全 文 ：113※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 15
裸燕麦球蛋白酶解液的纯化及其抗氧化研究
张美莉，蔺 瑞，管文荻，马萨日娜
(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018)
摘 要：通过Osborne法制得的裸燕麦球蛋白，利用碱性蛋白酶对其进行酶解，采用 Sephadex G-25凝胶层析对酶
解液进行纯化及其分子质量测定，然后对各分离组分清除·O H、O 2－·、D PP H 自由基能力进行研究。结果表
明：酶解液经分离纯化得到图谱为 2个峰，分别为组分 I(分子质量 10738～133929D)和组分 II(分子质量 114～861D)。
测得组分 II清除·OH(IC50 0.589mg/mL)、O2－·(IC50 1.783mg/mL)、DPPH自由基(IC50 0.095mg/mL)能力高于组分 I
和酶解液。
关键词：碱性蛋白酶；裸燕麦；球蛋白；抗氧化；活性肽
Preparation of Antioxidant Peptides from Naked Oat Globulin by Alkaline Protease Hydrolysis
ZHANG Mei-li，LIN Rui，GUAN Wen-di，MASARINA
(College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China)
Abstract ：Naked oat globulin was prepared by Osborne,s method and hydrolyzed by alkaline protease. The antioxidant
peptides in the hydrolysate were purified by Sephadex G-25 gel filtration chromatography and their molecular weights were
determined. The scavenging capacity of each purified fraction against hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals was
also determined. The results indicated that two fractions were obtained from hydrolyzed naked oat globulin and named as
fraction I and fraction II. The molecular weight ranges of fraction I and fraction II were 10738－ 133929 and 114－ 861 D,
respectively. In addition, fraction II had higher scavenging effect against hydroxyl radicals (IC50 = 0.589 mg/mL), superoxide anion
radicals (IC50 = 1.783 mg/mL) and DPPH radicals (IC50 = 0.095 mg/mL) than fraction I and the hydrolysate.
Key words：alkaline protease；naked oat；globulin；antioxidant；bioactive peptides
中图分类号：TS 201.25 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)15-0113-04
收稿日期：2010-07-07
基金项目：国家自然科学基金项目(30960240)；内蒙古自然科学基金项目(2009MS0307)
作者简介：张美莉( 1 9 6 6 —)，女，教授，博士，研究方向为植物生物活性成分的分离提取及农产品加工。
E-mail：zhangmeili22@sina.com
英国人Harman于 1956年提出了自由基学说。该学
说指出，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是
引起机体衰老的根本原因[1]。目前开发纯天然燕麦抗氧
化剂所需成本比人工合成抗氧化剂高很多，至今没能实
现产业化生产。因此，采用既经济又有效的方法或工
艺提取、制备高纯度的燕麦抗氧化剂，并使其广泛地
应用于食品和药品及其他生物制品的生产制造，具有非
常重要的现实意义和广阔的应用前景。
国外学者已从多种食物蛋白酶解液中分离出具有抗
氧化活性肽的片段。Pena-Ramos等[2]酶解大豆获得的抗
氧化肽，表现出强的抗氧化活性。我国利用蛋白酶解
制备抗氧化活性肽方面的研究起步较晚，对蛋白质水解
的研究主要集中在大豆蛋白、玉米蛋白等植物蛋白方
面。Chen等[3-4]、Fan等[5]对大豆抗氧化肽的研究显示出
较强的抗氧化活性。一些学者从不同角度研究了玉米抗
氧化肽[6-10]。Wang等[11]、程云辉等[12]考察了小麦抗氧化
肽。张美莉等[13]、李红敏等[14]对荞麦蛋白提取物进行了
清除自由基研究。目前对燕麦的研究与开发主要停留在燕
麦制品水平上，对燕麦蛋白及其活性成分的研究很少。
燕麦蛋白是一种优质的谷物蛋白，球蛋白是燕麦蛋
白的主要组成部分。燕麦蛋白中蕴涵着许多具有生物活
性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解释放出有活性的
肽段。该实验通过对裸燕麦球蛋白进行酶解，研究抗
氧化活性较高的肽段，为进一步开发利用燕麦蛋白质和
活性肽提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2011, Vol. 32, No. 15 食品科学 ※基础研究114
图 2 裸燕麦球蛋白酶解物凝胶层析色谱图(贮存第 6天)
Fig.2 Sephadex G-25 gel column chromatogram of 5-day-stored naked
oat globulin hydrolysate
A
28
0n
m
洗脱管数
35 30 25 20 15 10 5
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Ⅱ
Ⅰ
裸燕麦，取自内蒙古武川县；裸燕麦球蛋白(贮藏
于 0～4℃)，实验室自制。
F o l i n - 酚试剂、L - 酪氨酸、氧化型谷胱甘肽、
1,1-二苯基 -2-三硝基苯肼(DPPH)、VB12、牛血清白蛋
白、碱性蛋白酶 英国BDH公司；Sephadex G-25凝胶
美国GE公司；乙二胺四乙酸钠(EDTA)、七水合硫酸亚
铁、邻二氮菲、三氯乙酸( TC A )、三羟甲基氨基甲烷
(Tri s )、邻苯三酚以上试剂为分析纯。
1.2 仪器与设备
紫外 -可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责
任公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；
FD-2冷冻干燥机、YC-1层析冷柜 北京博医康实验仪
器公司；HL-1恒流泵、HD-21-1核酸蛋白检测仪、BSZ-
100自动部分收集器 上海青浦沪西仪器厂；XWT-S小
型台式记录仪 上海自动化仪表三厂；层析柱(1.6cm×
50cm) 上海锦华层析设备厂；H2500R-2高速冷冻离心
机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 裸燕麦球蛋白的制备及其酶解工艺
裸燕麦经去壳、脱毛、磨粉、脱脂后，采用
Osborne法[15]制备裸燕麦球蛋白。
酶解裸燕麦球蛋白的工艺流程如图 1 所示。
图 1 裸燕麦球蛋白酶解的工艺流程
Fig.1 Flow chart for the preparation and hydrolysis of naked oat
globulin
裸燕麦球蛋白
↓← 10g/100mLNaCl溶液
预温，调 p H 值
↓←碱性蛋白酶
恒温酶解(加入 0.5mol/LNaOH溶液稳定体系 pH值)
↓
记录消耗碱液＋ 100℃水浴灭酶 5min
↓
冷却(1.2mol/LHCl调节 pH值至 7.0)
↓
10000× g离心 15min
↓
上清液
1.3.2 凝胶过滤层析纯化裸燕麦球蛋白酶解液及分子质
量范围的测定
采用Sephadex G-25凝胶柱纯化裸燕麦球蛋白酶解液
(酶解条件：碱性蛋白酶用量 10000U/g、底物质量浓度
5g/100mL、温度 60℃、pH9.0、水解 3h)。凝胶通过
预处理、装柱、平衡后，缓慢加入样品 1 . 0mL，洗脱
条件为：泵速：3.8mL/10min；检测波长：280nm；走
纸速度：3cm/h；自动部分收集器：10min/管。在 280nm
波长处测定洗脱液的紫外吸光值，并收集、浓缩各峰
处的洗脱液进行抗氧化活性的测定。
1.3.3 裸燕麦球蛋白酶解物的凝胶过滤色谱分析
于 0～4℃下放置酶解液，通过观察其纯化图谱，测
定其放置时间。
1.3.4 裸燕麦球蛋白酶解物各组分分子质量范围的测定
2%的氧化型谷胱甘肽(MW=612.63D)、牛血清白蛋
白(M W= 67000D )、L - 酪氨酸(M W= 181 .19D )、V B 1 2
(MW=1355.37D)标准溶液 1.0mL上样，测定不同组分峰的
最大吸收峰的洗脱体积(mL)。以洗脱体积为纵坐标，标
准物分子质量对数(lgMW)为横坐标作标准曲线，并根据
标准曲线求出裸燕麦球蛋白酶解液中各分离组分的分子
质量范围。
1.4 裸燕麦球蛋白酶解物的多肽含量测定
采用 Folin-酚试剂法[16]。
1.5 裸燕麦球蛋白酶解物抗氧化活性测定
1.5.1 对·O H 和 O 2－·清除作用的测定
参考文献[17-18]方法进行测定。
1.5.2 对DPPH自由基清除作用的测定
对金杰等[19]的方法进行改进。在反应体系中依次加
入 0.1mmol/LDPPH乙醇溶液 2mL、1.0mL样品液、1mL
蒸馏水和 2mL无水乙醇，立即混匀于室温下放置 30min
后测定混合溶液在 515nm波长处的吸光度。空白对照用
等量蒸馏水代替。清除率按下式计算：
　　
Ai－Aj
清除率 /%=(1－————)× 100
　　 A0
式中：A0为未加样品液的DPPH溶液的吸光度；Ai
为加入样品液后的DPPH溶液的吸光度；Aj为乙醇与样
品液混合后的吸光度。
2 结果与分析
2.1 裸燕麦球蛋白酶解物的凝胶过滤色谱分析
裸燕麦球蛋白酶解液于 4 ℃下贮存第 6 天的
Sephadex G-25凝胶过滤色谱分析图(图 2)，第 6天的酶解
液经分离纯化得到图谱有 2个峰，分别为组分 I和组分 II，
没有降解现象，但第 7天的酶解液图谱有 5个峰，表明
酶解液有降解现象(图 3)。这可能与灭酶不充分导致酶解
液在贮存过程中继续酶解有关，对此结果有待深入研究。
115※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 15
2.2 裸燕麦球蛋白酶解物各组分分子质量范围的确定
裸燕麦球蛋白酶解液洗脱组分的分子质量，可根据
标准样品洗脱体积的标准曲线(图 4)得到，经计算组分 I
分子质量分布在 10738～133929D；组分 II分子质量分
布在 114～861D，可能是小分子质量的寡肽或是一些氨
基酸。
图 4 分子质量测定标准曲线
Fig.4 Standard curve for molecular weight determination
洗
脱
体
积
/m
L
0 2 4 6
120
100
80
60
40
20
0
y =－ 17.341x＋ 138.3
R2=0.9966
lgMw
2.3 裸燕麦球蛋白酶解物的抗氧化能力
裸燕麦球蛋白酶解物清除·OH、O2－·、DPPH自
由基作用如图 5所示，酶解物对 3种自由基的清除率随
其终质量浓度的增加呈二次曲线上升趋势。清除·OH、
O2－·、D P P H 自由基的 I C 5 0 分别为 4 . 07 1、5 . 2 2 3、
2.520mg/mL，清除活性依次为清除 DPPH 自由基＞
·O H ＞ O 2－·。
图 5 裸燕麦球蛋白酶解物抗氧化能力
Fig.5 Free radical scavenging activity of naked oat globulin hydrolysate
清
除
率
/%
0 2 4 6
70
60
50
40
30
20
10
0
·OH 清除率
O 2·清除率
DPPH自由基清除率
裸燕麦球蛋白酶解物终质量浓度 /(mg/mL)
2.4 裸燕麦球蛋白酶解物组分 I的抗氧化能力
图 6 裸燕麦球蛋白酶解物组分 I抗氧化能力曲线
Fig.6 Free radical scavenging activity of fraction I
清
除
率
/%
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
70
60
50
40
30
20
10
0
·OH 清除率
O 2－·清除率
DPPH自由基清除率
组分Ⅰ终质量浓度 /(mg/mL)
由图 6可知，裸燕麦球蛋白酶解物分离组分 I清除
3种自由基的作用随其质量浓度的增加而增加，并呈现
量效关系，符合二次曲线方程，清除·O H、O 2－·、
DPPH自由基的 IC50分别为 1.682、2.250、1.188mg/mL，
其清除能力依次为清除 DPPH自由基＞·OH ＞ O2－·。
2.5 裸燕麦球蛋白酶解物组分 II的抗氧化能力
清
除
率
/%
0 0.5 1.0 1.5 2.0
100
80
60
40
20
0
·OH 清除率
O 2－·清除率
DPPH自由基清除率
组分Ⅱ终质量浓度 /(mg/mL)
图 7 裸燕麦球蛋白酶解物分离组分Ⅱ抗氧化能力
Fig.7 Free radical scavenging activity of fractionⅡ
由图 7可知，裸燕麦球蛋白酶解物分离组分 II的清
除自由基能力较酶解液的高，并随其质量浓度的升高而
增加。清除·O H、O 2－·、D PP H 自由基的 I C 5 0 分别
为 0.589、1.783、0.095mg/mL，即清除能力依次为：
清除 DPPH 自由基＞·OH ＞ O 2－·。侯文娟等[19]对荞
麦球蛋白酶解液经凝胶过滤层析后获得的组分Ⅲ抗氧化
能力进行研究，得到其清除·O H、O 2－·、D P P H 自
由基的 IC50分别为0.897、0.75、0.38mg/mL，其中对·OH、
DPPH自由基的清除作用均低于裸燕麦球蛋白酶解物分离
组分Ⅱ。
2.6 裸燕麦球蛋白酶解液、分离组分 I及组分 II抗氧化
能力比较
由表 1 可知，对·O H、O 2－·、D P P H 自由基的
清除作用大小依次为：分离组分 II＞分离组分 I＞球蛋
白酶解液。裸燕麦球蛋白酶解液的抗氧化能力与其分子
质量大小有一定的关系，可能由于短肽中蕴涵着许多具
有生物活性的氨基酸序列。
图 3 裸燕麦球蛋白酶解物凝胶层析色谱图(贮存第 7天)
Fig.3 Sephadex G-25 gel column chromatogram of 6-day-stored naked
oat globulin hydrolysate
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
A
28
0n
m
洗脱管数 /个
35 30 25 20 15 10 5
Ⅱ
Ⅰ
2011, Vol. 32, No. 15 食品科学 ※基础研究116
3 结 论
3.1 裸燕麦贮存第 6天内的球蛋白酶解液经分离纯化得
到图谱为 2 个峰，分别为组分Ⅰ和组分Ⅱ，表明保存良
好，没有降解现象，但贮存第 7 天的酶解液发生降解，
并得到图谱为 5个峰。此现象可能由于灭酶不充分导致酶
解液在贮存过程中继续酶解，对此结果有待深入研究。
3.2 Sephadex G-25凝胶过滤层析纯化裸燕麦球蛋白酶
解液得到组分Ⅰ和组分Ⅱ。组分Ⅰ分子质量分布在
10738～133929D；组分Ⅱ分子质量分布在 114～861D，
可能是小分子质量的寡肽或是一些氨基酸。
3.3 分离组分Ⅱ清除·OH、O 2－·、DPPH 自由基作
用较分离组分Ⅰ和酶解液清除作用强，且 IC 50 分别为
0.589、1.783、0.095mg/mL，清除能力依次为清除DPPH
自由基＞·O H ＞ O 2－·。
参 考 文 献 ：
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组分
IC50/(mg/mL)
·O H O 2· DPPH自由基 分子质量 /D
酶解物 4.071 5.223 2.520
组分 I 1.682 2.250 1.188 10738～133929
组分 II 0.589 1.783 0.095 114～861
表 1 裸燕麦球蛋白酶解物及其分离组分的 IC50值比较
Table 1 Comparison of IC50 of naked oat globulin hydroly ate and
purified fractions for scavenging free rad cals