全 文 ：第 28卷第 1期
19 9 5年 3月
实 验 生 物 学 报
A e ta B i o l e
,
g i a e E x P e r im e n t a l i s S加 i e a
V o l
.
2 8
,
N o
.
1
M a r e h 1 9 9 5
通过 “供体一受体 ” 原生质体融合将裸燕麦
部分核基因组转移给普通小麦带
刘 宝 * 刘 大钧
(南京农业大学细胞遗传研究所 , 南京 2 10 0 1 4)
( 带东北师范大学遗传与细胞研究所 , 长春 1 3 0 0 24)
摘 要
本文进行了小麦和裸燕麦悬浮细胞原生质
体的电融合 , 并基于双亲失活 (用 I O A 处理 受
体小麦原生质体 , 用卜射线照射供体裸燕麦细
胞系 ) , 获得可能的杂种愈伤组 织 。 对 7块愈
伤组织进行了乙醇脱氢酶 ( A d h) 同工 酶筛选 ,
发现 5 块表现出双亲特征酶带 。 对 3 个杂种细
胞系进行 5 种同工酶分析 , 证实它们均为稳定
的不对称体细胞核杂种细胞系 ; 它们表现出小
麦的完整谱带和裸燕麦的部分谱带 。 对 2 个杂
种细胞系及亲本的 核 糖 体 D N A S o ut h er n 分
析结果表明只有一个杂种细胞系 ( H B 95 ) 含有
双亲的全部谱带 。 细胞学观察表明 , 2 个杂种
细胞系的染色体数 目均显著高于双亲 。 从杂种
细胞系 H B 94 中分化出叶原基等 分 化 结 构 。
A d h 同工酶分析表明 , 这些分 化结构具有和母
体细胞系完全相同的杂种谱带 。
关社词 : 小安 裸燕交 原生质体融合 部分基因组转移
本文 1 9 9 4年 3 月 2 2 日收到 。 1 9 94 年 1 0 月 2 5 日接受 。
帝 本文部分结果曾在 “ 第八届国际小麦遗传一学会议 ” 上宣读 。
中科院植物所孙敬三先生惠赠裸燕麦细胞系 , 谨致谢意 。
T R A N S F E R O F P A R T I A L G E N O M E O F A V E N A N U D A L
.
I N T O T R I T I C U M A E S T IV U M L
。
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D 0 N 0 R 一R E 一
C I IP E N T
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P R O T O P L A S T F U S I O N
L i u B a o
* L i u D a 一 ju n
( I n s t畜t u t e oI C夕t o s e称 e t宕e s , N a n j止n g A群i e u 乙t u ar 乙 U n iv er s止yt , N a nj i n g 2 1 0 0 1` )
(
今 I托 s t玄盆u t e oj G e n e 忿玄e s & yC 亡。王0 9二户
,
N o r公h e a s公 N O r机 a 乙 U 玲玄, 己r s i亡y , C h a n g e h u n 1 3 0D 2 4 )
I N T R O D U C T I O N
s u P e r i o r g r a i n q u a l i t y a m o n g t h e g r a m i
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r i e u l t u r a l s i g n i f i e a n e e
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A Pa r t f r o r 以 i t s
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P a r t o f t h is p a P e r w a s o r a l ly p r e s e n t .: d a t t h e 孤 I n t e r n a t i o n a l 丫V h e a t G e n e t i e s S y m p o s in m .
W e a r e g r a t e f u l t o P r o f
.
S h u n J加 g ~ s h a n o f t h e I n s t i t u t e o f B o t a n y , C h i n e s e A e a d e m y o f
S e i e n e e s f o r P r o v i d i n g t h e n a k e d o a t e e l l su s Pe n s i o n
.
9 6
刘 宝 刘大钧 2 8卷
o a ta r e P hy lo g e n e tia el ly r m e
o t e
, 5 0 s e X u a l
h y b r id i z a t i o n o f t h e s e tw o c r o P s P e c l e s
b e l o n g i n g t o d i f f e r e n t t r i b e s h a s b e e n u n
-
s u e e e s s f u l
.
P r o t o P l a s t f u s i o n t e e h n i q u e
o P e n de u P P o s s i b i l i t i e s o f e i r e u m v e n t i n g
s o m e o f t h e b a r r i e r s f a e e d b y e o v e n t i o n a l
m e t h o d s
.
E s P e e i a l l y t h e a s y m m e t r i e f u s i o n
o r “ d o n o r 一 r e e i P i e n t f u s i o n s y s t e m h a s
b e e n d e m o n s t r a t e d a s v e r y e f f e e t i v e f o r
e r e a t i n g s o m e n o v e l g e n o t y p e s
, s u e h a s h i
-
g h l y a s y m m e t r i e n u e l e a r h y b r i d s w i t h o n
-
l y Pa r t i a l g e n o m e f r o m t h e d o n o r s P e e i e s
o r e y b r i d w i t h t r a n s f e r r e d o r m o d i f i e d
( t h r
o u g h i n t e r m o l e e u l a r r e e o m b i n a t i o n )
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o P l a s m i e t r a i t (
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o m t h e d o n o r
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e v e r
, s t u d y o n P r o t o p l a s t f u s i o n e o n e e r n i n g
w h ae t 1
5 s e a n t
, a n d o n l y i n o n e r e P o r t
h y b r i d e a l l u s w a s o b t a i n ed [
1 1
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e b e l ive e
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f e a s i b i l i t y o f t r a n s f e r r i n g o n l y P a r t g e n o
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m e o f o a t i n t o w h e a t v i a
“ d o n o r一 r e e i P i e n t
P r o t o P l a s t f u s i o n
, a n d a l s o t o e l u e id a t e
w h e t h e r t h e s e x u a l i n e o m P a t i b i l i t y b e t w e e n
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s s a r i l y l e a d i n g t o
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t i e i n e o n g r u i t y
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m a t i o n m i g h t b e o b t a i n e d f o r t h e l o n g -
t e r m o b」e c t i v e o f i n e o r P o r a t i n g s o m e o f
t h e e l i t e e h a r a e t e r i s t i e s o f o a t i n t o w h e a t
.
M A T E R I A L S A N D M E T H O D S
P l an t m a t e r i al an d P r e p ar a t i o n o f P r o t o P l as t s
A w h e a t e e l l s u s P e n s i o n H IN F w h i e h w a s
i n i t i a t e d f r o m im m a t u r e i n 士l o r e s e e n e e一 d e r i v e d
e m b r y og e n i e e a l lu s o f e v
. “
M a r is H u n t sm a n
”
a n d a n a k e d o a t ( A v e n a n u d a L
.
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s u s p e n
-
s i o n e s t a b l i s h e d f r o m a n t h e r e a l l u s o f e v
. a
s h
a n -
f e n s h a n
” [ 2 ] w e r e u s e d a s s o u r e e s o f P r o t o P l a s t s
·
W h e a t P r o t o p l a s t s w e r e i s o l a t e d a s d e s e r i b e d
p r ve fo u s l y [
3 J
.
T h e P r o t o p l a s t s w e r e t h e n t r e a t e d
w i t h d i f f e r e n t e o n e e n t r a t i o n s o f i o d o a e e t a t e
( I O A ) a t r o o m t e r n P e r a t u r e ( 2 3一 2 5℃ ) f o r 2 0
m i n a n d w a s h e d b y s o l u t i o n e o n t a i n i n g 0
.
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mo l /
L C aC 1
2 · 2 H 2 0 a n d 0
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mo l /
L m a n n i t o l f o r
3 t im e s a n d e e l l d e n s i t y w a s a d j u s t e d t o s x l o
s 。
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一d a y 一 o l d e el l s u s P e n s io n o f o a t w a s i r r a -
d i a t e d w i t h d if f e r e n t d o s e s o f g a m m a一 r a y f r o m
a 6 0C o s o u r e e a t a d o s e r a t e o f e a
.
5 0 G y / m i
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·
P r o t o P l a s t s w e r e t h e n i s o l a t e d
,
P ur if i
e d a n d e e ll
d e n s i t y a d ju s t e d a s i n w h e a t
·
P r o t o P l a s t f u s i o n an d e u l t u r e
A s e l f一a d e e l e e t r o f us io n a P P a r a t us w a s
e m p l o y e d
·
T h e f u s io n e h a m b e r w a s m a d e b y
g l u i n g t w o i m m t h i e k e o p p e r s t r i P s t o a m i
-
e r o s e o P e s l i d e ; t h e g a p i n b e t w e e n w a s i
.
s r Q r n
,
m a k i n g t h e v o l u m e o f t h e e h a m b e r a P P r o X im a
-
t e l y 1 0 0 林1. T h e f u s i o n e h a m b e r w a s e o n n e e t e d
t o a f u n e t i o n g e n e r a t o r d e l i v e r i n g a m a x im um
A C a m P l i t u d e o f 4 0 V a t o
。
5一 2 M h z , a n d ot a
g e n e r a t o r o f D C s q u a r e p u l s e s w i t h t h e l e n g t h
v a r i n g f r o m s 林5 t o 2 m s , a n d a m P l i t u d e s u P t o
5 0 0 V
.
I n a e t i v a t e d P r o t o p la s t s o f w h e a t a n d o a t
w e
r e m i x e d l : i
, a n d 1 0 0 卜1 a l i q uo t s o f t h e
m i x t u r e w e r e p i P e t t e d i n t o t h e f u s i o n e h a m b e r
·
T h e e l e e t r o f u s i o n P r o e e d u r e s w e r e a s f o l l o w s *
t h e P r o t o P l a s t s w e r e a l i g n e d i n a A C f i e l d
( 0
.
5一 1 . o M h z ) o f 1 0 0一 1 5 o V / e m ; o n e o r two
D C p u l s e s o f 1 0 0 0一 1 5 0 0 V / e m ( 2 0一4 0 协s ) w e r e
a p p l i e d
, a f t e r w h i e h t h e A C f i e l d w a s g r a d u a l l y
r e d u c e d t o z e r o
.
T h e P r o ot P l a s t s us P
e n s io n w a s
t h e n P IP e t t e d o n t o a n i t r o e e l l u l o s e f il t e r s即·
P o r t e d nu
r s e e ul t u r e
,
t o w h i e h a d d a n e q u a l v o
·
lu m e o f a m o d i f i e d M S m e d iu m i n w h i e h a l l
t h e e o m P o n e n t s e x e e P t g l u e o s e w e r e a t d o ub le
e o n e e n t r a t i o n s
.
P r o t o P l a s t s o f b o t h P a r e n t s a s
w e l l a s t h e i r l : 1 m i x t u r e w e r e a l s o e ul t ur e d a s
co n t r o l s
.
T h e e o m P o s i t io n of t h e M S m e d ium
w a s a s f o l l o w s
:
M S b a s a ] s UP P l m
e n t e d w i t h
2
,
4一D l m g / L
,
N A A o
.
s m g / L
,
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。
Z m g / L
-
C H 2 0 0 m g / L
,
g l u t a m i n e 3 0 0 m g / L
, a s p a r a g i n
1 5 0 m g /L
, s u c r o s e 1 0 9 / L
a n d g l u e o s e 0
.
5 mO I / L
;
PH w a s a d j u
s t e d t o s
。
6 b y 1 N K O H a n d f i-l
t e r一 s t e r i l i z e d . P r o t o P l a s t s w e r e e u l t ur e d i n d a r k
a t 2 5℃ · S a m P l e s w e r e r e g ul a r l y t a k e n f o r m i -
e r o s e o P i e o b s e r v a t io n
.
A f t e r 2 0 d a y s o f e ul t ur e
-
t h e f i l t e r
s
w i t h e e l l s o n t h e m w e r e t r a n s f e r r e d
t o n e w m e d ium w h
e r e n u r s e e e l l s a n d g l u e o s e
w e r e o m i t t e d
.
T w o w e e k s l a t e r
,
m i e r o e a l l i v i s i
-
b l e t o t h e n
a
k e d e y e s w e r e i n d iv i d u a l y P ic k e d
u P a n d t r a n s f e r r e d o n t o f r e s h m e d iu n l a n d e ul
-
t U r e d U n d e f i l l u m i n a t i o l
.
I s o z y m e
, e y t o l o g y a n d r i b o s o m a l D N A
a n a l y s i s
F iv e i
s o z y m e s
,
i n e l u d i n g P e r o x i d a s e
, e s t e r a
-
s e , a l e h o h o l d e h y d r o g e n a s e ( A d h )
,
p h o s p h o g l-u
e o n a t e d e h y d r o g e n a s e ( 6 P G D )
,
g ih t a m a t e o x a l o
-
a e e t a t e t r a n s a m i n a s e ( G O T ) w e r e a n a l y z e d b y
P A G E a e e o r d i n g t o Pu b l i s h e d p r o e e d u r e s 〔4 ] . C y ·
t o l o g i e a l o b
s e r v a t i o n w a s P e r f o r m e d f o l l o w i n g
t h e P r o t o e o l o f K a r P [ 5 ]
.
F o r e h r o m o s o m e e o un
-
t i n g
,
t h e f i r s t 6 0 w e l卜 s P r e a d m e t aP h a s e e o ll s
1期 通过 . 供体一受体 ,原生质体融合将裸燕麦部分核基因组转移给普通小麦 9 7
w e r e e o u n t e d f o r e a e h m a t e r i a l
.
G e n o m i e D
.
N A s
w e r e i s o l a t e d a n d d ig e s t e d
.
A w h e a t r i b o s ( )m a l
D N A r e e o v e r e d f r o m P T a 7 1 w a s r a d io a e t i v e l y
l a b e l l e d
.
S o u t h e r n a n a l y s i s w a s P e r f o mr
e d a s
d e s e r i b e d [ 1 ]
.
C e l l e lus t e r s o f 3 h y b r i d e e l l l i n e s
a n d b o t h P a r e n t s w e r e t e s t e d f o r m o r Ph o g e n i e
P o te n t i a l
.
T a b l e l E f f e e t s o f i r r a d i a ti雌 o a t s u -
s P e n s i o n e e l l s a t d i f f e r e n t d o s e s
o n p r o t o P l a s t d i v i s i o n a n d
P l a 亡i n g e f五 e i e n e y .
反D o s e D iv i d i n g p r o t o p l a s t s p l a t i n g 吐f i e i e n e y
( G y )
介 奄
( % )
工 ( % ) 名
néon`nU甘8QU八舀óU工匀J任八no自月rt了ùb.…ùO性月丹七ǎ匕119八UAnoOJJO自Q1土Q,R E S U L T S
令
褚 一 .州
.
,
.
. 竺
,
.
P a r en t
a l P r o t OP l
a s t s i n a e t i v a t i o n
P r e v i o u s e x P e r i m e n t a l d a t a i n d i e a t ed
t h a t w h ea t ( H I N F )
s u s P e n s i o n P r o t o P l a s t s
w er e s e n s i t i v e t o I O A t r ea tm en t s
.
C a l l u s
f o r m i n g a b i l i t y w a s e o m P l e t e l y i n h i t , i t de
b y 1
.
5 m m o l / L I o A t
r e a tm e n t
.
H o w e v e r
,
w h e n u n d e r n u r s e e u l t u r e e o n d i t i o n s
, 、v h i -
e h w a s e m P l o y e d t o e u l t u r e t h e f u s i o n
p r o d u e t s
,
2
,
o一 2 , 5 m m o l / L w a s r e q : `i r e d
t o g u a r a n t e e P l a t i n g e f f l e i e n e y t o b e z er o
.
5 0 i n f u s i o n e x P e r im即 t s , e o n e en t r a t i o n s
o f 2
.
5一 3 . 0 m m o l / L I o A w e r e r o u t i n e l y
u s e d t o i n a e t i v a t e w h e a t P r o t o P l a s t s
.
C o m Pa r e d t o o a t s u s P e n s i o n e e l l s
,
t h e
n a k e d o a t P r o t o P l a s t s w e r e m u e h m o r e s u s
-
e e P t i b l e t o y 一 i r r a d i a t i o n
.
P r e l i m i n a r y
’
e x
-
P e r i m e n t s i n d i e a t e d t h a t 4 5 0 G y t r ae tm
e n t
o n o a t P r o t o P l a s t s e o u l d e姗 P l e t e l y P r e: v e n t
e a l l u s f o r m a t i o n
,
w h i l e a b o u l t 7 2 0 G y w a s
n e e d e d f o r s u s P e n s i o n e e l l s ( T
a b l e l )
.
P l a -
t i n g e f f i e i e n e y w a s g r a d u a l l y d e e l i n i们名 a s
i r r a d i a t i o n d o s e s i n c r e a s e d
.
B u t 10 w
. l o s e s
o f i r r a d i a t i o n e o u ld s l i g h t l y i n e r ae
s e e e l l
d i v i s i o n f r e q u e n e y
.
E v e n a f t e r h i g h d o s es
o f i r r a d i a t i o n
,
P r o t o P l a s t s s t i l l a P P ea
r ed
v i a b l e a n d e v e n u n d e r w e n t a f e w d i v i s i o n s
.
B u t t h e y a lw a y s s t o P ed d i v i d i n g a t e e r t a i n
s t a g e s
, a n d e o n s e q u e n t l y n e v e r g r e 、 v t注P t o
e o l o n i e s
.
P r o t o P l a s t f u s i o n a n d P u t a t i v e s呱 a -
t i e h y b r i d e a l l u s f o r ` n a t i姐
T h e P r o e es s o f e l e e t r o f u s i o n t o o玉二 l es s
t h a n 1 m i n f o r 1 0 0 协1 a l i q u o t o f P r o t o -
P l a s t m i x t u r e
.
C h a i n s o f 2 0一 3 0 P r o t o -
P l a s t s w e r e f o r m de w i t h i n 1 0 5 a t A C f i e
-
l d s t r e n g t h 1 0 0一 1 5 0 V / e m , f r e q一` e n盯
0
.
5一 1 . 0 M h z ( F i s . i A ) . 凡s i o n b et we e n
P r o t o P za s ts o e e u r de w h e n 1 0 0 0~ 1 5《)O V /
0
4 5 0
5 4 0
7 2 0
9 0 0
1 0 8 0
1 3 5 0
1 7 7 0
0
。
2 9
0
。
2 4
0
。
0 3
< 0
。
0 1
0
0
0
0
帝
I n n i t r o e e l lu l o s e f i l t e r s即 P o r te d n u r s e e ul t一
u r e , o a t a s n u r s in g e e l l s
.
帝带 5 0 G y / m i
n 。
l
。
N o
。 o f d i v i d i n g e e l l s / N o
。 o f P r o t o P la s t s
o b s e r v e d ( 1 4 d a y s i n e u l t u r e )
。
2
。
N o
。 o f m i e r o e a ll i / N
o
·
o f P r o t o P l a s t s i n o 一
e ul a t e d ( 2 8 d a y s i n e u l t u r e )
e m D C s q u a r e P u ls e w a s a P P l i e d f o r 4 0 协s
d u r a t i o n
, o n e e o r t w i e e
.
A s t h e m o r P h o
-
I o g i e a l d i f f e r e n e e b e t w e e n w h e a t a n d o a t
P r o t o P l a s t s w a s d i s t i n e t ( o a t P r o t o P l a s ts
w er e a b u n d a n t w i th s ta r ch g
r a n u l es )
,
h e
-
t e r o f u s e d P r o d u e t s w e r e e a s i l y r e e o g n i z e d
.
U s u a l l y 1 0% b i n a r y h e t e r o f u s i o n w a s o b
-
t a i n e d
.
A f t e r 7一 1 0 da y s i n e u l t u r e , b o t h
i n t h e f u s i o n 一 t r e a t ed P r o t o P l a s t s a n d i n
) L D
l o o d o s e s g a m m a 一 r a y i r r a d i a t ed o a t
P r o t o P l a s t s o r l : 1 m ixe d P r o t o P l a s ts
, s o m e
d i v id i n g e e l l s e o u l d b e d e t e e t e d
.
B u t t h e r e
w a s n o s u r v i v a l e e l l s i n 2
.
5一 3 . 0 m m o l / L
I O A t r e a t e d w h e a t P r o t o P l a s t s
; t h e y a l l
r u P t u r e d a n d d i e d
.
A f t e r 3 w e e k s i n e u l
-
t u r e
, o n l y i n f u s i o n 一 t r e a t e d P r o t o P l a s t s ,
e e l l e o l o n i e s e o u l d b e o b s e r v e d
.
W h
e n t h -e
s e s m a l l e o l o n i e s a l o n g w i th th e f i l t er s
w 改 e t r a n s f er r e d o n t o n e , v m de i u m , m o s t
o f ht em
e ae s ed t o d i v i d e a t e e r t a i n s t a g e s
,
a n d o n l y a v e r y s m a l l f r a e t i o n o f t h em
e o u ld g r o w u P t o e a l l i
.
A t o t a l o f 7 e a l l i
w e r e o b t a i n e d i n m o r e t h a n 5 0 P e t r i d i s h-
es (
e a
hc w i t h 1 0 0 卜1 P r o t o P l a s t s )
.
I s o Z y m e a n a l y s 宜吕 o f the p u t a t ive h y -
加 i d ca l l u s
9 8刘 宝 文续大钧 25卷
e nd o u n el ea s es
,
t w o e e l l l i n e s H B 9 4 a n d
H B 9 5 ) a n d t h e i r P a r e n t s w e r e d i g e s t e d a n d
h y b r i d i z ed t o a a 一 3 z P l a b e l l e d w h e a t r D N A
( P l a t e 亚 , F i g , C ) . R e s u l t s i n d i e a t ed t h a t
o n l y H B 9 5 e e l l l i n e e o v e r e d b a n d s o f b o t h
P a r e n t s
,
H B 9 4 o n l y e x h ib i t e d b a n ds o f
w h e a t
.
T h i s f a e t f u r t h e r d e m o n s t t a t e d t h e
h i g h l y a s y m m e t r i e n a t u r e o f H B 9 4 e e l l
l i n e s
.
C y t o l o g i e a l o b s e r v a t i o n o f h y b r i d e e l l
l i n e s
C h r o m o s o m e s o f h y b r id e e l l l i n e H B
9 4 a n d H B 9 5 w e r e o b s e r v e d e y t o l o g i e a l l y
.
A s t h e g r o s s m o r P h o l o g y o f w h e a t a n d o a t
e h r o m o s o m e s a r e n o t d i s t i n e t i v e l y d i f f e r e n t
,
i t w a s d i f f i e u l t t o e s t i m a t e t h e r e s P e e t i v e
e o n t r i b u t i o n s b y t h e t w o P a r e n t s
.
I n t e r m s
o f e h r o m o s o m e n u m b e r
,
h o w e v e r
,
b o t h h y
-
b r i d e e l l l i n e s h 吕 d s i g n i f i e a n t l y m o r e e h -
r o m o s o m e
o t b o n e i t上* e r o f t h e P a r e n t s ( P l a -
t e 五 , F i g . A , B ) . F o r d e t a i l e d q u a n t i t a -
t i v e e o m P a r i s o n
, e h r o m e s o m e n u m b e r f r e
-
q u e n e y d i s t r i b u t i o n o f b o t h P a r e n t s a n d
H B 9 4 w e r e p r e s e n t e d ( F i g
.
l )
,
S u r P r i s i n
-
g l y
, e v e n f o r t h i s m o s t a s y m m e t r i e h y b r i d
e e l l l i n e ( b a s e d o n i s o z y m e a n d r D N A a n a
-
l y s i s )
,
t h e e h r o m o s o m e n u m b e r 15 m o r e
t h a n t h e s u m m a t i o n o f b o t h P a r e n t s
.
T h i s
840ǎn443
2904322ó.q洲匕,二
06仆ù八二-l一中口
T h e 7 P i e e e s o f e a l l i w e r e P r e l im i n a r
-
l y t e s t ed f o r A d h i s o z y m e a e t i v i t y
, a n d
5 o f t h e m e x P r e s s e d t h e s u m m a t i o n o f e n
-
z y m a t i e b a n d s o f b o t h P a r e n t s
.
W
e n o t i e e d
t h a t g r o w t h r a t e s o f t h e s e 5 e a l l i w e r e 5 1
-
g n i f i e a n t l y d i f f e r e n t
.
J
’
w o o f t h e m g r e w
v e r y S 10 W l y m a k i n g f u r t h e r a n a l y s i s d i f f i
-
e u l t
.
T h e o t h e r 3 e a l l i P r o P a g a t e d v i g o r o u
-
s l y
, 5 0 3 s u s Pe n s i o n e e l l l i n e s w e r e e s t a b
-
l i s h ed b y l i q u i d e u l t u r e
.
A f t e r b e i n g s u b
-
e u l t u r e d f o r o n e y e a r
,
t h e 3 e e l l l i n e s
w e r e s u b j e e t e d t o t h e a n a l y s i s o f 5 i s o z y
-
m e s w h i e h s h o w e d P o l y m o r P h i s m s b e t w e e n
w h e a t a n d o a t
.
R e s u l t s s h o w e d t h a t a l l
t h e 3 e e l l l i n e s h a d s t a b l e i n t a e t b a n d s o f
w h e a t
,
w h i l e e x P r e s s i n g b a n d s o f o a t i n
s o m e o f t h e 5 i s o z y m e s
,
b u t n o e e l l l i n e s
h a d b a n d s o f b o t h P a r e n t s f o r a l l t h e s
i s o z y m e s s u g g e s t i n g t h a t t h e t h r e e e e l l 11
-
n e s w e r e a l l a s y m m e t r i e s o m a t i e n u e l e a r
h y b r i d s
, o r r a t h e r
, o n l y P a r t i a l g e n o m e o f
o a t w a s t r a n s f e r r ed i n t o w h e a t ( P l
a t e l )
.
F o r A d h i s o z y m e
, a l l t h e 3 h y b r i d s e x
-
P r e s s e d a n e w b a n d t h a t e x i s t e d i n n e i t h e r
o f t h e P a r e n t s
.
T h e d e g r e e o f a s y m m e t r y
w a s a l s o d i f f e r e n t a m o n g t h e 3 e e l l l i n e s
.
H B 9 4 o n l y e x P r e s s e d e o m P l e t e b a n d s o f
o a t f o r P e r o x i d a s e i s o z y m e
.
W h i l
e i t m e
-
r e l y h a d P a r t o f t h e A d h a n d e s t e r a s e b a n
-
d s o f o a t
.
C o n s i d e r i n g t h a t t h e s e t w o 15 0
-
z y m e s a r e b o th P r o d u e t s o f m u l t i g e n e s 10
-
e a t e d o n d i f f e r e n t e h r o m o s o m e s
,
t h e P r e
-
S e n t r e s u l t s w e r e 己e e i P h e r a b l e . F o r G O T
a n d 6 P G D
,
H B 9 4 o n l y h a d e n z y m a t i e
b a n d s o f w h e a t
.
T h e a s y m m e t r i e n a t u r e
a n d th e e x i s t a n e e o f t h e n e w b a n d i n t h e s e
3 e e l l l i n e s r u l ed o u t t h e s u s P e e t i o n t h a t
t h e y m i g h t b e e h i a m e r i e m i x t u r e s o f b o t h
P a r e n t a l e e l l s d u r i n g e o l o n y f o r m a t i o n
.
R i b o s o m a l D N A s o u t h e r n a n a l y s i s o f
h y b r i d e e l l l i n e s
p r e l im i n a r y e x P e r im e n t s s h o w e d t h a t
E e o R 1 a n d H i n d 1 r e s t r i e t i o n d i g e s t e d
w h e a t a n d o a t D N A f r a g m e n t s e o u l d g e
-
n e r a t e l e n g t h P o l y m o r P h i s m w h e n h y b r i
-
d i z e d w i t h w h e a t r D N A
.
U s i n g t h e s e t w o
(
’
h r o m o s o m e n u m b e r
F i g
.
1 C h r
o m o s o m e n u m b e r f r e q u e n e y
d i s t r i b u t i o n o f p a r e n t a l a n d H B 94 h y 一
b r i d e e l l l i n e s
1期 通过 . 供体一受休”原生质体融合将裸燕麦部分核基因组转移给普通小麦 9 9
i ndi ea t e ei t h ero nl y a sm a l l a m o u n to f
O a t e ho rm o so m e s ex i st ed
,
o r s o m e o a t
e h r o m o s o m e ( s ) w
a s i n a e t i v a t e d b y i r r a d i a
-
t i o n 5 0 g e n e ( s ) l
o e a t e d o n th em ` : o u l d
n o t b e f u n e t i o n a l l y e x P r e s s e d
.
A n o t h e r f e a
-
t u r e o f t h e t w o h y b r i d e e l l l i n e s w a s t h e
u b i q u i t a s o f m i n i e h r o m o s o m e s a n d 。: h r o -
m o s om
e fr a名功 e n ts ( a r r o w e d ) i n a l l t五e
m e t a Ph a s e e e l l s
.
A s n e i t h e r P a r e n t s h a d
t h e s e e h r o m o s o m e a b e r r a t i o n s a t s u e h a
h ig h f r
e q u e n e y
,
t h e y m u s t b e t h e e o n s e叼lu e n -
e e o f i r r a d i a t i o n o n o a t P a r e n ta l e e l l s
P r i o r t o P r o t o P l a s t f u s i o n
.
D i f f e r e n t i a t i o n o f the h y b
r i d ce l l 11
-
n e s
W h
e n e e l l e l u s t e r s o f t h e 3 h y b r id
e e l l l i n e s w e r e t r a n s f e r r e d o n t o r e g e : n e r a
-
t i o n m e d i a a n d e u l t u r e d u n d e r i l l u 幻l i n a -
t i o n
, s o m e e e l l e l u s t e r s o f H B 3 9 a n d H B
9 4 e o u l d b e e o m e g r e e n i n g一 a e h a r a e t e r i s t i e
o f w h e a t P a r e n t a l e e l l s u s P e n s i o n
;
w h i l e
H B 9 5 a lw a y s r e m a i n ed w h i t e t o y 〔: l l o w
r e s e m b l i n g a P P e a r a n e e o f o a t p a r e n t t h a t
n e v e r s h o w e d a n y s i g n o f d i f f e r e n t i a t i o n
.
F u r t h e r e f f o r t s t o r e g e n e r a t e P l a n t w e r e
n o t s u e e e s s f u l
, a s n e i t h e r P a r e n t a l e e l l s u
-
s P e n s i o n h a d t o t iP o t e n e y
.
H o w e v e r
, r n a n y
lae f P r im o r d i
a a n d o t h e r i r r e g u l a r d i f f e r e n
-
t i a tde s t r u e t u r e s w e r e o b t a i n do f r o m l通B 9 4
( P l
a t e 五 , F i g . D ) . W h e n t h es e s t r ,以e t u -
r es w e r e e u t a n d t es t de f o r A d h 15 0 : z y m e
a e t i v i t y
,
t h e y s h o w de t h e s a m e b a r一d i n g
P a t t e r n a s t h e H B 9 4 e e l l l i n e t h ey d
e r i v de
f r o m
, s u g g e s t i n g t h a t th e d i f fer en
t i a tde
e e l l s w e r e n o t w h e a t b u t f u s de h y b r id
.o e l l s
,
a
dn g
e n e t i e m a t e r i a l f r o m o a t e o u l d b e s t a
-
b l y m a i n t a i n de d u r i n g th e 娜 o e es o f d i f -
f e r e n t i a t i o n m e a n 、 v h i l e d i d n o t s u P P r e s s
t h e P r o e es s
·
D I S C U S S I O N
o u r r es u l t s d e m o n s t r a t de t h a t a l t h o u g h
w h ae t
a n d o a t a r e s e x u a l l y i n e om aP
t i b l e
,
I O A a n d g a m m a 一 r a y i n a e t i v a t e d P a r e n t a l
e e l l s u s P e n s i o n P r o t o P l a s t s e o u l d e o n 1P en
-
s a t e w i t h ae
e h o rh e r m e t a b o l i e a l l y a n d d i
-
v id e t o f o r m e a l l u s e v e n t h o u g h a t t e m P t s
t o f u s e w h e a t e e l l s u s P e n s i o n P r o t o P l a s t s
a n d o a t m e s o P h y l l P r o t o P l a s t s w a s n o t
s u e e s s加 11 [ 6 〕 . o f m o r e im P o r t a n e e 15 t h e
af e t t h a t e v e n a f t e r b e i n g s u b e u l t u r e d fo r
m o r e t h a n o n e y e a r
,
t h e h y b r i d n a t u r e o f
t h e e a l l i w a s s t i l l s t a b l e
,
i n d i e a t i n g t h a t
a t l e a s t e e r t a i n a m o u n t o f g e n e t i e i n f or
-
m a t i o n o f o a t e o u l d b e s t a b l y P r e s e r v e d i n
t h e w h e a t g e n e t i e b a e k g r o u n d d u r i n g m i t o
-
5 15
.
W h
e t h e r m o r e s y m m e t r i e n u e l e a r h y
-
b r id w o u l d b eh a v e t h e s a m e 15 n o t k n o w n
.
B u t P r e v i o u s s t u d i e s o n m o d e l P l a n t s hs o
-
w e d t h a t i n P h y l o g e n e t i e a l l y r em o t e s o m a t i e
e o m b i n a t i o n s
,
h i g h d e g r e e o f a s y m m e t r y
w a s o f t e n a P r e r e q u i s i t e f o r n o r r o a l
e e l l d i v i s i o n a s w e l l a s f o r o r g a n d i f f e r e n
-
t i a t i o n a n d p l a n t r e g e n e r a t i o n 〔 7 , 吕 ]
.
I n t h e
P r e s e n t s t u d y
,
th e f a e t t h a t m o s t Po s ib l e
e e l l e o l o n i e s s t o P e d d i v id i n g a n d t w o h y
-
b r i d e a l l i
,
H B 3 6 a n d H B 3 8 a l s o e e a
-
s de t o g r o w f u r t h e r m i g h t b e t h e r es u l t o f
h i g h s y m m e t r y w h i e h e o u l d e a u s e s o am
t i e
i n e o m P a t ib i l i t y
.
S i n e e e v e n a f t e r l e t h a l d o
-
s e s o f i r r a d i a t i o n
,
l a r g e a m o u n t o f ch r o
-
m o s o m e s f r o m t h e d o n o r P a r e n t m a y b e
s t i l l r e t a i n de i n t h e r e e i P e n t g e n e t i e b a e k
-
s r o u dn
a e e o r d i n g t o p r e v i o u s i n v e s t i g a t i -
o n s [ 。 ] . I n a d i t i
o n , t h e d e g r e e o f a s y m m e t r i
-
z a t i o n W a s o f t e n a t r a n d o m r a t h e r t h a n
d e P e n di n g u P o n i r r a d i a t i o n d o s e s [
吕, 2 0 j . T h e
r e s u l t t h a t e e r t a i n a m o u n t o f f o r e i g n o a t
g e n e t i e m a t e r i a l d id n o t s u p P r es s d i f f e r e n
-
t i a t i o n a b i l i t i y o f w h ea t 钾 r e n t , a n d t h a r
t h e d i s t i n e t d i上f e r e n t i a t ed s t r u e t u r e s a l s o
e o n t a i n ed g e n e t i e i n f o r m a t i o n o f o a t w e r e
e n e o u r a g i n g
.
I t 15 r ea
s o n a b l e t o d e d u e e
t h a t by
e m P l o y i n g t o t i P o t e n t w h ea t P
r o -
t o P l a s t s a s o n e f u s i o n Pa t e n t
,
h i g h l y a s y
-
m r n e t r i e s o m a t i e n u e lae r h y b r id P l
a n t m i
-
g h t b e o b t a i n de v i a t h e
`一 d o n o r · r e e i P e n t
P r o t o P l a s t f u s i o n s y s t e m
.
A B S T R A C T
W h ae t
a n d o a t s u s P e n s i o n P r o t o P l a s t s
W er e e l e e t r o f u s de
,
a n d P u t a t i v e h y b r i d e a
-
100刘, 宝 刘大钧 25 卷
11u s 、v a s r e e o v e r e d o n t h e b a s i s o f d o u b l e
i n a e t i v a t i o n
:
b y I O A t r e a t m e n t o n w h e a t
P r o t o P l a s t s a n d g a m m a 一 r a y i r r a d i a t i o n o n
o a t e e l l s u s P e n s i o n
.
A d h i s o z y m e s e r e e n i n g
s h o w ed t h a t 5 o f t h e 7 e a l l i w e r e w i t h
e h a r a e t e r i s t i e e n z y m a t i e b a n ds o f b o t h
aP
r e n t s
.
F i v e i s o z y m e a n a l y s i s o f 3 P u t a
-
t i v e h y b r i d e e l l l i n e s e o n f i r m e d t h a t t h e y
w e r e a l l s t a b l e a s y m m e t r i e n u e l e a r h y b r id
e e l l l i n e s ; t h e y e x P r e s s e d i n t a e t e n z y m a t i e
b a n d s o f w h e a t a n d a s y m m e t r i e b a n d s o f
o a t
.
R ib o s o m a l D N A S o u t h e r n a n a l y s i s o f
2 h y b r id e e l l l i n e s ( H B 9 4
a n d H B 9 5 )
i nd i
e a t ed t h a t o n l y o n e e e l l l i n e ( H B 9 5 )
e o v e r ed b a n d s o f b o t h P a r e n t s
;
H B 9 4 o n l y
e x h i b i t e d b a n d s o f w h e a t
.
C y t o l o g i e a l o b
-
s er v a t i o n s h o w e d t h a t h y b r id e e l l l i n e s
ha d
s i g n i f i e a n t l y m o r e e h r o m o s o m e s t h a n
e i t h e r o f t h e P a r e n t s
.
D i s t i n e t d i f f e r e n t i a
-
t e d s t r u e t u r es
,
s u e h a s l e a f P r i m o d i a w e r e
o b t a i n de f r o m H B 9 4 e e l l l i n e a n d t h e y
e X P r e` s e d t h e s a m e h y b r id A dh i s o z y m e
a e t i v i t y a s t h e e e l l l i n e t h e y d e r i v e d f r o m
.
K e y w o r d s : T r 艺t i e u m a e s t云v u m L . A v e n a
n u d a L
.
P r o t o P l a s t f u s i o n
.
P a r t i a l 邵 n o 月n e t r a n s f e r .
R E F E R E N C E S
〔 1 」 C h e n , W . P . , Q . S · W u a n d D . J . L i u -
1 9 9 2 5 C a l l u s f o r m a t i o n f r o m s o m a t i e
h y b r i d i z a t i o n o f w h e a t ( T r落才哀e u m a e s才葱-
v u m L
·
) a n d R y e g r a s s ( L o乙落u m P e r e n n e 不
L
.
) b y e ] e e t r o f u s i o n
·
A e才a B o 才a 玲止c a
S玄托东e a , 3 4 : 2 8 4一 2 9 0 。
〔 2 〕 S h un , J . S · , T . G · L u a n d M · R · S o n -
d a h l
,
1 9 9 1
,
N a k e d o a t ( A , e凡 a 扑 u d a L . )
a n t h e r e u l t u r e a n d e s t a b l i s h m e n t o f h a
-
Pof i d s u s P e n s i o n e ul t u r e s
.
A e t a B o t a
-
n玄e a s东n落e a , 33 : 4 1 7一4 2 0 。
〔 3 」 W u , Q . 5 . , B . L iu a n d D . J . L iu , 19 9 3 ,
W h e a t ( T r i t乞e u m a e s才乞, u m L ) P r o t o P l a -
s t e u l t u r e a n d m o r Ph o g e n e s i s
.
J
.
N a n
-
j宫n g A g r玄. U n云, e r . , 1 6 : 1一 6 。
[ 4 〕 W e t t e r , L . a n d J . D y e k , 1 9 8 3 , I s o z y m e
a n a l y s i s o f c u l t u r e d e e l l s a n d s o m a t i e
h y b r i d s
.
I n :
“
H a n d b o味 oI P不a 玲七 C e乙乙
C u 乙才u r e ” , V o l l : 6 0 7一 6 2 5 . C o l l记 r M a e -
m i l l a n
,
L o n d o n
.
〔 5 〕 K a r p , A · , Q · 5 . W u , 5 . H . S t e e l e a n d
M
.
G
.
K
.
G o n e s
,
1 9 5 7
,
C h r o m o s o m e
v a r i a t i o n i n d i v i d i n g p r o t o p l a s t s a n d
c e l l s u s p e n s i o n s o f w h e a t
.
T h e or A P P王
G e n e 才, 74 : 14 0一 1 4 6 。
〔 6 〕 L i u , B . , Q . 5 . , W u a n d D . J , L iu , 1 9 9 4 ,
E l e e t r o f u s i o n o f w h e a t e e l l e ul t ur
e P r o
-
t o P l a s t a n d o a t m e s o p h y l l p r o t o P l a s t
·
A e才a A g r o n o机艺e a s 落n i e a , 2 0 : 3 7 0一3 7 2
〔 7 〕 B r a v o , J . E . a n d D . A . E v e n s , 1 9 8 5 ,
P r o t o P l a s t f u s i o n f o r e r o P im P r o v e m e n t
·
P Za 凡云 B r e e d艺n g R 己v艺e w s , 3 : 19 3一2 1 9 。
〔 8 〕 G l e b a , Y . Y . a n d L . R . S h lum uk o v
-
1 9 9 0
,
S e l e e t i o n o f s o m a t i e h y b r i d s
.
I n :
“
P乙a 拐t C e 正乙 L汇n e ` S e艺e e艺玄。 玲一 P r o e e d u er s
a n d A p p不艺e a 才i o n s ” : 2 5 7一 2 5 6 . V C H V e r -
la g s g e s e l l
s e h a f t m b H
.
D 一 6 9 4 0 W e i n h e im
·
[ 9 〕 G l e b a , Y . Y . , 5 . H i n n i s d a t e l s , V . A .
S i d o r o v
,
V
.
A
.
K a l e d a
,
A
.
5
.
P a r o k o n
-
n y
,
N
.
V
.
B o r y s h uk
,
N
.
N
.
C h e r e P
,
1
.
N e g r u t i u a n d M
.
J a e o b s
,
1 9 8 8 , I n t e r
-
g e n e r i e a s y m m e t r i e h y b r i d s b e t w e e n
N 艺e o 盆乞a n a P Zu机 b a g云玲 if o 乙i a a n d A忿r o P a
b e 乙Za d o n n a o b t a i n e d b y “ g a m m a 一 f u s i o n ” .
T h e or A P P乙 G e n ` t · , 7 6 : 7 6 0一了6 6 。
〔 1 0〕 Im m u r a , J · , M · W · S a u l a n d J · P o t r y -
k u s
,
1 9 8 7
,
X 一 r a y i r r a d i a t i o n P r o m o t e d
a s y m m e t r i e s o m a t i e h y b r i d i z a t i o n a n d
m o l e e ul a r a n a l y s i s o f P r o d u e t s
.
T h e or
A P P乙 G e儿 e 右· , 7 4 : 4 4 5一 4 5 0 。
1期 通过 “供体一受体 ” 原生质体融合将裸燕麦部分核基因组转移给普通小麦 工0 1
Pl a t el
F ig A
F ig
·
B
Ad h1 0 5 2, , e an a l ys i s o f 汕 ae 七(W) , o a t (o ) 朗d 3 h y b l i d e e l l l i n es . A r r洲
a n即 ban d ex i s 七ed on l y i n hyb r i ds i
n d i c a t i n g
E S t e 丈as e i s o z y me an a l y s i s o f w h e a t (脚) ,
r e fe r r i n g t o a i n e o mP l e t e ban d f r om oa t
C 6P GD
D OG T
o a t ( 0 ) an d 2 h yb r i d c e l l i i n es
. 人r r伽
ex i s t ed i n 94 hy b r i d e e l l l i n e s主s oz y m e an a l声 1 5 o f 诫ea 七(衬) , oa 仁( 0 ) 彻 d
i s o z y m e an l y
s i s o f hw e a t (W)
,
oa t (0 ) an d 3
3 h yb 工i d e e l l l i n e s
h y b l i d e e l l l i n es
E p e r ox i das e 主s o z vm e an l y
s i s o f hw a : (衬) , oa : (o ) an d 3 h yb r 主d e e l i 工主en s
9
。
,一一.1F
1期 通过 “供体一受体 ” 原生质体融合将裸燕麦部分核基因组转移给普通小麦 工 0 1
P l ate l
Fi gA
Fi g
·
B
A dh 10 52, , e an a l ys i s o f 汕 ae 七(W) , o a t (o ) 朗d 3 h y b l i d e e l l l i n es . A r r洲
a n即 ban d ex i s 七ed on l y i n hyb r i ds i
n d i c a t i n g
E S t e 丈as e i s o z y me an a l y s i s o f w h e a t (脚) ,
r e fe r r i n g t o a i n e o mP l e t e ban d f r om oa t
C 6P GD
D OG T
o a t ( 0 ) an d 2 h yb r i d c e l l i i n es
. 人r r伽
ex i s t ed i n 94 hy b r i d e e l l l i n e s主s oz y m e an a l声 1 5 o f 诫ea 七(衬) , oa 仁( 0 ) 彻 d
i s o z y m e an l y
s i s o f hw e a t (W)
,
oa t (0 ) an d 3
3 h yb 工i d e e l l l i n e s
h y b l i d e e l l l i n es
E p e r ox i das e 主s o z vm e an l y
s i s o f hw a : (衬) , oa : (o ) an d 3 h yb r 主d e e l i 工主en s
9
。
,一一.1F