全 文 ：3株茶 生柱锈重寄生木霉菌的形态鉴定及 ITS序列分析
周利 , 李 靖 , 陈玉惠＊ , 李永和　(西南林学院 ,云南昆明 650224)
摘要　[ 目的]探讨更为客观的木霉菌鉴定手段。[方法]在形态分类的基础上结合分子鉴定手段(rDNA-ITS序列分析),对 3株茶 生柱
锈重寄生木霉菌进行分类鉴定。[结果]依据 TR1的培养性状和显微特征描述 ,初步鉴定该菌株为深绿木霉(T.atroviride);TR2、TR3的培
养性状和显微特征在一定程度上相似 ,依据其形态特征 ,初步鉴定这 2个菌株为绿色木霉(T.viride Pers.ex Fr.)。从Genbank中深绿木霉
和绿色木霉的 6个菌株与 TR1、TR2、TR3所作的系统发育树可知 , TR1应该归为深绿木霉 , TR2和 TR3属同种真菌 ,应该归为绿色木霉 ,这
与形态学观察结果一致。[结论]形态特征结合 ITS序列分析可作为木霉菌分类鉴定的依据。
关键词　茶 生柱锈;木霉菌;形态特征;ITS序列分析
中图分类号　S476+.1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)15-06211-03
Morphologic Identification and ITS Sequence Analysis of 3 Hyperparasitism Trichoderma Strains on Cronartium ribicola J.C.Fischer
ZHOU Li et al　(Southwest Forestry College ,Kunming , Yunnan 650224)
Abstract　[ Objective] The study aimed to discuss the more objective means of identifying Trichoderma.[ Method] Three 3 hyperparasitism Trichoderma
strains on Cronartium ribicola J.C.Fischer were classified and identified by combining morphological classification with molecular identification means
(rDNA-ITS sequence analysis).[ Result] According to the description of culture characters and microscopic characteristics of TR1 , the strain was identified
as T.atroviride preliminarily.The culture characters and microscopic characteristics of TR2 and TR3were similar to some degree.According to their mor-
phological characters , these 2 strainswere identified as T.viride Pers.ex Fr.preliminarily.It could be known from the phylogenetic tree made from 6 strains
of T.atroviride and T.viride in Genbank and TR1, TR2 and TR3, that TR1 should be classified into T.atroviride , TR2 and TR3 belonged to the same fun-
gi species and should be classified into T.viride.Thesewere consistent with the results from morphological observation.[ Conclusion] The combination of
morphological characters and ITS sequence analysis could be as foundation for classifying and identifying Trichoderma strains.
Key words　Cronartium ribicola J.C.Fischer;Trichoderma strain;Morphologic character;ITS sequence analysis
基金项目　云南省科技攻关计划项目(2003NG12)。
作者简介　周利(1982-),女 ,重庆人 ,硕士研究生 ,研究方向:植物病
理与资源微生物。＊通讯作者。
收稿日期　2008-03-13
　　茶 生柱锈菌(Cronartium ribicola J.C.Fischer)是林木三
大病害之一的五针松疱锈病的病原菌 。该菌具长循环型生
活史 ,防治十分困难 。在我国西南地区引起的华山松疱锈病
是华山松的一种毁灭性病害 ,严重影响长江中上游防护林体
系的建设 ,且有迅速蔓延的趋势[ 1-2] 。目前 ,国内有关利用
生物方法控制该病的报道甚少。
木霉属半知菌亚门丝孢纲丝孢目丝孢科 ,目前已报道过
至少 18个种 ,广泛存在于土壤 、根围 、叶围和种子等生态环
境中 ,是迄今为止作为生防菌研究以及应用较多的一类真
菌。木霉菌因其形态特征易受培养条件及其他因素的影响 ,
具有明显的生态多样性和物种多样性[ 3] ;加之鉴定过程中稳
定形态性状少 ,变异性大 ,仅靠形态分类 ,人为误差较大 ,准
确度较差 ,因此需要探讨更为客观的鉴定手段。目前 ,分子
生物学特征包括 rDNA-ITS ,mtSSU , tefl-a , ech42序列分析已逐
渐被应用于木霉菌的鉴定工作中[ 4] 。通过 ITS序列分析鉴定
种间关系已被广泛应用在真菌学领域 。在茶 生柱锈重寄
生菌筛选的前期工作基础上 ,笔者得到 3株对锈孢子具有强
烈破坏作用的重寄生木霉菌(Trichoderma spp.)[ 5] 。菌株的分
离和鉴定是研究真菌的基础 ,笔者通过形态及利用 ITS 序列
分析对木霉的 3个菌株进行了分类鉴定 ,旨在为下一步的应
用研究奠定基础。
1　材料与方法
1.1　木霉菌株　供试菌株TR1和TR2分别从来自四川广元
天台山林场和云南洱源罗坪山林场的锈孢子堆上分离获得 ,
TR3从来自云南巧家马树林场的保湿华山松感病树干病部
分离获得[ 6] 。
1.2　形态鉴定　3个菌株分别接种于 PDA平板上 , 28 ℃下
复壮 ,再于 28 ℃下培养。每隔 1 d观察 1次 ,记录菌落形态
特征和培养性状 ,并测量菌落直径大小。待菌落产孢后 ,挑
取少量孢子和产孢结构 ,显微镜下观察其产孢结构及孢子的
形状 、颜色 ,并测量孢子大小。参考《真菌分类学》 、《半知菌
属图解》、《真菌鉴定手册》等 ,进行种类鉴定。
1.3　基因组DNA的提取　收集PDA平板上的菌丝体 ,采用
蛋白酶K法[ 7]提取木霉 DNA。分别取 0.1 g菌丝体 ,在液氮
条件下研磨成粉末 ,迅速转入 1.5 ml 的离心管中 ,每管分别
加入 600μl提取缓冲液和 10 μl巯基乙醇 ,涡旋振荡 40 s ,室
温下 10 000 r/min离心 10 min。弃去上清液 ,向管内加入 250
μl提取缓冲液和 5 μl巯基乙醇 。涡旋振荡 40 s后立即加入
600μl裂解缓冲液 ,60 μl肌氨酸钠(5%)和 5 μl RNase A(10
mg/ml),颠倒混匀 40次 ,65 ℃水浴保温 15 min ,间隔 5 min摇
匀 1次。室温静置 10 min ,加入 500 μl氯仿/异戊醇(V/V=
24/1),涡旋振荡 40 s ,室温 10000 r/min离心 10 min ,吸取上清
液重复抽提 2次。在上清液中加入 2/3体积异丙醇 ,轻轻混
匀 ,室温静置 20 min ,4 ℃下 10 000 r/min离心 10 min ,弃去上
清液 。用-20 ℃预冷的 75%乙醇洗涤沉淀 3次 ,室温干燥 5
～ 10 min后加入TE溶液溶解沉淀 。
1.4　PCR扩增及纯化 、纯度检测及测序　分别以 3 株木霉
菌基因组DNA为模板 ,扩增 ITS区的引物参照White等[ 3]的
方法 ,选用 ITS5 和 ITS4 2 种通用引物。 ITS5 序列为:5′-
GGAAGTAAAAGTCAAGG-3′, ITS4 序列为:5′-TCCTCCG CT-
TATTGATATGC -3′。目的片段用 UNIQ-10柱式胶回收试剂盒
回收纯化。
PCR扩增体系为 50 μl ,分别为 10×PCR buffer 5 μl , dNTP
4μl ,ITS5 2μl , ITS4 2 μl ,无菌超纯水 36 μl ,模板 DNA 0.75μl ,
酶 0.25 μl 。反应程序为:94 ℃变性 5 min;94 ℃变性 30 s , 50
℃退火 30 s ,72 ℃延伸 lmin ,30个循环;72 ℃延伸 10 min 。每
1个引物重复试验 3次 。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳 ,以
分子量Marker(λHind Ш digest)指示谱带的大小及相对位置 ,
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(15):6211-6213　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　王淼　责任校对　况玲玲
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.15.121
稳压 125 V电泳 2 h。紫外检测仪观察 ,置于图像处理仪中处
理并保存。纯化样品送上海基康生物有限公司测序。
1.5　数据分析　序列经 BioEdit等软件分析和手工校正后 ,
用NCBI 的 BLAST(2.2.12version)程序将测出的序列与在
GenBank(http://www .ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中已知菌种的
ITS序列进行同源性比较分析。
2　结果与分析
2.1　3个木霉菌株的形态特征及种类鉴定
2.1.1　TR1 。TR1在PDA平板上的培养性状见图 1。培养初
期菌落圆形隆起 、绒状 、气生菌丝发达;2 d 后在接种菌块处
便开始产绿色的孢子堆;随后菌落每延伸 1.5 cm左右就形成
密集的孢子堆环带;最终菌落平展 ,圆形 ,白色;绿色的孢子
堆密聚成同心环状 ,环宽约 2 ～ 5mm ,与菌丝体呈白绿相间的
环纹;培养基背面不变色(无色素产生),也可见清晰的白色
和灰色相间的环纹。转接 3～ 5代后 , 4 d菌落长满 ,并产孢。
分生孢子堆不形成同心圆环 ,而是在菌落边缘均匀密集分
布。产孢瓶体对生于孢子梗小分枝上 ,也可散生 ,较粗短 ,长
(5.1-)7.6～ 12.6μm ,瓶体中部最宽处为 2.5 ～ 4.3μm ,基部
宽 1.5 ～ 2.3(-3.0)μm。分生孢子宽椭圆形或近球形 ,大小
为(3.0-)3.5～ 5.0μm×3.0～ 4.0 μm ,浅绿色。
　注:A-1:TR1初培养性状;A-2:TR13-5代后培养性状;A-3:TR1产
孢结构及分生孢子B-1:TR2培养性状;B-2:TR2产孢结构及
分生孢子;C-1:TR3培养性状;C-1:产孢结构及分生孢子。
　Note:A-1.TR1 init ial culture characters;A-2.Culture characters after
generation TR13-5;A-3.Sporulation structure of TR1 and conidi-
um;B-1.TR2 culture characters;B-2.Sporulation structure of
TR2 and conidium;C-1.TR3 culture characters;C-1.Sporulation
structure and conidium.
图1　3菌株形态特征
Fig.1 Morphological characteristics of three strains
　　上述培养性状和显微特征描述与文献记载的酷绿木霉
基本相符 ,初步鉴定该菌株为酷绿木霉(T.atroviride)。
2.1.2　TR2 。TR2在PDA平板上的培养性状见图 1中的 B-
1 ,B-2 。培养初期菌落生长缓慢;菌落近圆形 、短绒状 ,中部致
密 、隆起 ,雪白;5 d后培养基背面变淡黄色 , 7 d菌落迅速生
长 ,且不规则;不易产孢 ,光照可刺激产孢 ,20 d以后在粉黄
色绒状隆起的菌落表面产生墨绿色的分生孢子堆 ,孢子堆密
集 ,呈绒状小团 ,多集中于菌落边缘 ,后期菌落中部出现散生
的孢子堆;菌落在培养基背面呈淡黄色。显微镜下可见其产
孢瓶体在孢子梗小分枝上对生 ,直或稍弯 ,基部及颈部较细
长 ,长(7.6-)9.6～ 13.6(-15.4)μm ,中部最宽处为 2.3～ 3.0
μm ,基部宽 1.5～ 1.8 μm ,顶宽 0.3 ～ 0.8 μm。分生孢子宽椭
圆形或近球形 ,大小为(3.0-)3.5～ 4.5μm×3.0～ 4.0μm ,色
浅 ,稍带绿色。
2.1.3　TR3。TR3在 PDA平板上的培养性状见图 1中的C-
1 ,C-2。培养初期菌落生长缓慢 ,呈圆形 、稍隆起 ,具放射状纹
和环纹;5 d开始不规则地迅速扩展 , 7 d菌落在培养基背面
呈淡黄色;不易产孢 ,光照可促使分生孢子的产生。分生孢
子堆墨绿色 ,散生于整个绒状的菌落表面。产孢瓶体在小分
枝上对生 、轮生 ,较细长 ,长(8.3-)9.8～ 12.6(-15.4)μm ,中
部最宽处为 2.3～ 3.0(-3.8)μm ,基部宽 1.3～ 2.0 μm ,顶宽
0.4～ 0.8 μm 。分生孢子近球形 ,大小为(3.0-)3.5 ～ 4.0(-
5.0)μm×(3.0-)3.5～ 4.0 μm ,稍带绿色。
2个木霉菌株 TR2和TR3在培养性状和显微特征在一
定程度上相似。与文献记载的绿色木霉特征基本相符 ,初步
鉴定这 2个菌株为绿色木霉(T.viride Pers.ex Fr.)。
2.2　ITS序列分析及种类鉴定　由图 2可知 , 3个菌株的基
因组 DNA经 PCR扩增得到单一的目的条带 。通过序列分析
得知 ,3个菌株的序列长度均为 600bp左右 ,且TR2和TR3的
序列完全相同(图 3)。在 GenBank中经 Blast 检索发现 ,TR2
和TR3与 T.viride(菌株CBS 433.34 ,菌株wb284 ,菌株wb438 ,
GenBank编号分别为AF456922 ,AF455493 ,AF455432)的 ITS序
列具有 100%的同源性;TR1 和 T.atroviride(菌株 DAOM
222096 ,菌株G.J.S.91-87 ,菌株G.J.S.94-105 ,GenBank编号分
别为AF456920 ,AF456919 ,AF456918等)的 ITS序列具有 100%
的同源性。
图 2　PCR扩增条带
Fig.2 PCR amplification band
　　用 MEGA4.0软件进行最大简约法(Maximum-Parsimony ,
MP)和邻接法(Neighbor-Joining ,NJ)构建系统发育树(图 4)的
序列分析。从最大简约法分析得到的系统发育树上可以看
出 ,TR1 及 GenBank中编号为 AF456920、AF456919、AF456918
的 4 个菌株与 TR2、TR3 及 GenBank 中编号为 AF456922 、
AF455493、AF455432的 5 个菌株聚为 2个类群 ,可信度达到
100%。从邻接法的可信度分析也可看出 ,TR1与GenBank中
T.atroviride的 3个菌株聚在一起 , TR2和 TR3与 GenBank中
T.viride的 3个菌株聚在一起 ,可信度均为 99%。其中 ,TR2
和TR3的系统发育距离最近 ,可信度也达 99%。因此 ,笔者
将TR1命名为 T.atroviride ,TR2和 TR3 属同种真菌 ,命名为
为 T.viride。
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图 3　3个菌株的 ITs-rDNS扩增系带测序结果
Fig.3　Sequencing results of ITs-rDNS amplified band of 3 strains
图4　利用最大简约法和邻接法构建的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree construction by MP and NJ
3　结论与讨论
(1)木霉属半知菌类 ,种间 、种内生物性状变异较大。在
该研究过程中 ,长期的培养及利用使 3个菌株特别是 TR1在
形态上呈现出一定的不稳定性。因此 ,仅靠传统的形态分类
难以准确鉴定到种。该试验在形态分类的基础上结合分子
鉴定手段(rDNA-ITS序列分析)对 3株茶 生柱锈重寄生木
霉菌进行鉴定 ,提高了鉴定的准确性和可靠性。
(2)根据从Genbank中选择的 2个不同种即酷绿木霉和
绿色木霉的 6个菌株与该研究的 3个菌株所制作的系统发
育树可以看出 ,TR1应归为酷绿木霉 ,TR2和TR3则应归为绿
色木霉 ,这与形态学观察结果一致。
(3)ITS 序列是真菌菌种和分离物鉴定的可靠依据[ 8] ,
ITS区进化速率快 ,在不同菌株间存在丰富变异 ,一般用于研
究属间 、种间的系统关系[ 9] 。因此 ,对于一些种内 、种间具有
较大形态差异且缺乏其他证据的物种 ,其分类地位悬而未
决 ,但可以通过形态结合测定多位点序列的鉴定方法来
解决 。
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