全 文 ：水翁花提取物的 PPARγ配体活性鉴定
金晓辉1 ,2 , 3 , 魏孝义1 , 黄志伟2 , 吴东海2＊
(1.中国科学院华南植物园 ,广东广州 510650;2.中国科学院广州生物医药与健康研究院,广东广州 510663;3.中国科学院研究生院 ,北京 100049)
摘要　[目的]鉴定水翁花提取物 2 , 4-二羟基-6-甲氧基-3, 5-二甲基查耳酮(DMC)的 PPARγ配体结合活性及其特点。[方法]用GAL4嵌合
体报告基因试验检测DMC的 PPARγ配体结合活性;用油红O染色法检测DMC对 3T3-L1前脂肪细胞分化的影响;用[ 3H] -2-脱氧葡萄糖
摄取试验检测DMC对 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响;用荧光实时定量 PCR检测经DMC处理的3T3-L1脂肪细胞中PPARγ靶基因的
表达情况。[结果]DMC能以剂量依赖型的方式对 PPARγ产生激活作用 ,促进脂肪细胞的分化 ,显著提高脂肪细胞的葡萄糖摄取率 ,并且
提高脂肪细胞中一些 PPARγ靶基因的表达量。[结论] DMC能通过激活 PPARγ促进脂肪细胞的葡萄糖摄取。
关键词　水翁花;PPARγ;葡萄糖摄取
中图分类号　S571.9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)21-09106-04
Identify and Characterize the PPARγLigand-binding Activity of Extracts of Cleistocalyx Operculatus
JIN Xiao-hui et al　(South China Botanical Garden , ChineseAcademy of Sciences , Guangzhou ,Guangdong 510650)
Abstract　[ Objective] To identify and characterize the peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ)ligand-binding activity of 2 , 4-dihydroxy-6-
methoxy-3 , 5-dimethylchalcone, a chalcone derivative extracted from the dried flower of Cleistocalyx operculatus.[Method] The PPARγ-transactivation ac-
tivity of DMC was examined by using a GAL4 hybrid reporter gene assay.The effect of DMC on adipogenesis was measured by oil red O staining.The glu-
cose uptake ratewas measured by using [ 3H]-2-deoxy glucose in 3T3-L1 adipocytes after treatment with DMC.The effect of DMC on expression of PPARγ
target genes in differentiated 3T3-L1 adipocytes was examined by real-time PCR.[ Results] DMC can selectively activate PPARγwith a dose-dependent
manner.Result of oil red O staining showed that DMC can promote adipocyte differentiation.DMC can also strongly enhance glucose uptake in 3T3-L1
adipocytes.Furthermore , the result of real-time PCR showed the DMC can modulate some PPARγ-responsive genes in differentiated 3T3-L1 adipocytes.
[ Conclusion] Our data establish DMC as a natural PPARγligand with capability of promoting glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes.
Key words　Cleistocalyx operculatus;PPARγ;Glucose uptake
基金项目　国家自然科学基金资助项目(30670457);国家 973 计划资
助项目(2004CB720102)。
作者简介　金晓辉(1978-),男 ,浙江温州人 ,硕士研究生, 研究方向:
代谢疾病的分子机理。 ＊通讯作者。
收稿日期　2008-05-04
　　过氧化物酶体增长因子活化受体(peroxisome proliferator-
activated receptor , PPAR)是一类由配体激活的核转录因子 ,属
于核受体超家族成员。目前已发现 PPAR存在 3种亚型 ,分
别为PPARα、PPARβ(δ)和PPARγ,其中 PPARγ主要存在于脂
肪组织中[ 1] 。由于PPARγ是调节胰岛素信号转导和糖脂代
谢等的关键因子[ 2] ,也是治疗心血管疾病 、糖尿病以及多种
癌症的主要靶分子 ,因而 ,近年来PPARγ的配体成了抗糖尿
病药物研究的热点。
水翁花为桃金娘科植物水翁 [ Cleistocalyx operculatus
(Roxb.)Merr.et Perry]的干燥花蕾 ,具有清热解毒 、祛暑生津 、
消滞利湿的功效[ 3] ,也是我国南方地区凉茶的主要原料之
一。水翁花提取物的主要成分为有机酸和黄酮类 ,其中黄酮
类包括 5 ,7-二羟基-6 ,8-二甲基黄烷酮 、7-羟基-5-甲氧基-6 ,8-
二甲基黄烷酮和 2 , 4-二羟基-6-甲氧基-3 ,5-二甲基查耳酮[ 3] 。
我们通过GAL4嵌合体报告基因试验对包括水翁花的黄酮类
提取物在内的40多种天然化合物进行筛选 ,发现 1种水翁花
的黄酮类提取物 ,即 2 ,4-二羟基-6-甲氧基-3 ,5-二甲基查耳酮
(2 ,4-dihydroxy-6-methoxy-3 , 5-dimethylchalcone , DMC)(图 1)具
有明显的 PPARγ配体结合活性 。在此基础上 ,笔者通过一系
列体外试验对DMC的作用机制进行了进一步的探讨。
1　材料与方法
1.1　供试材料
1.1.1　药品和主要试剂。DMC 由中国科学院华南植物园提
供(溶于 DMSO中保存);罗格列酮为葛兰素史克有限公司产
品(溶于 DMSO中保存);DMSO为AMRESCO公司产品;脂质
体(Lipofectamine 2000)、高糖DMEM培养基 、OPTI-MEM培养基
以及胎牛血清(FBS)均为 invitrogen公司产品;双荧光素酶检
测试剂盒和逆转录试剂盒为Promega公司产品;胰岛素 、地塞
米松 、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)以及油红O均为 Sigma
公司产品;3H-2-脱氧葡萄糖购自中国同位素总公司;Trizol 试
剂 、SYBR Premix Ex Taq 和RNase free dH2O均为宝生物(大连)
有限公司产品 。
图 1　DMC的结构式:2 , 4-二羟基-6-甲氧基-3 , 5-二甲基查耳酮
Fig.1 　Structure of DMC:2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimet-
hylchalcone
1.1.2　细胞和质粒。293T细胞 、3T3-L1细胞购自 ATCC 公
司;萤火虫荧光素酶(Firefly-Luc)报告基因质粒 pFR-Luc为
Stratagene公司产品;海肾荧光素酶(Renilla-Luc)报告基因质
粒 pRL-TK-Renilla 为 Promega 公司产品;PPARγ表达质粒
(GAL4-PPARγ-LBD)由中国科学院广州生物医药与健康研究
院黄志伟研究组构建得到 。
1.1.3　主要仪器 。美国 Turner Biosystems公司荧光照度计
Veritas Microplate luminometer;美国BIOTEK公司 Synergy HT酶
标仪;美国 Perkin Elmer 公司TRI CARB 2800TR液体闪烁分析
仪;美国 bio-rad公司 4-color Real-time PCR System荧光实时定
量 PCR仪。
1.2　试验方法
1.2.1　GAL4 嵌合体报告基因试验。将对数生长期的 293T
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(21):9106-9109　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　李菲菲　责任校对　况玲玲
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.21.146
细胞以每孔 1.5×104个接种于 96孔培养板 ,培养过夜 ,细胞
长到 80%～ 90%满时用于转染。用OPTI-MEM培养基分别稀
释Lipofectamine 2000(体积比是 0.5∶100)和质粒DNA ,将稀释
后的脂质体和质粒 DNA 以等体积混合 ,室温放置 20 min后
对细胞进行瞬时共转染 ,转染的质粒 DNA 用量分别为:
GAL4-PPARγ-LBD每孔25ng , pFR-Luc每孔 50 ng , pRL-TK-Re-
nilla每孔 5 ng。转染后孵育 4 h再加药 ,试验组加入浓度从 1
nmol/L到 10 μmol/L的 DMC ,正常对照组加入同样体积的
DMSO ,加药 24 h之后检测荧光素酶活性 ,分别用荧光照度计
读取Firefly-luc与Renilla-luc的荧光值 ,以 Firefly-luc与 Renil-
la-luc的比值作为活性测定结果。
1.2.2　3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化。3T3-L1前脂肪细胞
培养于 10%FBS高糖 DMEM ,培养条件为 37 ℃, 5%CO2。细
胞生长至完全融合后 2 d ,换成诱导液(含 200 nmol/L胰岛素 、
1 μmol/L 地塞米松 、0.5 mmol/L IBMX 的 10%FBS 高糖
DMEM)诱导 2 d ,然后换成含200nmol/L胰岛素的 10%FBS高
糖DMEM继续诱导 2 d ,之后换成 10%FBS 高糖 DMEM ,隔天
换液 1次。
1.2.3　油红O检测DMC对 3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。
24孔板培养的 3T3-L1前脂肪细胞生长至完全融合后 2 d ,换
成诱导液(含 200 nmol/L胰岛素 、1 μmol/L地塞米松的 10%
FBS高糖 DMEM)培养 ,同时每孔分别加入终浓度为 1、5和 10
μmol/L的 DMC ,加DMSO的孔作为正常对照 ,诱导 3 d后 ,换
成含 200 nmol/L胰岛素的 10%FBS高糖 DMEM 。2 d后进行
油红O染色:吸去全部培养基 ,PBS洗涤 1次 ,用 10%甲醛将
细胞固定 24 h ,弃去固定液 ,用 60%异丙醇洗涤 1次 ,等细胞
充分干燥后加入油红 O溶液 ,室温下染色 30 min ,弃去染色
剂 ,用 dH2O洗涤 4次 ,干燥后用 100%异丙醇萃取 ,萃取后的
染液转移到新的 24孔板 ,用酶标仪读取 A500 nm的值。
1.2.4　3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取试验。将 24孔培养板
中诱导后 8 d的 3T3-L1脂肪细胞分别用 5 μmol/L的DMC和
5 μmol/L的罗格列酮处理 48 h ,DMSO处理的细胞作为正常
对照。在进行葡萄糖摄取试验之前 ,将细胞换成含 0.1%FBS
的DMEM培养基饥饿培养 2 h ,洗去培养基 ,PBS 洗涤细胞 3
次 ,换成含 2%BSA的KRH缓冲液(20 mmol/LHEPES , pH值
7.4;136 mmol/L NaCl;4.7 mmol/L KCl;1.25 mmol/L MgSO4;
1.25 mmol/L CaCl2)37 ℃孵育 30 min 。将细胞分为 2组 ,一组
加入终浓度为 200 nmol/L的胰岛素继续 37 ℃孵育 30min ,另
一组不加胰岛素继续 37 ℃孵育 30 min ,随后每孔加入 20 μl
含 1.6 μCi[ 3H]-2-脱氧葡萄糖的 2-脱氧葡萄糖混和液 ,37 ℃
孵育 10 min后迅速吸去孵育液 ,冰冷PBS 洗涤细胞 3次 ,室
温下等细胞充分干燥后用闪烁液吹打裂解细胞 ,将裂解液转
移到 5 ml闪烁管中 ,用液体闪烁分析仪读取CPM值。
1.2.5　总 RNA的提取 、cDNA合成以及荧光实时定量 PCR
试验。将 12孔培养板中诱导后 6 d的 3T3-L1脂肪细胞分别
用 1μmol/L的DMC和 1μmol/L的罗格列酮以及 DMSO处理
24 h ,用Trizol 法提取细胞的总 RNA。总 RNA提取产物经凝
胶电泳鉴定 ,用紫外分光光度计检测浓度。取每个样品的
RNA 2μg逆转录成 cDNA 。荧光实时定量PCR的热循环条件
为:首先 95 ℃变性 5min ,然后 95 ℃15 s ,60 ℃20 s ,70 ℃1 s
循环 40 次。检测的基因包括:PPARγ、aP2(adipocyte fatty
acid-binding protein)、PEPCK(phosphoenol pyruvate carboxyki-
nase)、LPL(lipoprotein lipase)、C/EBPα(CAAT/enhancer binding
protein-α)、CD36 、CAP(c-cbl associated protein)、IRS2(insulin re-
ceptor substrate 2)以及作为内参照的 GAPDH ,所用的引物由上
海英骏生物技术有限公司合成 ,引物序列见表 1 ,试验结果用
待测基因与 GAPDH的相对比值表示 。
表1　定量PCR的引物序列
Table 1 Primer sequence of real-time PCR
基因Gene 5′引物5′primer(5′to 3′) 3′引物3′primer(5′to 3′)
PPARγ AGTGTGAATTACAGCAAATCT TTCGCTGATGCACTGC
aP2 GAATTCGATGAAATCACCGCA CTCTTTATTGTGGTCGACTTTCCA
PEPCK TCATCATTACCCAAGAGCAAAG CTTTCATGCACCCTGGAAAT
LPL GGCTAACCCAGGGTGAGGAA TGTTTCTCCTGCCTGATGTCTTC
C/EBPα CCAAGAAGTCGGTGGACAAGA CGGTCATTGTCACTGGTCAACT
CD36 TCCAGCCAATGCCTTTGC TGGAGATTACTTTTTCAGTGCAGAA
CAP GGATTACATCGACCTGCCTTATTC TTGAGGTTGCTGTGGGCTC
IRS2 GTGCTAAGGTCATCCGTGCAGA GGCGATATAGTTGAGGCCGTTC
GAPDH AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC TCCACCACCCTGTTGCTGTA
注:与 DMSO 处理的 293T细胞相比 , P<0.05
Note:Compared with 293T cell in DMSO treatment , P<0.05.
图2　293T细胞 GAL4-PPARγ-LBD嵌合体反式激活试验中 DMC
对 PPARγ配体结合区活性的影响
Fig.2　Effects of DMC on PPARγligand-binding activity in GAL4-
PPARγ-LBD transactivation assay in 293T cell
注:与 DMSO处理的 3T3-L1脂肪细胞相比 , P<0.05
Note:Compared with 3T3-L1 adipocytes in DMSO treatment , P<0.05.
图 3　DMC在 3T3-L1前脂肪细胞中对脂肪生成的影响
Fig.3　Effects of DMC on adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes
1.3　统计学处理　试验数据用 x±s表示 ,用 SPSS 13.0进
行统计学处理。组间差异显著性采用单因素方差分析 ,P <
0.05表示有显著差异。
2　结果与分析
2.1 　DMC 具有 PPARγ的配体结合活性　293T 细胞的
910736卷 21期　　　　　　　　　　　　　　　　金晓辉等　水翁花提取物的PPARγ配体活性鉴定
GAL4-PPARγ-LBD嵌合体报告基因试验结果显示了 DMC能
以剂量依赖型的方式激活 PPARγ(图 2),DMC 作用的半数最
大效应浓度(EC50)约为 5 μmol/L ,在 DMC 浓度为 10 μmol/L
时报告基因活性达到了最大值 ,约为DMSO对照组的 12倍。
2.2　DMC能促进 3T3- L1前脂肪细胞的分化　A500nm的数
值代表了细胞中的甘油三酯含量 ,如图 3所示 ,分化过程中
用DMC处理的细胞的甘油三酯含量明显高于用 DMSO处理
的正常对照组 ,且随着DMC浓度的提升 ,甘油三酯含量也随
之增加。表明了 DMC能促进 3T3-L1前脂肪细胞的分化 ,且
作用方式呈量效关系 。
2.3　DMC能显著促进 3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取 　如
图 4所示 ,在不加胰岛素或加 200 nmol/L短效胰岛素的情况
下 ,DMC都能显著提高 3T3- L1脂肪细胞的葡萄糖摄取量 ,相
对于 DMSO处理的正常组 ,2个DMC处理组的葡萄糖摄取量
分别达到了 186%和 353%,并且都超过了罗格列酮处理组。
2.4　DMC能提高一些 PPARγ靶向基因的表达量 　如图 5
所示 ,DMC 能提高 PPARγ、aP2、LPL 、C/EBPα、CAP 和 IRS2
的表达量 ,其中 PPARγ和 aP2的表达量都超过正常组的 2
倍 ,但是 aP2的表达量明显低于罗格列酮组 。同时也发现 ,
DMC不能提高PEPCK的表达量 ,对 CD36的表达量的提高也
不具统计学意义。
注:与 DMSO处理的 3T3-L1脂肪细胞相比 , P<0.05。
Note:Compared with 3T3-L1 adipocytes in DMSO treatment , P<0.05.
图5　DMC干预的 3T3-L1脂肪细胞中的基因表达情况。
Fig.5　Gene expression of 3T3-L1 adipocytes under DMC
3　讨论
PPARγ与配体结合而被激活后 ,能与维甲酸类受体 X
(retinoid X receptor , RXR)形成异二聚体 ,作用于靶基因上游
的PPAR反应元件(PPAR-responsive element , PPRE),从而调节
目的基因的转录。PPRE存在于多种与糖脂代谢有关的基因
中 ,如 aP2、LPL 、PEPCK 等 ,这些 PPARγ靶基因直接或间接
参与许多病理和生理过程 ,如能量平衡 、细胞分化 、糖脂代
谢 、改善胰岛素抵抗等。因此 ,以 PPARγ为靶点的化合物已
成为改善胰岛素抵抗从而治疗 2型糖尿病的药物开发的热
点。噻唑烷二酮(TZD)类药物 ,如罗格列酮和吡格列酮等 ,是
目前以 PPARγ为靶点的治疗 2型糖尿病的代表药物。但是
这些药物在临床应用上通常会带来体重增加 、浮肿 、增加充
血性心力衰竭的机率等[ 4]不良后果。因此 ,近年来 2型糖尿
病的药物研究集中在寻求具有与TZD类药物有相似疗效但
毒副作用更小的 PPARγ配体上。
一些传统中药运用于人们对肥胖和糖尿病的经验治疗
中已经有很悠久的历史 ,近年来也有一些关于某些中药提取
物具有 PPARγ配体活性的报道 ,如三白草的提取物[ 5] 、啤酒
花的提取物[ 6]以及大黄素[ 7] 等。水翁主要生长在我国南方
地区 ,近年来的研究结果表明 ,水翁花的提取物具抑制ATP
酶[ 8] 、抗肿瘤[ 9-11] 、抗氧化[ 11-12] 和抗高血糖的活性[ 13] 以及
能够阻断血管内皮生长因子受体的信号通路[ 9] ,但目前还没
有关于这些提取物具有 PPARγ配体活性的报道。在笔者的
研究中 ,我们的GAL4嵌合体报告基因试验结果表明了水翁
花的黄酮类提取物DMC具有明显的 PPARγ配体结合活性 。
PPARγ是调节脂肪细胞分化的关键因子 , PPARγ的激
活能促进脂肪细胞分化 ,但这也正是TZD类药物在临床应用
中使患者体重增加的主要原因。在笔者的研究中 ,我们在
3T3-L1前脂肪细胞分化的过程中分别加入不同浓度的 DMC ,
结果显示了DMC 能促进脂肪细胞分化 ,且作用效果呈量效
关系 。但是 ,我们也在另外的一些试验中发现 ,DMC 促进脂
肪细胞分化的能力明显弱于相同浓度的罗格列酮。
脂肪细胞对葡萄糖的摄取受胰岛素的调控 ,罗格列酮等
9108 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
PPARγ激动剂能提高脂肪和肌肉等组织对胰岛素的敏感性 ,
促进这些组织对葡萄糖的摄取 ,从而降低机体的血糖浓度。
在该研究中 ,我们发现DMC 可显著促进 3T3-L1脂肪细胞的
葡萄糖摄取 ,在浓度为 200 nmol/L的胰岛素存在的情况下效
果尤其明显 ,甚至超过了相同浓度的罗格列酮的作用效果。
大量证据表明 ,调节 PPARγ的活性能改变脂肪细胞中
多种基因的表达量。在该研究中 ,我们用定量PCR检测了经
过浓度为 1 μmol/L的 DMC处理的 3T3-L1脂肪细胞中几种公
认的PPARγ应答基因 mRNA的表达量 ,并将结果与相同浓度
的罗格列酮处理的脂肪细胞进行比较。结果发现 ,DMC能在
一定程度上提高 PPARγ、aP2、LPL 、C/EBPα、CAP 和 IRS2的
表达量 ,但是 aP2的表达量提高的程度明显低于罗格列酮处
理的细胞 ,由于 aP2是脂肪形成的主要标志性基因 ,因此这
个结果与之前的脂肪细胞分化结果相符 ,表明了 DMC 的生
脂肪能力相对于罗格列酮较弱。另外 , DMC 不能提高
PEPCK和 CD36这 2种与脂肪酸储存和转运有关的基因表
达量 ,而罗格列酮对这 2种基因表达量都有明显的提高 ,这
一结果更加说明了DMC相对较弱的生脂肪能力 。
以上所有结果表明了DMC能通过激活 PPARγ促进 3T3-
L1脂肪细胞的葡萄糖摄取 ,同时也提示了 DMC较之于 TZD
类药物 ,可能在治疗上不会引起大量的体脂聚积 ,因此也不
会造成明显的体重增加现象。
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(上接第 9062页)
果主要用于肝胆系统 、骨骼系统疾病的诊断。区别骨型碱性
磷酸酶和肝型碱性磷酸酶活性相当困难。这是因为这 2种
同工酶来源于同一基因 ,其动力学性质 、电泳迁移率和其他
理化性质均十分相似 ,且相互间有交免疫反应。目前鉴别和
定量测定骨型碱性磷酸酶的方法有电泳法和非电泳法[ 3] 。
非电泳法有化学抑制法 、热稳定试验 、亲和沉淀法和免疫分
析法等。目前人医方面常采用热稳定试验测定血清碱性磷
酸酶保存率 ,以区别碱性磷酸酶是来自骨骼还是肝脏 。来自
肝脏的保存率均在 34%以上 ,而来自骨骼的保存率低于
26%[ 4] 。该试验结果表明 ,测定的奶牛和绵羊血清碱性磷酸
酶保存率均低于 26%,说明该碱性磷酸酶来自骨骼。
(2)当动物缺钙 、磷或钙磷比例不当而引起骨营养不良
时 ,随着血钙含量的下降 ,甲状旁腺激素含量上升 ,促进肾脏
合成 1 , 25-(OH)2VD3 ,使得静止的成骨细胞转变为活跃的成
骨细胞 ,合成大量的碱性磷酸酶释放入血;另一方面 ,由于钙
摄入不足 ,生成的类骨组织不能被钙化 ,成骨细胞不能转化
为骨细胞 ,成骨细胞反馈性增生活跃 ,其合成的碱性磷酸酶
释放入血 ,造成血中碱性磷酸酶活性升高。因此 ,碱性磷酸
酶活性是反映骨代谢状况的最好的系列化指标[ 1-3] 。从该
试验结果来看 ,奶牛和绵羊血清碱性磷酸酶活性与卢宗藩等
报道的正常值[ 5-7] 没有明显差异(P >0.05),说明该次测定
的奶牛和绵羊骨营养状况良好;但奶牛怀孕中期的碱性磷酸
酶活性比未怀孕 、怀孕前期 、怀孕后期明显降低(P <0.05)。
引起这种变化的原因是否与胎儿发育有关 ,有待进一步
研究 。
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