid-pyridine method

皂苷主要由糖链和苷元组成，糖链在皂苷的结
构中占重要位置，且是皂苷发挥生物活性的主要单
元[1]，对皂苷进行硫酸化修饰可提高其生物活性。
人参皂苷（GS）是人参属植物的主要有效成分，具
有抗肿瘤、增强免疫功能、调血脂和抗动脉硬化等
作用[2-5]，且 GS 经过硫酸化修饰后其抗病毒（如抗
马立克病毒等）作用有所增强[6]，但硫酸化人参皂
苷（sGS）抗新城疫病毒的研究鲜见报道。本实验
对 GS 进行硫酸化修饰，并检测了 sGS 体外抗新城
疫病毒的作用，旨在筛选出作用较强的抗新城疫病
毒药物。
1 材料
1.1 药品与主要试剂
GS 购自宁波金艾农生物科技有限公司，质量分
数 86%；极限必需培养基（MEM 培养基），Invitrogen
Corporation 公司产品，按说明书配制，加入小牛血
清（杭州四季青生物工程有限公司产品）达 5%为
细胞生长液，2%为细胞维持液，加入青霉素、链霉

收稿日期：2011-06-07
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30901085）；教育部科学技术重点项目（108153）
作者简介：高 焕（1986—），女，硕士研究生，主要从事中药药理学研究。
*通讯作者 王德云 Tel: (025)84395203 E-mail: dywang@njau.edu.cn
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素各 100 U/mL；胰蛋白酶，用 PBS（pH 7.4）配制
成 0.25%的溶液，0.22 μm 微孔滤膜滤过除菌，分装，
−20 ℃保存备用；MTT 溶液，用 pH 值为 7.4 的 PBS
溶解成 5 mg/mL，0.22 μm 微孔滤膜滤过除菌，分
装，4 ℃避光保存（1 个月内用完）；裂解液，二甲
亚砜（DMSO），天津科密欧化学试剂公司；氯磺酸，
分析纯，上海金山亭新化工试剂厂；吡啶，西陇化
工股份有限公司；95%乙醇，氢氧化钠（NaOH）等
均为分析纯。
1.2 仪器
JAC—500 型超声处理器，济宁奥波超声电器
有限公司；754 紫外分光光度计，上海精密科学仪
器有限公司；CO2 培养箱，美国 Revco 公司；TS100
型倒置显微镜，Nikon 公司；RT—6000 型酶标分析
仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司；透析袋，上
海绿鸟科技发展有限公司。
1.3 病毒
新城疫 IV 系弱毒苗（Lasota 株），中牧股份南
京药械厂，批号 0301485。
2 方法
2.1 sGS 制备
采用氯磺酸-吡啶法[7]制备 sGS。将带有搅拌装
置和冷凝装置的三颈烧瓶置盐水冰浴中，加入预冷
的无水吡啶 30 mL，剧烈搅拌，使之充分冷却，逐
滴加入 10 mL 氯磺酸，于 40 min 内加完，待烧瓶中
出现大量淡黄色固体时终止反应，即得酯化试剂。
精确称取待修饰的 GS 200 mg，加入盛有酯化试剂
烧瓶中，40 ℃水浴中搅拌反应 1.5 h 后冷却至室温，
反应液加入 100 mL 预冷的冰水中，用饱和 NaOH
溶液中和至 pH 7.5，再加入 3 倍体积的无水乙醇，
静置 24 h。取沉淀用自来水透析 3 d、蒸馏水透析 1
d，透析液冷冻干燥，得 sGS。所得 sGS 用红外光
谱法进行结构分析，采用常规 KBr 混合压片法，测
定范围 4 000～400 cm−1。
2.2 病毒处理
按 Reed-Muench 法[8]测定病毒对培养的鸡胚成
纤维细胞（CEF）的半数组织培养感染剂量（TCID50）
为 1×10−5。临用前用细胞维持液将病毒稀释成 1×
10−3（100 TCID50）。
2.3 CEF 培养
取 10 日龄鸡胚（中牧股份南京药械厂提供），
用碘酊消毒蛋壳气室部，打开，取出鸡胚置于培养
皿中，去头、爪、翅和内脏，用 Hank′s 液冲洗 3 遍，
洗去血液，置 25 mL 烧杯内剪成 1 mm3左右的碎块，
再用 Hank′s 液洗 3 遍，加 3～5 倍量的 0.25%胰蛋
白酶溶液，置 38.5 ℃消化，隔 10 min 轻轻振摇 1
次，至组织块变得疏松、表面发毛后取出，静置 1～
2 min 后吸去上层胰蛋白酶液，加入 Hank′s 液洗涤
3 遍，再加入生长液，以吸管吹打数次使细胞悬浮，
静置 1～2 min 使组织块下沉，轻轻吸取细胞悬液，
重复悬浮和收集多次，合并细胞悬液，用 3 层灭菌
纱布滤过，细胞染色计数后将细胞数调至 1×
106/mL，加入 96 孔细胞培养板，每孔 100 μL，于
38.5 ℃、5% CO2 条件下培养。
2.4 最大安全质量浓度测定
将 GS 和 sGS 用 2% MEM 溶液分别自 2 mg/mL
倍比稀释至 11 个质量浓度。待 CEF 长成单层时，
弃去细胞培养液，加入 GS 和 sGS，100 μL/孔，每
个质量浓度重复 4 孔，同时设不加药液的细胞对照
孔和空白调零孔。加药后每隔 12 h 观察 1 次细胞单
层完好程度，继续培养 72 h 后，按 MTT 法[9]、用
酶联免疫检测仪测定 570 nm 波长处吸光值（A570
值）。当 GS 和 sGS 组的 A570 值显著大于对照组时，
表明 2 个样品显著促进细胞生长。选择 A570 值不显
著小于对照组的所需 GS、sGS 的最大质量浓度作为
它们的最大安全质量浓度。
2.5 sGS 和 GS 体外抗新城疫病毒作用
根据最大安全质量浓度测定结果，将GS和 sGS
用 2% MEM 液自 62.5 μg/mL 倍比稀释至 3.91
μg/mL，共 5 个质量浓度（62.5、31.25、15.63、7.81、
3.91 μg/mL）进行测定。同法培养 CEF，待 CEF 长
成致密单层后，倒掉培养板孔内液体，用维持液洗
3 次。实验组分别以 3 种给药方式加入各质量浓度
GS、sGS，以及新城疫病毒：预先给药后接种病毒，
待细胞长成单层后，倒掉孔内液体，用维持液洗 3
次，每孔加入不同质量浓度的药液 100 μL，培养 4 h
后弃液体，加入病毒液 100 μL；先接种病毒后给药，
待细胞长成致密单层后，倒掉孔内液体，用维持液
洗 3 次，每孔加入病毒液 100 μL，培养 2 h 后倒掉
孔内液体，加入不同质量浓度的药液 100 μL；药物
和病毒同时加入，将病毒液分别加入到不同质量浓
度的药液中，4 ℃作用 2 h 后，再接种到已长成单
层的 CEF 中，每孔 100 μL。病毒组用的病毒液同条
件放置 2 h。以上每种质量浓度药液重复 4 孔。
实验设给药组、病毒组（只加病毒）、对照组（细
胞只加维持液）和无细胞的空白调零孔。各组细胞
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38.5 ℃、5% CO2 箱继续培养 72 h 测定细胞活性。
当 GS 和 sGS 组的 A570值显著大于病毒组时，表明
GS 和 sGS 均显著抑制新城疫病毒感染 CEF。计算
最大病毒抑制率[10]。
最大病毒抑制率＝（A 最高药物+病毒－A 病毒）/（A 对照－A 病毒）
当 sGS组的最大病毒抑制率显著大于GS组时，
表明 sGS 的抗病毒效果较好。
2.6 数据分析
数据以 ±x s 表示，采用 SPSS 16.0 软件进行
Duncan 多重分析，比较 GS 和 sGS 对 CEF 的安全
质量浓度，以及对 CEF 生长的影响和抵抗新城疫病
毒感染 CEF 的影响。两药最大病毒抑制率均数比较
用 t 检验。
3 结果
3.1 红外光谱分析
从GS红外光谱（图1-A）可以看出，在3 392 cm−1
处有强的吸收，显示有 O-H 伸缩振动的特征峰；在
2 939 cm−1处为-CH2的C-H伸缩振动；在1 456、1 387
cm−1处有弱的吸收，显示有-CH3伸缩振动，在 896～
1 078 cm−1处的强吸收是 C-O-C（糖环）的伸缩振动，
这些都说明是 GS 的结构。sGS 红外光谱（图 1-B）
显示，除了 GS 特征吸收峰得以保留外，还出现两个
特征吸收峰，一个在 1 144 cm−1处，其为 OSO3−的
S＝O 伸缩振动；另一个在 807 cm−1处，其为 C-O-S
的拉伸振动，这些是硫酸键的特征吸收峰。红外光
谱检测结果提示 GS 已形成硫酸酯。

图 1 GS（A）和 sGS（B）的红外光谱图
Fig. 1 IR spectra of GS (A) and sGS (B)
3.2 对 CEF 生长的影响和最大安全质量浓度
由表 1 可知，GS 在 1 000～500 μg/mL 时的 A570
值均显著小于对照组（P＜0.05），而在其他质量浓
度与对照组的差异不显著（P＞0.05）。sGS 在 1 000～
125 μg/mL 时的 A570 值均显著小于对照（P＜0.05），
而在其他质量浓度与对照的差异不显著（P＞0.05）。
GS 在 250 μg/mL 时的 A570 值与对照组差异不显著
（P＞0.05），sGS 在 62.5 μg/mL 时的 A570 值与对照
组差异不显著（P＞0.05），因此将 250、62.5 μg/mL
分别定为 GS、sGS 的最大安全质量浓度。
3.3 预先给药对新城疫病毒感染 CEF 能力的影响
GS 3.91 μg/mL、sGS 7.81 μg/mL 时的 A570 值都
显著大于病毒组（P＜0.05），说明 GS 和 sGS 在此
质量浓度时具有抑制新城疫病毒感染 CEF 的活性。
结果见表 2。GS 组、sGS 组的最大病毒抑制率分别
为 53.72%、62.81%，差异不显著（P＞0.05），说明
预先给药，sGS 未显示更强的抗病毒活性。
3.4 接种病毒后给药对新城疫病毒感染CEF能力的
影响
GS 在 15.63～3.91 μg/mL，sGS 在 62.5、3.91
μg/mL 时的 A570 值都显著大于病毒组（P＜0.05），
说明 GS 和 sGS 在此质量浓度时均能显著抑制新城
疫病毒感染 CEF。结果见表 3。GS 组、sGS 组的最
大病毒抑制率分别为 177.39%、190.43%，差异不显
著（P＞0.05），说明在加入病毒后给药，sGS 并未
显示更强的抗病毒活性。
3.5 与新城疫病毒作用后对其感染 CEF 能力的影响
sGS 在 62.5、31.25 μg/mL，GS 在 62.5 μg/mL
的 A570 值都显著大于病毒组（P＜0.05），说明 GS
与 sGS 均有一定的抗新城疫病毒作用。结果见表 4。
GS 组、sGS 组的最大病毒抑制率分别为 46.10%、
92.91%，差异显著（P＜0.05），说明在药物与病毒
作用一定时间后加入细胞中，sGS 的抗病毒活性明
显强于 GS。结果见图 2。

4 000 3 000 2 000 1 000 4 000 3 000 2 000 1 000
A B
波数 / cm−1
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表 1 GS 和 sGS 对 CEF 生长的影响 ( ± = 4,x s n )
Table 1 Effect of GS and sGS on CEF growth ( ± = 4,x s n )
组别
ρ /
(μg·mL−1)
A570值 组别
ρ /
(μg·mL−1)
A570值
GS 1 000 0.470±0.001c* sGS 1 000 0.130±0.022e*
500 0.524±0.018c* 500 0.355±0.013d*
250 0.632±0.013b 250 0.423±0.003c*
125 0.659±0.016ab 125 0.484±0.031b*
62.5 0.687±0.021ab 62.5 0.562±0.021a
31.25 0.681±0.002ab 31.25 0.542±0.007a
15.63 0.706±0.018ab 15.63 0.571±0.005a
7.81 0.686±0.041ab 7.81 0.563±0.010a
3.91 0.704±0.004ab 3.91 0.547±0.007a
1.95 0.720±0.006a 1.95 0.558±0.009a
0.98 0.740±0.022a 0.98 0.529±0.010a
对照 － 0.668±0.021ab 对照 － 0.553±0.010a
不同字母者表示差异显著（P＜0.05）；与对照组比较：*P＜0.05
下同
Different letters indicate significant differences (P<0.05); *P<0.05 vs
control group, same as below
表 2 GS 和 sGS 预先给药对新城疫病毒感染 CEF 能力的
影响 ( ± = 4,x s n )
Table 2 Effect of GS and sGS by pre-adding on CEF
infection of NDV ( ± = 4,x s n )
组别
ρ /
(μg·mL−1)
A570 值 组别
ρ /
(μg·mL−1)
A570 值
对照 － 0.251±0.008a 对照 － 0.251±0.008a
病毒 － 0.130±0.007c 病毒 － 0.130±0.007c
GS 62.5 0.144±0.013c sGS 62.5 0.124±0.022c
31.25 0.124±0.029c 31.25 0.142±0.006c
15.63 0.109±0.009c 15.63 0.127±0.010c
7.81 0.122±0.019c 7.81 0.206±0.006b△
3.91 0.195±0.013b△ 3.91 0.120±0.006c
与病毒对照组比较：△P＜0.05；下同
△P<0.05 vs viral control group, same as below
4 讨论
在常用的硫酸化方法中，与浓硫酸法和三氧化
硫-吡啶法相比，氯磺酸-吡啶法反应条件相对简单、
产物回收方便、回收率和取代度均较理想，故本实
验采用氯磺酸-吡啶法对 GS 进行硫酸化修饰。通过
红外光谱法对修饰的 sGS 进行结构分析，发现光谱
中显示出两个特征性的吸收峰，一个在 1 144 cm−1处，
表明为 OSO3−的 S＝O 伸缩振动，另一个在 807 cm−1
处，表明为 C-O-S 的拉伸振动，这些均提示为硫酸
表 3 GS 和 sGS 在接种病毒后给药对新城疫病毒感染 CEF
能力的影响 ( ± = 4,x s n )
Table 3 Effect of GS and sGS by post-adding after virus
inoculated on CEF infection of NDV ( ± = 4,x s n )
组别
ρ /
(μg·mL−1)
A570 值 组别
ρ /
(μg·mL−1)
A570 值
对照 － 0.265±0.014b 对照 － 0.265±0.014b
病毒 － 0.150±0.023d 病毒 － 0.150±0.023c
GS 62.5 0.156±0.013d sGS 62.5 0.354±0.016a△
31.25 0.200±0.005cd 31.25 0.159±0.011c
15.63 0.218±0.022bc△ 15.63 0.211±0.007bc
7.81 0.227±0.016bc△ 7.81 0.203±0.032bc
3.91 0.369±0.010a△ 3.91 0.258±0.016b△
表 4 GS和 sGS与病毒作用后对新城疫病毒感染CEF能力的
影响 ( ± = 4,x s n )
Table 4 Effect of GS and sGS mixed adding with virus
on CEF infection of NDV ( ± = 4,x s n )
组别
ρ/
(μg·mL−1)
A570 值 组别
ρ/
(μg·mL−1)
A570 值
对照 － 0.301±0.010a 对照 － 0.301±0.010a
病毒 － 0.160±0.009cd 病毒 － 0.160±0.009c
GS 62.5 0.225±0.027b△ sGS 62.5 0.233±0.023b△
31.25 0.135±0.005c 31.25 0.291±0.008a△
15.63 0.170±0.005c 15.63 0.127±0.006d
7.81 0.156±0.013c 7.81 0.120±0.004d
3.91 0.165±0.032c 3.91 0.202±0.009bc


图 2 与新城疫病毒作用后对其感染 CEF 能力的最大抑制率
Fig. 2 Maximum inhibitory rate on CEF infection of NDV
键的特征吸收峰，表明已形成硫酸酯，证明采用氯
磺酸-吡啶法对人参皂苷进行硫酸化修饰方法可行。
比较 GS 硫酸化修饰前后对 CEF 生长的影响
（即最大安全质量浓度）可以看出，GS 小于 250

100
80
60
40
20
0
最
大
抑
制
率
/%

GS sGS
与 GS 组比较：*P＜0.05
*P<0.05 vs virus group
*
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μg/mL 的各质量浓度的 A570 值与对照组的差异不显
著，表明这些质量浓度 GS 对 CEF 是安全的；而 sGS
小于 62.5 μg/mL的各质量浓度A570值与对照差异不
显著，表明在这些质量浓度 sGS 对 CEF 也是安全
的。提示 GS 经过硫酸化修饰后毒性增加，这与以
前的报道一致[11-12]。
本实验采用 3 种给药方式观察 GS与 sGS 的抗
新城疫病毒作用。结果表明，给药后接种病毒，
GS 和 sGS在一定质量浓度范围内的 A570值均显著
大于病毒组（P＜0.05），表明 GS 硫酸化前后均有
一定的抗新城疫病毒作用，两药效果差异不明显；
先接种病毒后加药物，GS 和 sGS 在一定质量浓度
范围内的 A570 值也均显著大于病毒组（P＜0.05），
表明 GS 硫酸化修饰前后均有一定的抗新城疫病
毒作用，两药效果差异也不明显，且 3.91～62.5
μg/mL sGS 的抗病毒效果均弱于 GS，可能是由于
GS 经硫酸化修饰后毒性增加，性效比降低的缘
故；药物与病毒作用后同时加入细胞，GS 和 sGS
在一定质量浓度范围内的 A570 值也均显著大于病
毒组（P＜0.05），表明 GS 硫酸化修饰前后均有一
定的抗新城疫病毒作用，而 sGS 的抗病毒效果显
著优于 GS，证明硫酸化修饰能增强人参皂苷的抗
病毒活性，与本研究室曾经的研究证实硫酸化修饰
能提高黄芪多糖和淫羊藿多糖的抗病毒活性[13-14]
相一致。
参考文献
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