全 文 ：ＨＰＬＣ法测定水翁花中熊果酸的含量
何凌云
（广州市药品检验所 四分所，广东 广州５１００００）
摘　要：目的：采用 ＨＰＬＣ法测定水翁花中的熊果酸含量。方法：采用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ），以
Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ－Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）为色谱柱，以乙腈－０．０５％磷酸（６０∶４０）为流动相进行梯度洗脱，检
测波长２５４ｎｍ，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ，柱温２５℃。结果：采用 ＨＰＬＣ法测定了８批药材熊果酸含量，熊果酸浓
度为５～１００μｇ／ｍＬ时线性良好。结论：该方法准确、快速、高效，可作为水翁花药材的质量控制。
关键词：水翁花；熊果酸；ＨＰＬＣ；含量测定
中图分类号：Ｒ２８４．１　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１６）１０－００２０－０３
ＤＯＩ：１０．１１９５４／ｙｔｃｔｙｙ．２０１６１０００９
收稿日期：２０１６－０１－１８
作者简介：何凌云（１９８０－），女，广州市药品检验所四分所主管药师，研究方向为药品质量标准和中药化学成分的提取与测
定。
ＨＰＬＣ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｕｒｓｏｌｉｃ　Ａｃｉｄ　ｉｎ　Ｃｌｅｉｓｔｏｃａｌｙｘ　Ｏｐｅｒｃｕｌａｔｕｓ　Ｆｌｏｗｅｒ
Ｈｅ　Ｌｉｎｇｙｕｎ
（ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｂｒａｎｃｈ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｄｒｕｇ　Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　Ｏｆｆｉｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　Ｃｌｅｉｓｔｏｃａｌｙｘ　ｏｐｅｒｃｕｌａｔｕｓ　ｆｌｏｗｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ＨＰＬＣ　ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｉｎ　Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ－Ｃ１８（５μｍ，２５０×４．６ｍｍ）ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－０．０５％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ｂｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｄｅ－
ｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｗａｓ　ｓｅｔ　ａｔ　２５４ｎｍ；ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｌｕｍ　ｔｅｍｐｅｒａｒｕｒｅ　ｗａｓ　ｋｅｐｔ　ａｔ　２５℃．Ｒｅｓｕｌｔｓ：８ｂａｔ－
ｃｈｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｒｂ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ｔｏ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｗｅｒｅ　ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ
ｗａｓ　ｐｒｅｃｉｓｅ，ｆａｓｔ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｌｅｉｓｔｏｃａｌｙｘ　ｏｐｅｒｃｕｌａｔｕｓ　ｆｌｏｗｅｒ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｌｅｉｓｔｏｃａｌｙｘ　Ｏｐｅｒｃｕｌａｔｕｓ　Ｆｌｏｗｅｒ；Ｕｒｓｏｌｉｃ　Ａｃｉｄ；ＨＰＬＣ；Ｃｏｎｔｅｎｔ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
　　水翁花始载于《岭南采药录》，主分布于广东、海南、广
西、福建等地，具有清热解暑、生津止渴、去湿消滞之功效，
可用于治疗夏天暑湿食滞所致的发热、咽干、口渴腹胀或呕
吐泄泻［１］。常作为夏季消渴解暑的中药复方“清热凉茶”的
主要原料之一，在民间使用较为广泛，为岭南地区的代表药
材之一。
目前，关于水翁花的研究主要集中在其药理活性、化学
成分提取等方面［１］。陈建等［２］利用水蒸汽蒸馏（ＳＤＥ）、超临
界ＣＯ２萃取技术（ＳＦＥ）法提取水翁花的挥发油。Ｃｈｕｎ－Ｌｉｎ
Ｙｅ等［３］采用气相色谱及气质联合色谱等分析技术从水翁花
中提取分离５种黄酮类化合物。药理学研究方面，罗清等［４］
研究表明，水翁花具有镇痛、抗内毒素的作用；程少璋等［５］
研究证实，水翁花具有抗炎镇痛解热的作用；叶春林等［６］研
究表明，水翁花中黄酮（ＤＭＣ）成分可够诱导肝癌细胞
ＳＭＭＣ－７７２１凋亡。目前，迄今为止，水翁花中化学成分的
研究仍停留在分离鉴定的阶段，尚未形成规范、准确的指标
性成分含量测定方法［８－９］。
水翁花的各类活性成分以黄酮类化合物的含量较大，
熊果酸又是其中较为代表性的成分［９－１０］。由于水翁花并非
药典收载品种，《广东省药材标准》也仅规定了性状鉴别等
项目［１１］。本研究基于现有成熟的 ＨＰＬＣ法，测定水翁花中
熊果酸含量，建立全面、实用、专属性强的水翁花质量含量
测定方法。
１　材料与方法
１．１　仪器、试药
含量测定所用高效液相色谱仪为 Ｗａｔｅｒｓ　ｅ２６９５－２４８９，
色谱柱为Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ－Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ ，５μｍ）；磷酸、甲
醇、乙腈（均购自 Ｍｅｒｃｋ）等为色谱纯，其余试剂为分析纯
（购自广州化学试剂厂），水为自制 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ超纯水。
Ｍｅｔｔｌｅｒ　ＸＳ２０５ＤＵ电子分析天平、ＡＤＡＭ　ＣＢ１０１天平
（１　０００ｇ×０．１ｇ）。水翁花药材（产地批号见表１）共８批，均
购于广州市中芝源中药有限公司。熊果酸对照品（批号：
—０２—
１１０７４２－２００３１４）购自广东省食品药品检验所。
１．２　色谱条件
以Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ－Ｃ１８（５μｍ，２５０×４．６ｍｍ）为色谱柱，以乙
腈（Ａ）－０．０５％磷酸（Ｂ）为流动相，采用梯度洗脱，梯度程序
为０～１０ｍｉｎ，１０％Ａ∶９０％Ｄ；１０～２０ｍｉｎ，３０％Ａ∶７０％Ｂ；
２０～５０ｍｉｎ，６０％Ａ∶４０％Ｂ；５０～６０ｍｉｎ，１０％Ａ∶９０％Ｂ。所
检测波长２５４ｎｍ；流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ；柱温２５℃；所有样品进
样量均为１０μＬ。对照品色谱见图１。
图１　熊果酸对照品ＨＰＬＣ色谱（５０μｇ／ｍＬ）
１．３　溶液制备
１．３．１　对照品溶液的制备　分别取熊果酸对照品１０ｍｇ，
精密称定，置１０ｍＬ量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得２种化
合物浓度均为１ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液。
１．３．２　供试品溶液的制备　取本品３ｇ，加入７０％甲醇
７５ｍＬ，室温下静置提取１天。过滤，取续滤液作为供试品溶液。
２　结果
２．１　标准曲线与线性
精密吸取“１．３”项对照品溶液适量，置１０ｍＬ容量瓶中，
加甲醇稀释至刻度，分别配制成５、１０、２０、５０、１００μｇ／ｍＬ的
溶液。分别精密吸取上述溶液１０μＬ进样，记录各浓度点色
谱峰峰面积积分值。以对照品溶液浓度（μｇ／ｍＬ）为横坐标
Ｘ，峰面积积分值为纵坐标 Ｙ，绘制标准曲线，得回归方程
为：熊果酸：Ｙ＝２２　０４５　Ｘ－２７　６７６（ｒ２＝０．９９９　３）。结果表
明，熊果酸浓度为５～１００μｇ／ｍＬ时线性良好，可准确定量。
２．２　精密度试验
精密吸取同一批号药材供试品溶液１０μＬ，按“１．２”项色
谱条件连续进样６次，记录熊果酸峰面积积分值，并计算
ＲＳＤ。结果显示：６次测定所得的日间精密度为１．３％，日内
精密度为２．０％，表明该方法精密度良好。
２．３　重复性试验
称取同一批号的样品（批号：１４１００１－４）６份，按“１．３”项
供试品溶液的制备方法处理，按“１．２”项色谱条件分别进样
１０μＬ，测定峰面积并计算ＲＳＤ。结果显示，熊果酸的ＲＳＤ
为１．５％，表明该方法重复性良好。
２．４　加样回收实验
取同一批已知含量的药材样品（批号：１４１００１－１４００４）
３ｇ，精密称定５份，按“１．３”项供试品溶液的制备方法处理，
精密吸取续滤液５ｍＬ，再精密加入１００μｇ／ｍＬ对照品溶液
１ｍＬ，用甲醇稀释至刻度。精密吸取上述溶液１０μＬ，按
“１．２”项色谱条件分析，测定峰面积，计算含量及回收率，该
方法回收率良好，可对水翁花中的熊果酸成分进行准确定
量。结果见表１。
表１　熊果酸加样回收实验结果
样品 取样量（ｇ） 加入熊果酸对照品量（μｇ／ｍＬ） 测得熊果酸含量（μｇ／ｍＬ） 回收率（％） 平均回收率（％） ＲＳＤ（％）
１　 ３．０２６　 １０　 ４０．５３１　 １０１．５１
２　 ３．０４４　 １０　 ４０．６７９　 １０２．９９
３　 ３．０９６　 １０　 ３９．８８３　 ９５．０３　 １０１．１１　 ３．４２
４　 ３．０７０　 １０　 ４０．６５２　 １０２．７２
５　 ３．１３８　 １０　 ４０．７０８　 １０３．２８
２．５　不同批次、产地水翁花中熊果酸含量的测定
取不同产地，批次的水翁花药材，共８批，按“１．３”项供
试品溶液的制备方法处理，得供试品溶液，分别精密吸取上
述供试品溶液１０μＬ，注入 ＨＰＬＣ，按“１．２”项色谱条件分析
测定，记录熊果酸和ＤＭＣ峰面积并计算含量。含量测定结
果见表２、图２。
—１２—
表２　不同水翁花含量测定结果
批号 熊果酸含量（ｍｇ／ｇ）
广东１４１００１－１　 １．３５１
广东１４１００１－２　 １．５４５
广东１４１００１－３　 １．２２４
广东１４１００１－４　 １．３１２
广东１４１００１－５　 １．５１９
广西１４１００１　 １．１２６
海南１４１００１　 １．７５０
云南１４１００１　 １．０２１
３　讨论
３．１　色谱条件优化
文献结果显示，水翁花中所含活性成分多为黄酮类。
结合预实验结果发现，有机相采用乙腈时，较甲醇分离效果
更佳，且出峰时间较短，故选用；在水相选择方面，研究发
现，向水相中加入一定浓度的磷酸有助于改善峰型，提高分
离度，但磷酸浓度过高易对色谱柱产生损伤，经反复试验，
磷酸浓度固定在０．５％（Ｖ／Ｖ）。
洗脱程序选择方面，鉴于水翁花中所含活性成分较多，
且结构较为类似，单纯的等度洗脱难以将待测物与其他干
扰性成分成果区分，因此选择梯度洗脱。经反复试验，色谱
条件可成功区分待测物与其他干扰性成分，故选用。
３．２　不同批次、产地水翁花中熊果酸含量差异分析
不同批次、产地药材的含量测定结果可知，广东产水翁
花药材中熊果酸含量存在一定的差异，海南产药材中上述
成分含量最高，云南产药材含量最低。提示水翁花可能受
种植地气候、土壤、地理环境等因素的影响，造成上述差异，
在后续的规范化种植及药材选用中，应谨慎选择产地，确保
药材质量。
综上所述，本实验建立 ＨＰＬＣ法测定水翁花中熊果酸
含量，方法准确、快速、高效，可较好地区分目标化合物与干
扰性物质。含量测定结果表明，不同批次、产地的水翁花中
所含化学成分存在较为显著的差异。本研究结果为今后水
翁花的质量标准建立及道地药材、栽培环境等方面研究提
供参考。
图２　不同批次水翁花药材色谱
参考文献：
［１］　胡晨霞．广东习用清热类药材的研究概况［Ｊ］．现代食品与药
品杂志，２００７，１７（５）：２５－２７．
［２］　陈 健，姜建国，郑艾初．水翁花挥发油提取工艺研究［Ｊ］．食品
科学，２００６，２７（１０）：４０９－４１１．
［３］　ＣＨＵＮ　ＬＩＮ　ＹＥ，ＹＡＮ　ＨＵＡ　ＬＵ，ＤＯＮＧ　ＺＨＩ　ＷＥＩ．Ｆｌａ－
ｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｌｅｉｓｔｏｃａｌｙｘ　ｏｐｅｒｃｕｌａｔｕｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２００４，６５（４）：４４５．
［４］　罗清，梅全喜，范文昌．水翁花的镇痛和抗内毒素研究［Ｊ］．中
华中医药学刊，２０１１，２９（７）：１５６９－１５７０．
［５］　程少璋，罗清，高玉桥．水翁花抗炎镇痛解热作用研究［Ｊ］．时
珍国医国药，２０１３，２４（２）：３７５－３７６．
［６］　叶春林，赖依峰，刘宣淦，等．水翁花黄酮ＤＭＣ诱导肝癌细胞
ＳＭＭＣ－７７２１凋亡的机制研究［Ｊ］．２０１４，３９（１５）：２９４２－２９４５．
［７］　罗清，梅全喜．广东省地产药材水翁花的研究概述［Ｊ］．亚太
传统医药，２００９，５（２）：１３０－１３２．
［８］　ＮＧＵＹＥＮ　ＴＨＩ　ＤＵＮＧ，ＪＵＮＧ　ＭＩＮ　ＫＩＭ，ＳＵＮ　ＣＨＵＬ
ＫＡＮＧ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｏｉｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｃｌｅｉｓ－
ｔｏｃａｌｙｘ　ｏｐｅｒｃｕｌａｔｕｓ（Ｒｏｘｂ．）［Ｊ］．Ｍｅｒｒ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　ｂｕｄｓ，２００８，
４６（１２）：３６３２－３６３９
［９］　梅全喜，范文昌，曾聪彦．论广东地产药材的研究与开发［Ｊ］．
今日药学，２００９，１９（２）：１４．
［１０］　ＣＨＵＮ　ＬＩＮ　ＹＥ，ＪＩＡＮ　ＷＥＮ　ＬＩＵ，ＤＯＮＧ　ＺＨＩ　ＷＥＩ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ
ｖｉｔｒｏ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－６－ｍｅｔｈｏｘｙ－３，５－
ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｈａｌｃｏｎｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｓｉｘ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ
ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，５０（１３）：５０５－５１０．
［１１］　广东省食品药品监督管理局．中药材标准（第一册）［Ｓ］．广
州：广东科技出版社，２００４：６２－６３．
（编辑：李岚春）
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