全 文 ：2015 年 9 月
第 30 卷第 9 期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol． 30，No． 9
Sep. 2015
裸燕麦谷蛋白酶解物的纯化及其清除自由基活性研究
马萨日娜1 张美莉1 付 媛2 乌云达来1 斯琴其木格1
(内蒙古农业大学食品科学与工程学院1，呼和浩特 010018)
(内蒙古农业大学理学院2，呼和浩特 010018)
摘 要 利用碱性蛋白酶对裸燕麦谷蛋白进行酶解，采用超滤及离子交换层析对酶解物进行纯化，然
后考察各分离组分清除·OH、DPPH·能力。结果表明:超滤法分离裸燕麦谷蛋白酶解物所得的 5 个组分
中，组分Ⅰ清除·OH能力最强。其质量浓度为 3 mg /mL时清除·OH 能力高于 90%。进一步对组分Ⅰ离
子交换分离，所得的 4 个组分中，组分 D清除·OH (IC501． 532 mg /mL)、清除 DPPH·(IC501． 278 mg /mL)
能力高于其他 3 个组分。分离组分 D 为碱性氨基酸，清除·OH 与 DPPH·能力都强于裸燕麦谷蛋白酶
解物。
关键词 裸燕麦 谷蛋白 酶解 纯化 自由基
中图分类号:TS217． 1 文献标识码:A 文章编号:1003 － 0174(2015)09 － 0045 － 04
基金项目:内蒙古自然科学基金(2013MS1221) ，国家自然科学
基金(30960240) ，内蒙古自治区研究生科研创新资助
项目(B20131012911)
收稿日期:2014 － 04 － 10
作者简介:马萨日娜，女，1984 年出生，博士，农产品加工及贮藏
工程
通讯作者:张美莉，女，1966 年出生，教授，博士生导师，植物生物
活性成分的分离提取及农产品加工
具备特殊生理功能的肽类称之生物活性肽
(bioactivity peptides) ，除易消化吸收，还具有人体代
谢和生理调节功能。如提高免疫、激素调节、降血
压、降血脂、抗疲劳、抗病毒、抗氧化等作用，使其成
为国际医药界及食品界热门的研究课题和发展前景
广阔的功能因子。由于自由基攻击细胞壁和大分子
物质，引起机体病变和损伤，从而加速机体衰
老［1 － 2］。正常生理状况下，机体内产生自由基与清
除自由基处于动态平衡状态，但其机体在不良环境
或随年龄的增长，体内产生过多自由基或清除过慢。
自由基清除剂别名为抗氧化剂，能清除使体内失衡
的自由基，从而减轻机体承受的损伤。
抗氧化肽在植物蛋白中的研究较多。Chen
等［3］、荣建华［4］、徐力等［5］都从大豆蛋白中分离出
具有抗氧化活性的多肽。程云辉等［7］考察了麦胚抗
氧化肽。文献［8 － 10］对荞麦球蛋白、清蛋白及裸
燕麦球蛋白提取物进行了清除自由基研究并证实其
具有一定抗氧化活性。
燕麦蛋白被证明具有良好的营养价值和功能特
性。裸燕麦蛋白质中，除含量最高的球蛋白，谷蛋白
含量(20%～ 25%)［11］也相对较高。本试验对酶解
的裸燕麦谷蛋白进行分离纯化，研究清除·OH 和
DPPH·活性较强的肽段，以期为进一步开发利用裸
燕麦谷蛋白资源提供研究基础。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
裸燕麦，贮藏于 0 ～ 4 ℃。
732 强酸型阳离子交换树脂:江苏临海树脂有
限公司;碱性蛋白酶:诺维信(中国)生物技术有限
公司;1，1 － 二苯基 － 2 － 三硝基苯肼(DPPH·) :
Sigma公司。
1． 2 仪器与设备
紫外 －可见分光光度计:北京普析通用仪器有
限责任公司;冷冻干燥机 FD － 2、核酸蛋白层析仪:
北京博医康实验仪器公司;层析柱(2． 6 cm × 60
cm) :上海锦华层析设备厂;高速冷冻离心机
H2500Ｒ －2:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;超
滤离心管:Millipore公司。
1． 3 方法
1． 3． 1 裸燕麦谷蛋白的制备及其酶解工艺
裸燕麦经去壳、脱毛、磨粉、脱脂后，采用 Os-
borne法制备裸燕麦谷蛋白。
酶解裸燕麦谷蛋白的工艺流程如图 1 所示。
中国粮油学报 2015 年第 9 期
裸燕麦谷蛋白
↓←蒸馏水
预温(55 ℃) ，调 pH值(8． 5)
↓←碱性蛋白酶
恒温 55 ℃酶解 3 h (加入 0． 5 mol /L NaOH溶液
稳定体系 pH值 8． 5)
↓
记录消耗碱液 + 100 ℃水浴灭酶 5 min
↓
冷却(1． 0 mol /L HCl调节 pH值至蛋白等电点)
↓
10 000 × g离心 15 min
↓
上清液
图 1 裸燕麦谷蛋白酶解的工艺流程
1． 3． 2 超滤离心法分离纯化裸燕麦谷蛋白酶解物
采用截留分子质量(MWCO)分别为 30、10、5 和
3 ku的超滤管对裸燕麦谷蛋白酶解液进行分级分
离。收集所得组分Ⅰ(＞ 30 ku)、Ⅱ(10 ～ 30 ku)、Ⅲ
(5 ～ 10 ku)、Ⅳ(3 ～ 5 ku)、Ⅴ(＜ 3 ku) ，并将各组分
冻干后测其清除·OH与 DPPH·的能力。
1． 3． 3 离子交换层析纯化裸燕麦谷蛋白酶解物
1． 3． 3． 1 离子交换树脂预处理
1)用水浸泡 2 ～ 3 h，用去离子水洗至出水澄清，
除去杂质，再倾去水。
2)加入 2 倍体积 2%NaOH溶液，搅拌 4 h。
3)除去碱液，水洗至 pH 8 ～ 10．
4)加入 2 倍体积 4%盐酸溶液，搅拌 4 h。
5)除去酸液，水洗至中性，此时树脂已转为
H型。
1． 3． 3． 2 离子交换层析纯化酶解物
将超滤所得的清除自由基活性最强的组分溶
于醋酸氨缓冲液(pH 4． 5)配制成质量浓度为 24
mg /mL 的溶液。将选型后的离子交换树脂装柱
(柱尺寸:2． 6 cm × 60 cm) ，用 pH 4． 5 的醋酸氨缓
冲液平衡柱子 12 h后上样，以 0． 2 mol /L 氨水等速
(1． 0 mL /min)洗脱，并用分步收集器收集洗脱液
(4 mL /管) ，于 220 nm 下检测吸光值，将属于同一
峰的收集液混合，冻干后分析其清除·OH 与 DP-
PH·的能力。
1． 4 裸燕麦谷蛋白酶解物清除自由基活性测定
1． 4． 1 对·OH清除作用的测定
参考文献［12］方法进行测定。
1． 4． 2 对 DPPH·清除作用的测定
参考文献［13］的方法，并有所改进。
试剂配置:用无水乙醇溶解 9． 858 mg DPPH·
并定容至 25 mL棕色容量瓶中，配成 1 mmol /L的溶
液，冷藏放置，用时用无水乙醇稀释 10 倍成 0． 1
mmol /L的溶液。
方法:将 2 mL超纯水和 2 mL样品分别加入等
体积 DPPH·无水乙醇溶液(0． 1 mmol /L) ，充分荡
使其溶解于室温下反应 30 min，用分光光度计在
517 nm下测 OD 值，得到 A0和 A1。A2由 2 mL 样品
加入等体积无水乙醇测定:
清除率 =［1 －(A1 － A2)/A0］× 100%
2 结果与分析
2． 1 裸燕麦谷蛋白酶解粗提物的清除自由基能力
裸燕麦谷蛋白酶解粗提物清除·OH、DPPH·作
用如图 2所示，酶解物对 2种自由基的清除率随其终
质量浓度的增加呈二次曲线上升趋势。清除·OH、
DPPH·的 IC50分别为 3． 933、2． 318 mg /mL。
图 2 裸燕麦谷蛋白酶解物清除自由基能力
2． 2 超滤分离后各组分清除自由基活性比较
裸燕麦谷蛋白水解物经超滤获得 ＞ 30、10 ～ 30、
5 ～ 10、3 ～ 5 ku 和 ＜ 3 ku 的 5 个分子质量肽段的组
分，将这 5 种组分的蛋白质酶解物质量浓度分别调
整到 3 mg /mL测定·OH 清除率，重复 3 次，结果如
表 1 所示。从表 1 可知，分子质量 30 ku 以上的组
分Ⅰ对·OH 清除能力最强，而分子质量 ＜ 3 ku 的
肽段清除能力最弱。这与 Eun － Kyung 等［14］对厚壳
贻贝酶解物的研究结果相似，研究认为经超滤得到
分子质量 30 ku以上的组分·OH清除能力最强。
表 1 超滤分离后谷蛋白酶解物各组分的羟自由基清除活性
组分 分子质量 /ku ·OH清除率 /%
Ⅰ ＞ 30 90． 79 ± 0． 71
Ⅱ 10 ～ 30 85． 87 ± 0． 53
Ⅲ 5 ～ 10 83． 94 ± 0． 65
Ⅳ 3 ～ 5 57． 60 ± 0． 56
Ⅴ ＜ 3 15． 63 ± 0． 87
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第 30 卷第 9 期 马萨日娜等 裸燕麦谷蛋白酶解物的纯化及其清除自由基活性研究
但与一些研究者得出的分子质量 ＜ 3 ku的肽段具有
更强的·OH清除活性不同［3，8］。
2． 3 离子交换层析纯化
将超滤得到的组分Ⅰ用醋酸氨(pH 4． 5)溶解
后，上样到 732 强酸型阳离子柱进行分离，结果如图
3 所示，组分Ⅰ被进一步分离成 A、B、C 、D 4 个组
分。其中组分 A 的保留时间最短，说明不容易被阳
离子树脂吸附，表明这部分肽段组成是酸性氨基酸。
而组分 D 的保留时间最长，容易被阳离子树脂吸
附，这说明组分 D是碱性氨基酸［15］。
图 3 离子交换层析分离纯化组分Ⅰ的结果
2． 4 离子交换层析纯化后各组分清除自由基能力
比较
离子交换层析纯化后的各组分清除·OH活性的
结果如图 4所示，组分 D 的清除率最强，其清除·OH
的 IC50值为 1． 532 mg /mL，而组分 A 清除·OH 的
IC50值为 2． 399 mg /mL，组分 C 和组分 B 清除能力
不强。
图 4 离子交换纯化后各组分·OH清除能力
图 5 为各组分清除 DPPH·活性结果，组分 D
清除 DPPH·的 IC50值为 1． 278 mg /mL，而组分 A清
除 DPPH·的 IC50值为 2． 098 mg /mL，组分 D的清除
活性仍比组分 A强，组分 C和组分 B 清除能力相对
较弱。通过离子交换层析推测组分 D 是碱性氨基
酸，一般认为，碱性氨基酸比中性和酸性氨基酸具有
更强的抗氧化性。如 Chen 等［3］从大豆蛋白水解物
中分离出来的 VNPHDHQN、LLPHH、LVNPHDHQN、
LLPHHADADY 和 LNSGDALＲVPSGTTYY 等肽段。
Tsuge等［16］从蛋清水解物中分离出来的 AH、VH-
HANEN和 VHH 等肽段，都发现碱性氨基酸具有更
强的抗氧化性。
图 5 离子交换纯化后各组分 DPPH·清除能力
2． 5 裸燕麦谷蛋白酶解物、离子交换各分离组分清
除自由基能力比较
由表 2 可知，对·OH 和 DPPH·的清除作用顺
序均表现为:分离组分 D ＞分离组分 A ＞谷蛋白酶
解物。
表 2 裸燕麦谷蛋白酶解物及其分离组分的 IC50 /mg /mL
组分 ·OH DPPH·
酶解物 3． 933 2． 318
组分 A 2． 399 2． 098
组分 D 1． 532 1． 278
3 结论
3． 1 采用超滤法分离裸燕麦谷蛋白酶解物，得到组
分Ⅰ清除·OH的能力最强。其质量浓度为 3 mg /mL
的·OH 清除率达 90%。组分Ⅰ的分子质量在 30 ku
以上。
3． 2 选用强酸型阳离子树脂 732 对组分Ⅰ分离结
果显示，组分 D是碱性氨基酸，其清除·OH的能力
(IC50 1． 532 mg /mL)大于酸性组分 A(IC50 2． 399
mg /mL) ，组分 D 清除 DPPH·的能力(IC50 1． 278
mg /mL)也大于组分 A(IC50 2． 098 mg /mL)。表明碱
性组分具有较强抗氧化活性。
3． 3 通过离子交换层析纯化获得的组分 D清除·OH
与 DPPH·能力较裸燕麦谷蛋白酶解粗提物清除作用
都有大幅度提高，因此进一步明确组分 D的分子质量
大小和肽的氨基酸序列是本研究亟待深入的问题。
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Purification of Free Ｒadical Scavenging Peptides from Naked
Oats Glutelin by Enzymatic Hydrolysis
Ma Sarina1 Zhang Meili1 Fu Yuan2 Wuyundalai1 Siqinqimuge1
(College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University1，Huhehaote 010018)
(College of Sciences，Inner Mongolia Agricultural University2，Huhehaote 010018)
Abstract Naked oats glutelin has been hydrolyzed by alkaline protease in the paper． Ultrafiltration and ion －
exchange column chromatography have been utilized to isolate and purify the naked oats glutelin peptide． The results
showed that hydroxyl free radical scavenging activity of component I was the strongest among the total 5 components
detected by ultrafiltration separation process． On condition of the mass concentration of 3 mg /mL，scavenging effect a-
gainst ·OH reached a higher value of more than 90% ． Component I was further purified into 4 fractions by ion － ex-
change column chromatography． Fraction D showed a higher scavenging effect against ·OH (IC50 1． 532 mg /mL) ，
DPPH·(IC50 1． 278 mg /mL)than the other 3 fractions． Moreover，fraction D was basic amino acids，which had ex-
hibited a higher scavenging effect against hydroxyl and a better DPPH eliminating radical ability than that of the naked
oats glutelin hydrolysates．
Key words naked oats，glutelin，enzymatic hydrolysis，purification，free radical
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