全 文 ：CEREALS AND OILS PROCESSING
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表 1 赤豆蛋白的基本指标
碱性蛋白酶水解制备赤豆蛋白肽的工艺研究
程谦伟 刘昭明 孟陆丽 黄翠姬
（广西工学院生物与化学工程系）
【摘要】 本文主要利用碱性蛋白酶水解赤豆蛋白制备赤豆蛋白肽， 研究各因素对酶水解反应
的影响， 并通过正交试验对 pH值、 酶解时间、 酶用量 （E ／ S）、 底物浓度等参数进行了优化。 确
定了适宜反应条件为： E ／ S 为 8％， pH 值 9．0， 底物浓度为 4％， 酶解时间为 4h， 酶解温度为
55℃， 在此条件下测得水解度为 45．82％。
【关键词】 红小豆蛋白； 碱性蛋白酶； 水解
中图分类号： TQ 636．2 文献标识码： A 文章编号： 1673-7199(2010)02-0043-03
蛋白肽具有良好的溶解性、 低黏度、 抗凝胶形成
性， 以及低分子肽不会产生过敏反应等优点。 除此之
外， 还具有众多的生理活性， 如促进发酵、 抗菌性、
抗氧化、 降血压、 降胆固醇、 抗疲劳等。 在营养蛋白
的多肽链内部可能普遍存在着功能区， 选择适当的蛋
白酶水解蛋白， 有可能将其释放出来， 从而制备各种
各样的生物活性肽， 为能生产出更好满足人类保健需
要的食品原料提供了新的机遇。
本文利用碱性蛋白酶水解赤豆蛋白制备赤豆蛋白
肽， 研究各因素对酶水解反应的影响， 确定适宜的工
艺条件， 从而提高了赤豆蛋白的利用率和附加值， 为
赤豆蛋白肽进一步开发利用奠定了一定的基础。
1 试验材料和方法
1．1 原料
赤豆蛋白： 自制； 碱性蛋白酶： 12 万 U ／ g； 氢氧
化钠， 盐酸。
1．2 主要仪器设备
凯氏定氮仪， HH－8 数显电热恒温水浴锅， pHS－
25型 pH计， HJ－1型磁力加热搅拌器。
1．3 试验方法
1．3．1 水分含量的测定
采用 GB 5009．3－85， 105℃恒重法。
1．3．2 蛋白质含量的测定
采用 GB 5511－85， 凯氏定氮法。
1．3．3 灰分的测定
采用 GB 5505－85， 550℃灼烧法。
1．3．4 赤豆蛋白酶解
按一定的底物浓度准确称取赤豆分离蛋白于酶反
应器中， 加入适量蒸馏水搅拌均匀， 加热到酶反应温
度后， 调至酶反应所需 pH值， 依据所用酶的质量单位
加入一定量的蛋白酶， 反应过程中调节 pH值使其恒定
在酶反应 pH 值 ， 反应至一定时间后 ， 沸水浴灭酶
10min， 调节 pH 值至 4．5， 冷却后 3 600r ／ min 离心
20min。
1．3．5 水解度的计算
采用 pH－Stat方法。
2 结果与分析
2．1 赤豆蛋白基本指标
赤豆蛋白的基本指标见表 1。
2．2 酶用量对酶解反应的影响
配制 3．0％赤豆蛋白溶液做底物 ， 酶用量 （E ／ S）
成分 蛋白含量 水分 灰分
含量 （％） 88．6 5．1 3．3
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分别为 2．0％、 4．0％、 6．0％、 8．0％、 10．0％， 溶液 pH 值
为 8．5， 反应温度 50℃， 反应时间 2h。 在上述条件下测
定酶解液的水解度， 结果如图 1所示。
由图 1 可知： 随着酶浓度的增加， 水解度迅速上
升， 之后再增加酶用量水解度上升速度明显放平缓，
产生以上结果的原因可能是在酶解反应中， 随着酶浓
度的增加， 过量的蛋白酶分子抑制了中间产物向酶解
反应终产物的转化。 蛋白酶在低浓度范围内， 随着酶
浓度的增加， 酶促反应速度增加， 水解度也跟着增加，
当酶量达到一定程度后， 随着酶浓度的增加， 过量的
酶抑制酶解反应速度的增加。
2．3 pH值对酶解反应的影响
在酶浓度为 6．0％ （E ／ S）， 温度为 50℃， 底物浓度
3．0％条件下， 分别取 pH 值为 7．0、 7．5、 8．0、 8．5、 9．0，
水解 2h。 在上述条件下测定酶解液的水解度， 结果如
图 2所示。
由图 2可知： 随着 pH值的变化水解度先增大， 当
pH 值达到 8．5 之后， 随着 pH 值的增大水解度略有下
降。 蛋白酶的最适 pH值与底物种类、 底物浓度、 酶的
等电点等都有关系， pH 值影响酶活力的原因主要有 3
方面： 一是 pH值在过酸或过碱的溶液中其空间结构会
遭到破坏， 引起酶变性从而导致酶构象的改变、 酶活
性随之丧失。 二是当 pH值改变不是十分剧烈时， 酶虽
然未发生变性， 但其活力已经受到影响。 三是 pH值影
响了与维持酶分子空间结构有关的基团， 从而改变了
酶活性部位的构象， 进而降低了酶活性。
2．4 酶解温度对酶解反应的影响
在酶浓度为 6．0％ （E ／ S）， 底物浓度为 3．0％， 溶液
pH 值为 8．5 的条件下， 分别在 40、 45、 50、 55、 60℃
下进行酶解反应， 水解 2h。 在上述条件下测定酶解液
的水解度， 结果如图 3所示。
由图 3 可知： 随着温度的增大， 水解反应速度增
大， 水解度增大较快， 当温度达到 55℃时， 水解度最
大， 当温度继续增大时， 水解度有所降低。 这是因为
蛋白酶分子的肽键具有特定的空间结构， 若反应温度
超过某一限度， 极易引起次级键解离， 而致使蛋白酶
丧失或部分丧失催化活性。
2．5 酶解时间对酶解反应的影响
在酶浓度为 6．0％ （E ／ S）， 温度 55℃ ， 底物浓度
3．0％ ， pH 值为 8．5 条件下， 分别反应 1、 2 、 3、 4 、
5h， 在上述条件下测定酶解液的水解度， 结果如图 4
所示。
由图 4 可知： 在一定的条件下底物的水解度随着
酶解时间的延长而增加， 并有趋于平缓的趋势。 这是
因为随着酶解反应的进行底物浓度变得越来越小， 反
映位点逐渐被酶分之饱和， 可能被酶作用的肽键数量
减少， 同时产物浓度增加， 其竞争性抑制变强。
2．6 底物浓度对酶解反应的影响
碱性蛋白酶在酶浓度为 6．0％ （E ／ S）， 温度 55℃
条件下 ， 分别取底物浓度为 2．0％ 、 3．0％ 、 4．0％ 、
5．0％、 6．0％， 水解 3h， 其水解度随底物浓度的变化如
图 2 pH 值对赤豆蛋白酶解反应的影响
图 3 酶解温度对赤豆蛋白酶解反应的影响
图 1 酶用量对赤豆蛋白酶解反应的影响
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图 4 酶解时间对赤豆蛋白酶解反应的影响
表 2 正交试验结果
试验号
E ／ S
A（％）
pH 值
B
底物
C（％）
时间
D（h）
水解度
（％）
1 1 （4） 1 （8．0） 1 （3） 1 （2） 24．58
2 1 2 （8．5） 2 （4） 2 （3） 39．51
3 1 3 （9．0） 3 （5） 3 （4） 43．27
4 2 （6） 1 2 3 36．85
5 2 2 3 1 32．66
6 2 3 1 2 42．73
7 3 （8） 1 3 2 33．51
8 3 2 1 3 45．12
9 3 3 2 1 43．18
K1 107．36 94．94 112．43 100．42
K2 112．24 117．29 119．54 115．75
K3 121．81 129．18 109．44 125．24
R 14．45 34．24 10．10 24．82
图 5 所示。
由图 5 可知： 水解度随着底物浓度的增大而增大。
当底物浓度达到最适宜浓度时， 水解度达到最大值，
底物浓度继续增大， 水解度呈下降趋势。 底物浓度过
高不利于酶的充分作用， 可能是由于酶解体系中高浓
度的蛋白可能与蛋白酶形成无活性的中间产物， 从而
降低了酶水解反应的效率。
2．7 赤豆蛋白肽酶解正交试验设计
选取酶解温度为 55℃， 对酶用量 （E ／ S）、 pH 值、
酶解时间、 底物浓度等工艺参数进行优化。 试验结果
见表 2。
由表 2可知： 最优方案为 A3B3C2D3， 即 E ／ S为 8％，
pH 值 9．0， 底物浓度为 4％， 酶解时间为 4h。 影响水解
度的因素 B＞D＞A＞C， 即 pH 值、 酶解时间、 E ／ S、 底物
浓度对水解度的影响是依次减小的。
3 结论
确定适宜反应条件为： 酶浓度 （E ／ S） 为 8％， pH
值 9．0， 底物浓度为 4％， 酶解时间为 4h， 酶解温度为
55℃。 在该条件下做验证试验 ， 实际测得水解度为
45．82％。
参 考 文 献
［1］ 崔凌飞， 王遂． 蛋白质及其水解物的分析应用 ［J］ ． 哈尔滨商业
大学学报， 2002， 18 （1）： 117～120．
［2］ 焦迎春， 郑晓冬． 活性肽在食品中的研究 ［J］ ． 粮油加工与食品
机械， 2002 （8）： 35～37．
［3］ 庞广昌， 王秋韫， 陈庆森． 生物活性肽的研究进展理论基础与展
望 ［J］ ． 食品科学， 2001， 22 （2）： 88～84．
［4］ 赵新淮， 冯志彪． 蛋白质水解物水解度的测定 ［J］ ． 食品科学，
1994 （11）： 65～67．
［5］ 彭志英 ． 食品酶学导论 ［M］ ． 第一版 ． 北京： 中国轻工业出版
社， 2002．
［6］ 沈同， 王镜岩． 生物化学 ［M］ ． 上册． 北京： 高等教育出版社，
1999．
［7］ 刘宁， 仇农学． 碱性蛋白酶 Alcalase 水解杏仁蛋白制备 ACE 抑制
肽 ［J］ ． 农产品加工： 学刊， 2009 （3）： 149～152．
基金资助： 广西区教育厅科研项目 （200708LX184）
收稿日期： 2009－08－25
作者简介： 程谦伟 （1979—）， 男， 安徽安庆人， 硕士， 主要从事植
物蛋白方面的研究。
通讯作者： 刘昭明 （1966—）， 男， 广东广州人， 硕士， 副教授， 从
事食品工艺与生物技术研究。
通信地址： （545006） 广西柳州市东环路 268 号
图 5 底物浓度对赤豆蛋白酶解反应的影响
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