全 文 ：收稿日期:2009-12-02
绒毛鹿茸草多糖提取工艺优化及
多糖体外抗氧化研究
钟仙龙
(丽水学院化学与生命科学学院 ,浙江丽水 323000)
摘要　用正交试验法优选绒毛鹿茸草多糖的提取工艺及多糖体外抗氧化研究。在对温度 、时间 、料水比进
行单因素试验的基础上 , 通过正交试验确定了提取绒毛鹿茸草多糖的最佳工艺条件;通过清除羟基自由基
(· OH)和超氧阴离子自由基(O 2 -·)试验 ,及模拟胃液条件下清除 NO2 -试验 , 研究绒毛鹿茸草多糖体外抗氧
化活性。提取最佳工艺条件为:料水比 1∶20 , 在 100 ℃下浸提 3 h , 浸提 2 次;醇沉采用 3.5 倍体积 95%乙醇
3 h。绒毛鹿茸草多糖浓度在 0.4～ 2.0 mg/ mL 之间时 , 清除羟基自由基(· OH)呈增长趋势 , 当浓度达到 2.0
mg/ mL 时清除率达 45%;多糖浓度在 0.1 ～ 0.3 mg/ mL 之间时 , 清除超氧阴离子自由基(O2 -·)呈负增长趋
势 ,当浓度达到 0.3 mg/m L时清除率达-6.39%;多糖浓度在 1～ 5 mg/m L之间时清除 NO2 -呈增长趋势 ,当浓
度达到 5 mg/m L时清除 NO 2 -能力达到 14.3%。对绒毛鹿茸草多糖提取工艺进行研究 , 可知绒毛鹿茸草多糖
清除羟基自由基(· OH)活性较强 ,有一定清除 NO 2 -能力 , 能促进超氧阴离子(O 2 -·)形成。
关键词　绒毛鹿茸草;多糖;提取工艺;抗氧化
　　绒毛鹿茸草(Monochasma sheareri Max im.ex
Franch.et S avat.)为玄参科植物的全称 ,又名千年
霜 、牙痛草 、千重塔等 ,多年生草本 ,高 15 ～ 25 cm ,
主根木质化 ,茎多数 ,密集丛生 ,被绒毛 。茎下部叶
片呈鳞片覆瓦状 ,向上逐渐变大 ,无叶柄 ,先端锐尖 ,
被绒毛。花单生茎上部叶腋 ,呈总状花序。生于低
山多砂山地。主要分布浙江 、江苏 、安徽 、山东等地 ,
味苦性凉 ,用于咳嗽 、吐血 、赤痢 、带下 、牙龈炎 、乳腺
炎 、疖肿[ 1] 。绒毛鹿茸草多糖提取工艺的优化及抗
氧化研究在国内未见报道 ,在进行单因素试验基础
上 ,利用正交试验优化提取多糖条件 ,同时在体外对
绒毛鹿茸草多糖抗氧化进行研究 ,为绒毛鹿茸草的
开发利用提供依据。
1　材料与方法
1.1　材　料
(1)供试样品。绒毛鹿茸草于 2009年 4月采自
浙江丽水陈寮山 。
(2)主要仪器及试剂 。UV-1600PC 型紫外-可
见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);HHS 型
电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备
厂);BS210S 型电子天平(北京赛多利斯天平厂);
AL-9908S 型溶济过滤器(天津奥特赛恩斯仪器有
限公司);FZ102型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器
有限公司);50 ～ 1 000 μL 移液器(日本立洋);TDL-
40B 型离心机(上海安亭科学仪器厂);电热鼓风干
燥箱;数显 pH 计;索氏提取仪;3 , 5-二硝基水杨酸 、
水杨酸钠 、邻本三酚 、N-1-萘基乙二胺等试剂均为国
产分析纯 。
(3)材料预处理。经水洗后 ,80 ℃烘干粉碎 ,过
65目筛 ,在索氏提取仪中用乙醚脱脂至无色。
1.2　方　法
(1)绒毛鹿茸草多糖提取方法采用水浸提醇沉
法
1)单因素浸提温度的选择[ 2] 。在料水比为
1∶20 ,浸提时间为 3 h ,浸提 1次 ,选择温度分别为
70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃,比较多糖得率 ,确定适
合的浸提温度 。
·34· 试验研究 养殖与饲料 2010年第 3期
2)单因素浸提时间的选择 。在料水比为1∶20 ,
浸提 1次 ,温度为 100 ℃,选择时间分别为 1 h 、1.5
h 、2 h 、2.5 h 、3 h 、3.5 h ,比较多糖得率 ,确定适合的
浸提时间 。
3)单因素浸提料水比的选择。在温度为 100 ℃
时间为 2.5 h ,浸提 1次 ,选择料水比分别为 1∶10 、
1∶15 、1∶20 、1∶25 、1∶30 、1∶35 ,比较多糖得率 ,
确定适合的浸提料水比。
4)正交试验 。根据单因素试验得到的适合范
围 ,通过 L 9(33)正交试验 ,选择最佳浸提条件 。
5)浸提次数的确定 。根据正交试验结果 ,称取
2 g 绒毛鹿茸草加蒸馏水 40 mL ,100 ℃浸提 3 h ,加
95%乙醇 140 mL 醇沉 3 h ,第 2 ～ 4次加蒸馏水 20
mL ,根据多糖得率确定最佳浸提次数 。
6)醇沉时间的确定 。根据正交试验结果 ,分别
取1 g 样品加水 20 mL , 100 ℃浸提 3 h ,加入3.5倍
95%乙醇醇沉 2.5 h 、3 h 、3.5 h 、4 h 、4.5 h 、5 h ,比
较多糖得率 ,确定适合醇沉时间。
7)醇沉乙醇加入量的确定 。分别取 1 g 样品加
水 20 mL ,100 ℃浸提 3 h ,加入 95%乙醇 2.5倍 、3
倍 、3.5倍 、4倍 、4.5倍 、5倍 ,醇沉 3 h ,比较多糖得
率 ,确定适合的醇沉倍数 。
8)换算因素的确定[ 4] 。换算公式 f =W/CD ,
W-多糖重量(μg), C-多糖液中葡萄糖的浓度
(μg/mL),D-多糖的稀释因素 ,得 f=1.28 。
9)绒毛鹿茸草多糖含量的测定方法。采用
3 ,5-二硝基水杨酸比色法测定[ 3] 。利用 3 , 5-二硝基
水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的
氨基化合物 ,在一定范围内还原糖的量与棕红色物质
颜色深浅程度成一定比例关系 ,用紫外-可见分光光
度计测出吸光度(A),根据回归方程求出多糖含量。
回归方程为 y=0.653 3 x-0.041 8 , r2 =0.999 5。
1.3　绒毛鹿茸草多糖抗氧化试验
(1)绒毛鹿茸草多糖清除羟基自由基(· OH)
试验。采用水杨酸钠-Fe2+ - H2O 2法[ 5] 。FeSO 4
与 H 2O 2反应产生 ·OH ,以 ·OH 氧化水杨酸钠所
得产物的吸光值表示 ·OH 的多少 。试验设三个
组:样品组 、对照组 、本底组。样品组中含有 0.15
mol/L FeSO 4 , 2 mmol/L 水杨酸钠 , 6 mmol/ L
H 2O2以及 4 mL(0.1 mg/mL 、0.2 mg/mL 、0.3
mg/mL 、0.4 mg/mL 、0.5 mg/mL)多糖;对照组中
用蒸馏水代替多糖;本底组中以蒸馏水代替水杨酸
钠 ,最后加入 H 2O2启动反应 ,37 ℃水浴1 h ,用蒸馏
水调零。按下式计算 · OH 清除率。 E ={[ A 0 -
(A-A i)] /A 0}×100%, E 为清除率 , A 0为对照组
OD值 ,A 为样品组 OD值 , A i为本底组 OD值 。
(2)绒毛鹿茸草对超氧阴离子自由基(O 2 - ·)
试验。采用邻苯三酚自氧化法[ 5] 。邻本三酚在碱性
条件下能发生自氧反应 ,释放出 O 2 - · ,生成有色
中间产物 ,可用分光光度计来测定 。取 0.05 mol/L
T ris-HCl缓冲液(pH =8.2)8.4 mL , 分别加入
0.3 mL多糖(0.1 mg/mL 、0.15 mg/mL 、0.20
mg/mL 、0.25 mg/mL 、0.30 mg/mL)置于 25 ℃水
浴中预热 10min ,再加入 0.3 mL 60 mmol/L 邻本
三酚溶液 ,混匀于 25 ℃水浴中反应 3min ,加入 5%
抗坏血酸 50 μL 终止反应 ,在 420 nm 处测吸光度
值。空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。调
零管用 10 mmo l/L HCl代替邻本三酚 。计算公式:
E=(A 0 -A i)/A 0 ×100%,E为清除率 , A0为对照
组 OD值 ,A i为试样组 OD值。
(3)绒毛鹿茸草模拟胃液条件下清除 NO 2 -实
验。采用盐酸萘乙二胺比色法[ 6-7] 亚硝酸根在弱酸
条件下与对氨基苯黄酸重氮化后 ,再与 N-1-萘基乙
二胺偶合形成紫红色染料 ,在 550 nm 处测 OD值 。
准确吸取 1 mg/mL 多糖 1 mL 、2 mL 、3 mL 、4 mL 、
5 mL 分别置于比色管中 ,各加入 10 μg/mL 亚硝酸
钠2 mL 、氯化铵缓冲液4.5 mL 、2.5 mL 60%醋酸 ,
对照管不加多糖 ,调零管不加亚硝酸钠及多糖 ,本底
管不加亚硝酸钠 ,加水至 15 mL ,在暗处用 37 ℃水
浴 1 h 。置暗处到室温 ,各管加入 0.4%对氨基苯磺
酸2 mL ,静置3 ～ 5 min后各加入 1 mL N-1-萘基乙
二胺溶液 ,加水至 25 mL ,混匀 ,暗处静置 15 min ,
550 nm处以零管调零 ,测各管吸光度 。E={[ A 0 -
(A-A i)] /A 0}×100%, E 为清除率 , A 0为对照组
OD值 ,A 为样品组 OD值 , A i为本底组 OD值 。
2　结果与分析
2.1　绒毛鹿茸草多糖提取工艺研究
(1)不同浸提温度对绒毛鹿茸草多糖提取率的
影响 。根据表 1可知 ,浸提温度对多糖提取率影响
明显 ,100 ℃达到 2.91%。
表 1　浸提温度对绒毛鹿茸草多糖提取率的影响
温度/ ℃ 70 80 90 100
提取率/ % 1.07 1.51 2.05 2.91
·35·养殖与饲料 2010年第 3期 试验研究
　　(2)不同浸提时间对绒毛鹿茸草多糖提取率的
影响 。由表 2可知 ,随着浸提时间增加 ,多糖提取率
也在增加 ,3.5 h时增加减缓 ,正交试验采用 2.0 h 、
2.5 h 、3.0 h 。
表 2　不同浸提时间对绒毛鹿茸草多糖提取率的影响
时间/ h 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
提取率/ % 2.15 2.41 2.48 2.67 2.91 2.99
　　(3)不同料水比对绒毛鹿茸草多糖提取率的影
响。由表 3可知料水比为 1∶15时 ,多糖提取率为
2.92%。
表 3　不同料水比对绒毛鹿茸草多糖提取率的影响
料水比 1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30 1∶35
提取率/ % 2.45 2.92 2.74 2.70 2.69 2.65
2.2　正交试验结果与分析
(1)根据以上单因素试验结果 ,确定因素水平表
(见表 4)。
表 4　因素水平表
水平 因素
A 温度/ ℃ B时间/ h C料水比/(g·mL -1)
1 80 2.0 1∶15
2 90 2.5 1∶20
3 100 3.0 1∶25
　　(2)正交试验结果见表 5。
表 5　正交试验结果
序号 A 温度/ ℃ B时间/ h C料水比/(g·mL-1) 多糖提取率/%
1 80 2.0 1∶15 1.62
2 80 2.5 1∶20 1.49
3 80 3.0 1∶25 1.75
4 90 2.0 1∶20 2.19
5 90 2.5 1∶25 1.65
6 90 3.0 1∶15 1.95
7 100 2.0 1∶25 2.80
8 100 2.5 1∶15 2.77
9 100 3.0 1∶20 3.04
K 1′ 1.56 2.20 2.11 -
K 2′ 1.93 1.97 2.24 -
K 3′ 2.87 2.45 2.07 -
R 1.22 0.48 0.13 A>B>C
表 6　正交试验方差分析表
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 P值
A 温度/ ℃ 2 2.391 2 1.195 6 55.782 3＊ 0.017 6
B时间/ h 2 0.132 9 0.066 4 3.099 5 0.243 9
C料水比/
(g·mL-1) 2 0.048 3 0.024 1 1.126 0.470 4
误差 2 0.042 9 0.021 4 - -
总和 8 2.615 2 - - -
表 7　温度各水平间差异显著性 LS R 检验 %
处理 均值 5%显著水平 1%极显著水平
3 2.87 a A
2 1.93 b AB
1 1.67 b B
　　(3)浸提次数的确定 。第一次称取 2 g 绒毛鹿
茸草加蒸馏水 40 mL , 100 ℃浸提 3 h ,加 95%乙醇
70 mL 醇沉 3 h ,第 2 ～ 4次加蒸馏水 20 mL ,方法同
第一次。结果见表 8。
表 8　浸提次数的确定 %
项目 提取次数
1 2 3 4
单次得 2.87 0.93 0.47 0.45
总得率 2.87 3.80 4.27 4.72
　　(4)醇沉时间的确定 。醇沉结果 2.5 h 、3 h 、
3.5 h 、4 h 、4.5 h 、5 h ,绒毛鹿茸草提取率分别为
2.58%、2.77%、2.63%、2.63%、2.61%、2.61%。
随着醇沉时间延长 ,多糖被乙醇溶解 ,提取率逐渐下
降。
(5)醇沉时乙醇加入量的确定 。结果加入 95%
乙醇 2.5倍 、3倍 、3.5倍 、4倍 、4.5倍 、5倍 ,绒毛鹿
茸草提取率分别为 1.54%、2.22%、2.72%、
2.61%、2.57%、2.23%。由此可见 ,醇沉时加入3.5
倍 95%乙醇 ,多糖提取率最高 。随着乙醇浓度的增
大 ,多糖被乙醇溶解 ,提取率逐渐下降。
(6)绒毛鹿茸草多糖清除羟基自由基(· OH)
试验结果 。清除羟基自由基(·OH)能力随着多糖
浓度的增大而增强 ,当浓度达到2.0 mg/mL 时清除
能力达到 45%。试验结果见表 9。
表 9　多糖提取物清除羟基自由基(· OH)试验结果
多糖浓度/(mg·mL-1) 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
清除率/% 15.07 32.19 37.44 42.00 45.00
　　(7)绒毛鹿茸草多糖清除超氧阴离子自由基
(O 2 -·)试验结果。绒毛鹿茸草多糖清除超氧阴
离子(O2 -·)的能力随着多糖浓度的增大而降低 ,
多糖促进超氧阴离子自由基(O 2 -·)形成 。结果见
表 10。
表 10　多糖提取物氧化超氧阴离子
自由基(O2 -·)试验结果
多糖浓度/
(mg·mL -1) 0.1 0.15 0.20 0.25 0.30
清除率/ % -5.29 -5.73 -5.95 -6.21 -6.39
·36· 试验研究 养殖与饲料 2010年第 3期
　　(8)绒毛鹿茸草模拟胃液条件下清除 NO 2 -试
验结果 。绒毛鹿茸草多糖清除 NO 2 -能力随着多糖
浓度增大而增强 ,当浓度达到 5 mg/mL 时清除能力
达到 14.3%。结果见表 11。
表 11　模拟胃液条件下清除 NO 2-试验结果
多糖浓度/(mg·mL -1) 1 2 3 4 5
清除率/ % 3.90 5.72 6.50 9.23 14.3
3　小　结
(1)绒毛鹿茸草浸提多糖最佳条件:料水比为
1∶20 ,100 ℃浸提 3 h 。95%乙醇 3.5倍醇沉 3 h 。
(2)对于多糖的提取偏酸或偏碱都能提高多糖
的提取率 ,但对酸碱控制较难 ,所以采用传统蒸馏水
浸提法 ,工业上从经济方面考虑 ,可采用 100 ℃浸提
3 h ,料水比 1∶20 ,第 2次用水量为第 1次的一半 ,
浸提 2次 ,多糖提取率达到 80.5%。
(3)绒毛鹿茸草多糖清除羟基自由基(· OH)
活性较强 。羟基自由基(·OH)是代谢过程中产
生的非常活泼的自由基 ,毒性很大 ,能够造成蛋白
质 、核酸 、脂类等生物大分子的损伤 ,从而导致体内
代谢紊乱 ,引起许多病理变化[ 8] ;绒毛鹿茸草多糖能
促进超氧阴离子(O 2 - ·)形成 ,超氧阴离子自由基
具有重要的生物功能 ,它是基态氧接受一个电子后
形成的第一个氧自由基 ,可以经过一系列反应生成
其它的氧自由基[ 9] ;有一定清除 NO 2 -的能力 ,亚硝
酸盐(NO 2 -)是亚硝胺的前体物 ,亚硝胺是人和动
物的强致癌物 ,通过消除体内的 NO 2 - ,可以明显减
少患癌的比率[ 10] 。但其多糖提取物都为混合物 ,其
进一步的分离纯化和探讨多糖抗氧化作用的机制仍
需要深入进行 ,为今后绒毛鹿茸草的综合开发利用
提供理论依据 。
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(责任编辑:翁　丽)
·37·养殖与饲料 2010年第 3期 试验研究