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朱砂七总蒽醌体外抗单纯疱疹病毒的研究



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朱砂七总蒽醌体外抗单纯疱疹病毒的研究
赵 勤1,冯宝平2,朱萱萱3,王海丹3,袁武会1(1.陕西中医学院药理实验中心,咸阳 712046;2.陕西408厂职工医院眼科,
咸阳 712046;3.南京中医药大学附属医院,南京 210029)
摘要:目的 研究朱砂七总蒽醌(ZSQ)体外对单纯疱疹病毒的抑制作用。方法 运用单纯疱疹病毒I型(HSV-Ⅰ)和Ⅱ型(HSV-
Ⅱ),以非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为宿主细胞,通过观察感染病毒后的细胞变性反应(CPE)和 MTI比色法,检测ZSQ对单纯
疱疹病毒的抑制作用。结果 与病毒对照组相比,朱砂七总蒽醌各质量浓度组均能有效地保护感染 HSV-I和 HSV-Ⅱ病毒的
Vero细胞,抑制单纯疱疹病毒的复制,使病毒导致的细胞病变减弱。ZSQ抗 HSV-I病毒作用IC50为0.004 7g·L-1,抗病毒有
效率达90.83%,治疗指数(TI)为16.62;总蒽醌抗HSV-Ⅱ病毒作用IC50为0.006 7g·L-1,抗病毒有效率达90.06%,治疗指数
(TI)为11.66。结论 ZSQ在体外显示出明显的保护宿主细胞、抵抗单纯疱疹病毒感染的活性。
关键词:朱砂七总蒽醌;单纯疱疹病毒;抗病毒作用
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2012.06.017
中图分类号:R965   文献标志码:A   文章编号:1004-2407(2012)06-0548-03
Study on the anti-HSV activity of total anthraquinone from Zhushaqi in vitro
ZHAO Qin1,FENG Baoping2,ZHU Xuanxuan3,WANG Haidan3,YUAN Wuhui 1(1.Shaanxi Colege of Traditional Chinese Medi-
cine,Xianyang,712046,China;2.The Ophthalmology Department of 408Worker Hospital in Shaanxi,Xianyang,712046,China;3.
The Affiliated Hospital of Nanjing TCM University,Nanjing 210029,China)
Abstract:Objective To study the antiviral effects of the Zhushaqi total anthraquinone on herpes simplex virus in vitro.Methods
The influences of Zhushaqi total anthraquinone on virus reproduction effect in virus infecting cels were investigated in vitro utili-
zing the herpes simplex virus(HSV-Ⅰ,HSV-Ⅱ)and taking Vero cel as the host cel by MTT colorimetry to observe the cytopath-
ic effect.Results Compared with the virus control group,Zhushaqi-treated group could effectively protect the Vero cels infected by
HSV-Ⅰand HSV-Ⅱ,and restrain the herpes simplex virus replication,lessen the CPE induced by HSV.The IC50of the Zhushaqi
total anthraquinone against HSV-Ⅰand HSV-Ⅱ were 0.004 7g·L-1,and 0.006 7g·L-1,respectively.The anti-virus effective
rate were 90.83%,and 90.06%,respectively.The anti-virus therapeutic index(TI)were 16.62,and 11.66,respectively.Conclu-
sion Zhushaqi total anthraquinone showed significant activity of protecting host cels and antiviral effect on HSVin vitro.
Key words:Zhushaqi total anthraquinone;herpes simplex virus;antiviral
基金项目:陕西省科学技术研究发展计划资助项目(No.
2009K19-03(7)
  单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)是危
害人类身体健康的一种常见病毒,感染后很容易复
发,是一种易复发性疾病。临床上常用的治疗 HSV
感染的药物多为化学药物如:疱疹净、阿糖腺苷、阿昔
洛韦等,但这些化学药物治疗 HSV感染时,常出现
耐药现象,并且毒性较大,因此国内外学者都在不断
寻求安全有效的抗单纯疱疹病毒的新型药物[1]。近
几年来我们课题组在对太白七药朱砂七的研究中发
现,朱砂七总蒽醌具有较好的抗病毒作用。朱砂七,
别名朱砂莲、红药子,始载于《图经本草》,为蓼科植物
Polygonum cillinerve (Nakai)Ohwi的块根,其味
苦、性凉,功能清热解毒、活血凉血、止血止泻、祛风
湿、强腰膝,民间广泛用于治疗急性胃痛、胃肠炎、菌
痢、扁桃体炎、尿路感染及跌打损伤、风湿腰痛等症,
临床效果显著。在研究中我们发现其蒽醌类化合物
含量高,我们对其进行了系统研究,结果显示其具有
良好抗炎镇痛、抗流感病毒和抗肿瘤的作用。曾有实
验证明,朱砂七水浸液1∶4 000可极强地直接杀灭
和阻止单纯疱疹病毒(HSV)对细胞的吸附和侵入作
用,临床治疗病毒性角膜炎也有较好疗效。我们对其
在体外抗流感病毒的实验中发现,朱砂七总蒽醌在体
外对流感病毒有直接灭活作用[2-3]。笔者就朱砂七总
蒽醌在体外对单纯疱疹病毒Ⅰ和Ⅱ型的作用进行了
初步实验研究。
1 仪器与材料
1.1 仪器 CO2 培养箱(BB16):Beraeus公司;净化
工作台(SW-CJ-1F):苏州安泰空气技术有限公司;倒
置显微镜(XSZ-D2):重庆光学仪器厂;酶标仪(SON-
RISE):瑞士TECAN公司;细胞培养板:丹麦NUNC
公司。
1.2 试药 朱砂七总蒽醌(ZSQ):由陕西中医学院
药化教研室提供,质量分数为99%;注射用阿昔洛韦
(ACV):湖北科益药业股份有限公司,批号091206;
RPMI Medium 1640:GIBCO公司,批号307964;胰
蛋白酶:中国医药(集团)上海化学试剂公司,批号
20090602;碳酸氢钠:成都市科龙化工试剂厂,批号
20071013;小牛血清:杭州四季青生物工程材料有限
公司,批号 090512;HEPES:Biosharp 公司,批号
N10-03-30;二甲亚砜:国药集团化学试剂有限公司,
批号T20080711。
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1.3 病毒株及细胞株 单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-
Ⅰ):由中国医学科学院皮肤病研究所提供,04726;单
纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ):由中国医学科学院皮肤
病研究所提供,0446;非洲绿猴肾传代细胞(Vero):
由中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供。
2 实验方法[4-5]
2.1 单纯疱疹病毒毒力测定(TCID50的测定) 将
冻存的单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型病毒液快速冻融后,
离心,弃去上清液,加入1mL含血清培养液,吹打成
单细胞悬液,作为病毒原液。弃去长成单层Vero细
胞的96孔培养板中的旧培养液,用培养液将病毒原
液以10倍稀释成10-1~10-7的不同稀释度,接种到
Vero细胞培养板中,每孔100μL,每个浓度设6个复
孔,37℃、5%CO2 培养,同时另设正常细胞对照,每
天在倒置显微镜下观察细胞的病变效应,记录病变程
度和孔数,待细胞病变(CPE)不再进展时,按 Reed-
Muench氏法计算半数细胞感染量,即该病毒的
TCID50。
2.2 药物的细胞毒性测定(TD0 的测定) 用含
10%小牛血清的1 640培养液将Vero细胞制成细胞
悬液,接种到96孔板中,每孔100μL,待长成单层细
胞后,弃去上清换为含不同质量浓度的朱砂七总蒽醌
药物的培养液,每孔100μL,每个质量浓度设4个复
孔,37℃、5%CO2 培养箱中培养,同时设正常细胞对
照组。每天观察细胞形态变化,记录细胞病变程度
(CPE),并与正常对照组相比,以无CPE出现的最大
质量浓度作为药物对 Vero细胞的最大无毒质量浓
度(TD0)。
2.3 药物在Vero细胞中抗单纯疱疹病毒活性的测
定 将长成单层Vero细胞的96孔培养板的旧培养
液弃去,除正常对照组外,其余均接种100TCID50的
HSV-Ⅰ或 HSV-Ⅱ病毒液,37℃、5%CO2 培养箱中
吸附2h后,弃去病毒液,加入朱砂七总蒽醌(ZSQ)
最大无毒质量浓度以下倍比稀释成的5个不同质量
浓度的药液,同时设细胞、病毒和阳性药物对照组
(ACV),各组均设6个复孔,每孔0.1mL,37℃、5%
CO2 培养箱中培养,连续观察。当病毒组CPE达+
+++时,终止培养,记录各组 CPE结果,并采用
MTT染色法,用酶标仪在波长450nm处测定各孔
吸光度A值。记录结果并计算实验药物在不同质量
浓度下抑制病毒致细胞病变的百分率即药物的病毒
抑制率,同时计算药物抑制病毒的半数抑制质量浓度
IC50和治疗指数(TI)。
病毒抑制率=(药物组的平均A 值-病毒对照
组的平均A值)/(对照组的平均A 值-病毒对照组
的平均A值)×100%
治疗指数(TI)= TD50/IC50
2.4 统计学处理 实验数据统计处理用珚x±s表示,
采用t检验和Probit回归,用SPSS11.0统计软件进
行统计分析。
3 结果
3.1 病毒毒力测定 观察CPE,计算 HSV-Ⅰ和 HSV-
Ⅱ型病毒的TCID50分别为10-6.75/100μL和10
-7/100
μL。实验采用病毒质量浓度为100TCID50。
3.2 药物对细胞毒性测定 结果显示:朱砂七总蒽
醌(ZSQ)对Vero细胞最大无毒质量浓度为0.039 1
g·L-1,半数中毒质量浓度TD50为0.078 1g·L-1。
结果见表1。
表1 朱砂七总蒽醌对Vero细胞的毒性
Tab.1The toxicity of the Zhushaqi total anthraquinone on the
Vero cel
复孔
质量浓度/g·L-1
2.5  1.25  0.625 0.312 5 0.156 3 0.078 1 0.039 1 细胞对照
1 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +- +- -
2 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +- - -
3 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ - -
4 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ - -
 注:-无病变;+25%病变;++50%病变;+++75%病变;++++100%病变
3.3 药物在Vero细胞中抗单纯疱疹病毒活性的测
定 结果显示:病毒对照组出现典型的CPE特征,A
值与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。
与病毒对照组相比,朱砂七总蒽醌各质量浓度组细胞
的CPE典型特征随质量浓度增加逐渐减弱,抗病毒
抑制率逐渐增强。MTT 法观察朱砂七总蒽醌抗
HSV-Ⅰ病毒作用IC50为0.004 7g·L-1,抗病毒有
效率达90.83%,治疗指数(TI)为16.62;抗 HSV-Ⅱ
病毒作用IC50为0.006 7g·L-1,抗病毒有效率达
90.06%,治疗指数(TI)为11.66。结果表明不同质
量浓度的朱砂七总蒽醌均能明显抑制 HSV-Ⅰ和
HSV-Ⅱ的复制,保护经HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ感染的细
胞,结果见表2、表3和图1。
表2 朱砂七总蒽醌对HSV-Ⅰ的抑制、对感染后细胞CPE的
影响(珔x±s,n=6)
Tab.2The effect of the Zhushaqi total anthraquinone on HSV-
Ⅰvirus replication(珔x±s,n=6)
组别 质量浓度/g·L-1  A值 抑制率/% CPE
病毒组 0.089±0.028** ++++
正常组 0.294±0.012 -
阿昔洛韦组 0.15  0.219±0.036△△ 63.4 -
朱砂七总蒽醌组 0.026  0.275±0.012△△ 90.83 -
0.016  0.263±0.011△△ 85.18 -
0.009 3  0.240±0.011△△ 73.72 -
0.005 6  0.191±0.015△△ 49.68 +
0.003 4  0.176±0.014△△ 42.47 ++
 注:与正常组比较**P<0.01;与病毒组对照△△P<0.01;
-无病变;+25%病变;++50%病变;+++75%病变;++++100%病变
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表3 朱砂七总蒽醌对 HSV-Ⅱ的抑制和感染后细胞CPE的
影响(珔x±s,n=6)
Tab.3The effect of the Zhushaqi total anthraquinone on HSV-
Ⅱvirus replication(珔x±s,n=6)
组别 质量浓度/g·L-1  A值 抑制率/% CPE
病毒组 0.087±0.030** ++++
正常组 0.246±0.028 -
阿昔洛韦组 0.15  0.206±0.026△△ 74.84 -
朱砂七总蒽醌组 0.026  0.230±0.021△△ 90.06 -
0.016  0.216±0.091△ 81.63 +-
0.0093  0.179±0.035△△ 57.57 +
0.0056  0.151±0.019△△ 40.34 ++
0.0034  0.140±0.017△ 32.87 ++
 注:与正常组比较**P<0.01;与病毒组对照△△P<0.01,△P<0.05;
-无病变;+25%病变;++50%病变;+++75%病变;++++100%病变
图1 朱砂七总蒽醌抗HSV病毒作用
A.正常Vero细胞组;B.HSV病毒组;C.朱砂七总蒽醌组
(0.009 3g·L-1);D.阿昔洛韦组(0.15g·L-1)
Fig.1The effect of the Zhushaqi total anthraquinone on HSV
virus replication
A.Normal Vero cel group;B.HSV virus group ;C.ZSQ
group(0.009 3g·L-1);D.ACV group(0.15g·L-1)
4 讨论
单纯疱疹病毒可引起多种疾病,如口腔疱疹、疱
疹性角膜炎、生殖器疱疹、新生儿疱疹、疱疹性脑膜
炎、疱疹性脑炎及免疫功能低下患者的内脏器官疱
疹、全身性疱疹等,严重危害人类的健康。目前临床
有效的药物仅有阿昔洛韦等少数几种,而且大多毒性
和不良反应作用较大,复发率高,抗病毒谱比较窄,还
易交叉耐药,开发利用祖国中草药资源,寻找更新更
好的抗 HSV药物势在必行。本研究结果显示,朱砂
七总蒽醌在体外有抑制 HSV-Ⅰ和 HSV-Ⅱ病毒作
用,朱砂七总蒽醌抗 HSV-Ⅰ病毒作用IC50为0.004
7g·L-1,TI为16.62;总蒽醌抗 HSV-Ⅱ病毒作用
IC50为0.006 7g·L-1,TI为11.66,对Ⅰ型作用优
于Ⅱ型。以上实验结果表明,朱砂七总蒽醌对于单纯
疱疹病毒感染的治疗具有一定的应用和开发前景,该
药在动物体内的作用及可能的抗病毒机制尚需进一
步证实。
参考文献:
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(收稿日期:2012-05-18)
阿扑西林在小鼠体内抑菌作用研究
罗阿利1,陈静茹2,申 昕2,宋延平3(1.陕西省新药审评中心,西安 710065;2.陕西中医学院,咸阳 712046;3.陕西省中医
药研究院,西安 710003)
摘要:目的 观察阿扑西林对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的体内抗菌作用。方法 以最小致死量的金黄色葡萄球菌(7.5×
107 个)、铜绿假单胞菌(7.5×107 个)腹腔注射感染小鼠,2h后尾静脉注射阿扑西林,1d1次,连续3d,连续7d观察感染小鼠
的生存期及致死率。结果 感染金黄色葡萄球菌的小鼠生存期为2.83±0.94d,致死率为100%。哌拉西林钠及试品1.33,0.668
和0.332g·kg-1的生存期分别为6.25±0.75,6.33±0.78,5.42±1.24和4.42±1.62d(P<0.01),致死率分别为58.33%,50.00%,
66.67%和75.00%;感染铜绿假单胞菌的小鼠生存期为2.75±1.06d,致死率为100%,而哌拉西林钠及本品1.33,0.668和0.332
g·kg-1的生存期分别为6.33±0.89,6.42±0.79,6.17±1.03和4.83±1.64d(P<0.01);致死率分别为50.00%,41.67%,58.33%
和66.67%。结论 阿扑西林对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有一定的抗菌作用,且在同等剂量下优于哌拉西林钠。
关键词:阿普西林;金黄色葡萄球菌;铜绿假单胞菌;哌拉西林钠
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2012.06.018
中图分类号:R965   文献标志码:A   文章编号:1004-2407(2012)06-0550-04
基金项目:陕西省卫生厅科研基金项目(编号:2010B05)
055 西北药学杂志 2012年11月 第27卷 第6期